KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Ś

rodowiska

HODOWLE OKRESOWE

DROBNOUSTROJÓW

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

1

l. Wst

ę

p teoretyczny.

Wzrost drobnoustrojów to przyrost ich obj

ę

to

ś

ci, masy, a tak

ż

e podział komórek. Jest on

uwarunkowany syntez

ą

materiału komórkowego (białka, kwasy nukleinowe, nukleotydy),

tworzeniem nowych organelli komórkowych a tak

ż

e dobudowywaniem nowych struktur do ju

ż

istniej

ą

cych (

ś

ciana komórkowa, błona cytoplazmatyczna). Tempo wzrostu drobnoustrojów jest

uzale

ż

nione od składu podło

ż

a hodowlanego oraz od odczynników fizykochemicznych, takich

jak temperatura, pH, potencjał redox. Maksymalny wzrost mo

ż

na osi

ą

gn

ąć

tylko wówczas, gdy

składniki podło

ż

a znajduj

ą

si

ę

w wystarczaj

ą

cych ilo

ś

ciach, gdy nie zachodzi limitowanie

wzrostu przez który

ś

ze składników oraz gdy zapewnione s

ą

optymalne warunki pH, temperatury

itp. Mówimy wtedy o warunkach wzrostu ,,nieograniczonego”. W hodowli periodycznej
(okresowej) warunki takie maj

ą

miejsce tylko w pocz

ą

tkowym okresie wzrostu. W nast

ę

pnych

okresach nast

ę

puje zmniejszenie st

ęż

enia składników od

ż

ywczych oraz nagromadzenie

produktów metabolizmu tj. kwasów organicznych czy alkoholi, co wpływa na wzrost
drobnoustrojów.

W warunkach hodowli okresowej, gdzie tylko w pocz

ą

tkowym okresie ma miejsce wzrost

nieograniczony, wyró

ż

ni

ć

mo

ż

emy charakterystyczne fazy wzrostu: faz

ę

przygotowawcz

ą

(lag-

faza), faz

ę

logarytmicznego wzrostu (log-faza), faz

ę

stacjonarn

ą

(równowagi) i faz

ę

zamierania

hodowli.

W warunkach wzrostu nieograniczonego, a wi

ę

c w pierwszej fazie hodowli okresowej,

drobnoustroje dziel

ą

si

ę

z jednakow

ą

szybko

ś

ci

ą

. Liczba ich wzrasta zgodnie z post

ę

pem

geometrycznym: 2

0

, 2

1

, 2

2

, 2

3

.. 2

n

. Je

ś

li w jednostce obj

ę

to

ś

ci hodowli na pocz

ą

tku znajdowało

si

ę

N

0

komórek, to po n podziałach b

ę

dzie ich:

N = N

0

×

2

n

gdzie:
N

0

= ilo

ść

pocz

ą

tkowa komórek (j.t.k) w godzinie t = 0 (t

0

)

N = ilo

ść

komórek (j.t.k) po czasie t

1

, h

Logarytmuj

ą

c to równanie otrzymamy:

Log N = log N

0

+ n log 2

Wyliczaj

ą

c z tego równania liczb

ę

podziałów n, otrzymujemy:

n =

log N – log N

0

log 2

Wprowadzaj

ą

c poj

ę

cie cz

ę

sto

ś

ci podziałów v, czyli liczb

ę

podziałów komórek w ci

ą

gu czasu t,

mo

ż

emy zapisa

ć

,

ż

e:

v =

n

=

log N – log N

0

t

log 2 (t – t

0

)

gdzie:
t

0

- czas w godzinie t = 0, h

t

1

– czas kolejnego pomiaru, h

Czas niezb

ę

dny dla podziału komórki nazywamy wiekiem osobniczym g.

g =

t

=

1

n

v

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Ś

rodowiska

HODOWLE OKRESOWE

DROBNOUSTROJÓW

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

2

2. Wykonanie.

2A. HODOWLA OKRESOWA

Celem

ć

wiczenia jest sprawdzenie szybko

ś

ci rozkładu 2-metylofenolu (2-MF)

w ró

ż

nych układach hodowlanych przez szczep Acinetobacter sp. w po

ż

ywce mineralnej

(g/l: Na

2

HPO

4

×

12H

2

O, 4; KH

2

PO

4,

0,5; NH

4

Cl, 0,5; MgSO

4

×

7H

2

O, 0,1; ekstrakt dro

ż

d

ż

owy 0,1)

z dodatkiem TMS (ang. Trace Mineral Solution) o składzie: FeSO

4

×

7H

2

O 3,82 g;

