Krawczyk Aneta

Kocur Justyna

Przybyłowska Marta

Tracz Anna

Diagnostyka i chemioterapia

zakażeń wirusowych

DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ WIRUSOWYCH

Podstawową metodą diagnostyczną zakażeń wirusowych jest izolacja i

identyfikacja wirusa. Jest to metoda referencyjna dla wszystkich innych metod

diagnostycznych. Inną grupę metod stanowią te, które umożliwiają wykazanie

antygenów wirusowych w płynach ustrojowych, tkankach lub wydalinach i
wydzielinach.

W niektórych zakażeniach wirusowych poza metodami bezpośrednimi

mają zastosowanie metody pośrednie, wykazujące obecność przeciwciał

przeciwwirusowych u chorych. Diagnostyka serologiczna niektórych zakażeń

wirusowych może być tylko jedyną dostępną metodą w wielu laboratoriach
klinicznych.

Grupa wirusów

Wykrycie antygenu

Izolacja wirusa

(hodowla)

Serologia

Adenowirusy

+

++

++ (2 surowice)

Enterowirusy

-

++

-

virus Epsteina-Barr

+

++

++

Paramykowirusy

+

++

++

Rotawirusy

++

-

-

Rabies

++*

++*

++*

Togawirusy

-

+

++

RSV

++

++

++

HBV

++

-

++

CMV

-

+

++

++ metody podstawowe + rzadko stosowane
++* tylko w referencyjnych laboratoriach - nie stosowano

METODY IZOLACJI I IDENTYFIKACJI WIRUSÓW

Techniki zmierzające do izolacji i identyfikacji wirusów są stosowane w

laboratoriach referencyjnych. Ogólne zasady sprowadzają się do pobrania

materiału od chorego, jego transportu, a następnie wyboru odpowiedniej

techniki dla wzrostu (namnożenia) wirusa, obserwacji zmian w hodowli i
dokonania identyfikacji wirusa.

Próbki materiałów pobierane od chorych

Materiałami do badań mogą być: krew, płyn mózgowo-rdzeniowy,

wydzieliny układu oddechowego (plwocina, popłuczyny z nosa lub oskrzeli,

wymaz z gardła, materiał pobrany w czasie bronchoskopii, aspirat z nakłucia