CoSO

4

×

7H

2

O 295 mg; MnSO

4

×

H

2

O 82 mg; ZnSO

4

×

7H

2

O 141 mg; H

3

BO

3

6 mg;

Na

2

MoO

4

×

2H

2

O 40 mg; NiSO

4

×

7H

2

O 82 mg; CuSO

4

×

5H

2

O 2,9 mg;

Al

2

(SO

4

)

3

×

18H

2

O 148 mg; Na

2

WO

4

×

2H

2

O 6 mg.

W tym celu nale

ż

y zało

ż

y

ć

4 układy hodowlane o obj

ę

to

ś

ci 300 ml, zgodnie z Tabel

ą

I

po jej uprzednim uzupełnieniu:

Tabela I

T,

°

C

St

ęż

enie

2-MF,

mM

Obj

ę

to

ść

80 mM r-ru

2-MF, ml

Obj

ę

to

ść

TMS,

ml

Obj

ę

to

ść

po

ż

ywki

mineralnej,

ml

Obj

ę

to

ść

hodowli

szczepu, ml

Obj

ę

to

ść

po

ż

ywki

mineralnej u

ż

yta do

uzupełnienia obj

ę

to

ś

ci

hodowli do 300 ml

30

2,0

0,3

200

1,0

0,3

200

……

2,0

0,3

200

1,0

0,3

200

1. W ka

ż

dej kolbie okre

ś

li

ć

:

a. g

ę

sto

ść

hodowli poprzez pomiar absorbancji przy

λ

= 600 nm

b. st

ęż

enie biomasy metod

ą

filtracji

c. wyj

ś

ciowe st

ęż

enie 2-metylofenolu poprzez pomiar metod

ą

z p-nitroanilin

ą

.

2. Wyniki umie

ś

ci

ć

w Tabeli I.

3. Kolby umie

ś

ci

ć

na wytrz

ą

sarce w temperaturze pokojowej (zmierzy

ć

temperatur

ę

)

lub w 30°C.

4. W odst

ę

pach 45-minutowych okre

ś

la

ć

:

a. g

ę

sto

ść

hodowli poprzez pomiar absorbancji przy

λ

= 600 nm

b. st

ęż

enie 2-MP poprzez oznaczanie metod

ą

z p-nitroanilin

ą

.

5. Wyniki umieszcza

ć

na bie

żą

co w Tabeli I.

6. Na zako

ń

czenie prowadzenia hodowli oznaczy

ć

st

ęż

enie biomasy metod

ą

filtracji

UWAGA! Zachowa

ć

sterylne warunki w trakcie pracy!!!

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Ś

rodowiska

HODOWLE OKRESOWE

DROBNOUSTROJÓW

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

3

METODYKA OZNACZE

Ń

Oznaczanie st

ęż

enia 2-metylofenolu metod

ą

kolorymetryczn

ą

z p-nitroanilin

ą

1. Pobra

ć

sterylnie 1 ml hodowli i umie

ś

ci

ć

w probówce typu Eppendorf. Zawarto

ść

probówki

wirowa

ć

przez 5 min przy 12000 rpm w temperaturze 4

°

C.

2. Do szklanej probówki miarowej wprowadzi

ć

0,5 ml odwirowanej hodowli (supernatant) albo

jej odpowiednie rozcie

ń

czenie, tj. na przykład rozcie

ń

czenie 10-krotne uzyskuje si

ę

poprzez

pobranie 50

µ

l supernatantu i 450

µ

l wody destylowanej.

3. Doda

ć

2 ml wody destylowanej.

4. Wprowadzi

ć

0,5 ml zdwuazowanej p-nitroaniliny (otrzymanej poprzez odbarwienie roztworu

p-nitroaniliny o barwie

ż

ółtej z u

ż

yciem 2% NaNO

2

) – przygotowywa

ć

zawsze na

ś

wie

ż

o!!!

5. Doda

ć

0,25 ml 10% Na

2

CO

3

.

6. Wprowadzi

ć

0,5 ml 10% NaOH.

7. Uzupełni

ć

probówk

ę

do obj

ę

to

ś

ci 5 ml poprzez wprowadzenie 1,25 ml wody destylowanej.

8. Jednocze

ś

nie przygotowa

ć

prób

ę

ś

lep

ą

w identyczny sposób, zast

ę

puj

ą

c supernatant

odwirowanej hodowli, wod

ą

destylowan

ą

.

9. Po wymieszaniu zmierzy

ć

absorbancj

ę

przy

λ

= 550 nm wzgl

ę

dem próby

ś

lepej.

10. Do przelicze

ń

st

ęż

e

ń

2-MF stosowa

ć

równanie krzywej kalibracyjnej A = b * c

fenolu

, gdzie A to

absorbancja przy

λ

= 550 nm, c

2-MF

to st

ęż

enie 2-metylofenolu w mM, b = współczynnik

kierunkowy krzywej kalibracyjnej.

Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przy

λλλλ

= 600 nm

Pobra

ć

sterylnie po 1 ml hodowli z ka

ż

dego układu i zmierzy

ć

absorbancj

ę

przy długo

ś

ci

fali

λ

= 600 nm z u

ż

yciem spektrofotometru HELIOS wobec próby

ś

lepej, któr

ą

stanowi woda

destylowana.

Oznaczanie st

ęż

enia biomasy metod

ą

filtracji

Przes

ą

czy

ć

20 ml zawiesiny drobnoustrojów przez uprzednio wysuszony do stałej masy

(s.m.) i zwa

ż

ony filtr membranowy Co-5. Stosowa

ć

urz

ą

dzenie do filtracji pró

ż

niowej.

Filtr z osadem suszy

ć

w temp. 105°C do stałej masy przez 1 godzin

ę

i ponownie zwa

ż

y

ć

.

St

ęż

enie biomasy w g/ml obliczy

ć

ze wzoru:

X= (a-b) / V

gdzie:

a - masa filtra z osadem, g
b - masa filtra, g
V - obj

ę

to

ść

próbki u

ż

ytej do oznaczenia, ml

X - st

ęż

enie biomasy, g/ml

Wyniki umie

ś

ci

ć

w tabeli III.

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Ś

rodowiska

HODOWLE OKRESOWE

DROBNOUSTROJÓW

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

4

Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej do oznaczania st

ęż

enia 2-metylofenolu

Krzyw

ą

kalibracyjn

ą

do oznaczania st

ęż

enia 2-metylofenolu wykona

ć

zgodnie z instrukcj

ą

do oznaczania st

ęż

enia 2-MF metod

ą

kolorymetryczn

ą

z p-nitroanilin

ą

oraz tabel

ą

II. Wyniki

pomiaru absorbancji przy

λ

= 550 nm umie

ś

ci

ć

w tabeli. Na podstawie uzyskanych wyników

wyznaczy

ć

współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej.

Tabela II

L.p.

St

ęż

enie

2-MF,

mM

V

5 mM 2

MP,

ml

Woda,

ml

p-nitroanilina

zdwuazowana,

ml

10%

Na

2

CO

3

,

ml

10%

NaOH,

ml

Woda,

ml

Absorbancja,

λ

= 550 nm

1

0,0

0,00

2,50

0,5

0,25

0,5

1,25

2

0,1

0,01

2,49

0,5

0,25

0,5

1,25

3

0,2

0,02

2,48

0,5

0,25

0,5

1,25

4

0,3

0,03

2,47

0,5

0,25

0,5

1,25

5

0,4

0,04

2,46

0,5

0,25

0,5

1,25

6

0,5

0,05

2,45

0,5

0,25

0,5

1,25

7

0,6

0,06

2,44

0,5

0,25

0,5

1,25

8

0,7

0,07

2,43

0,5

0,25

0,5

1,25

9

0,8

0,08

2,42

0,5

0,25

0,5

1,25

10

0,9

0,09

2,41

0,5

0,25

0,5

1,25

11

1,0

0,10

2,4

0,5

0,25

0,5

1,25

Równanie krzywej: ……………………………………………………………………………………….

Tabela III

Hodowla

obj

ę

to

ść

przes

ą

czu,

ml

nr

s

ą

czka

masa

s

ą

czka, g

masa s

ą

czka

z bakteriami, g

masa

bakterii, g

st

ęż

enie

biomasy,

g/ml

30

2,0

1,0

……

2,0

1,0

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Ś

rodowiska

HODOWLE OKRESOWE

DROBNOUSTROJÓW

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

5

WYTYCZNE DO PRZYGOTOWANIA SPRAWOZDANIA

Z

Ć

WICZE

Ń

„HODOWLE CI

Ą

GŁE I PERIODYCZNE”

Sprawozdanie przygotowa

ć

nale

ż

y w postaci prezentacji PowerPoint, nie przekraczaj

ą

cej

35 slajdów.

1. Slajd tytułowy: tytuł

ć

wiczenia, nazwiska i imiona, numery indeksów sprawozdaj

ą

cych, grupa

ć

wiczeniowa.

2. Cele

ć

wiczenia.

3. Metodyka pracy i teoretyczne podstawy oznacze

ń

(z uwzgl

ę

dnieniem krzywej kalibracyjnej

dla kolorymetrycznego oznaczania st

ęż

enia substratu aromatycznego).

4. Wyniki nale

ż

y przedstawi

ć

w postaci tabel oraz wykresów. Wykresy powinny mie

ć

opisane

osie, legend

ę

oraz odpowiedni

ą

skal

ę

!!! Nale

ż

y skomentowa

ć

otrzymane wyniki

i zaproponowa

ć

wnioski adekwatnie do celów

ć

wiczenia.

5. Hodowla okresowa:



Tabele prezentuj

ą

ce cało

ść

wyników, warto

ś

ci

ś

rednie i odchylenia standardowe

g

ę

sto

ś

ci hodowli i st

ęż

enia substratu aromatycznego w czasie;



Wykresy zmian g

ę

sto

ś

ci hodowli i substratu aromatycznego w czasie dla warto

ś

ci

u

ś

rednionych dla badanych układów – w tym celu nale

ż

y wymieni

ć

si

ę

wynikami z co

najmniej dwoma innymi grupami badawczymi



Zestawienie na jednym wykresie przyrostów g

ę

sto

ś

ci hodowli w ka

ż

dym z badanych

układów (w obecno

ś

ci ró

ż

nych st

ęż

e

ń

substratu aromatycznego w danej temperaturze

oraz w obecno

ś

ci tego samego st

ęż

enia substratu w ró

ż

nych temperaturach);



Porównanie czasu trwania poszczególnych faz wzrostu hodowli w badanych

układach;



Zestawienie na jednym wykresie zmian st

ęż

enia substratu aromatycznego w ka

ż

dym

z badanych układów (rozkład ró

ż

nych st

ęż

e

ń

substratu aromatycznego w okre

ś

lonej

temperaturze oraz degradacja tego samego st

ęż

enia substratu aromatycznego w

ró

ż

nych temperaturach);



Wyznaczenie szybko

ś

ci rozkładu substratu aromatycznego w ró

ż

nych temperaturach;

8. Przedstawienie oblicze

ń

i wyników zadania teoretycznego „Wyznaczanie wzrostu bakterii

metod

ą

płytkow

ą

”.

9. Przedstawienie oblicze

ń

i wyników zadania teoretycznego „Zakładanie hodowli ci

ą

głej

mikroorganizmów”.

10. Samoocena

grupy

i samoocena poszczególnych studentów

w postaci tabeli

z UZASADNIENIEM tej oceny.

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Ś

rodowiska

HODOWLE OKRESOWE

DROBNOUSTROJÓW

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

6

Tabela I

Temperatura: ……..

°°°°

C

Temperatura: ……..

°°°°

C

……………………..mM

……………………..mM

……………………..mM

……………………..mM

Pomiar

Czas,
00:00

Rozc.

A

600

A

550

C, mM

A

600

A

550

C, mM

A

600

A

550

C, mM

A

600

A

550

C, mM

0

:

1

:

2

:

3

:

4

:

5

:

6

:

7

:

8

: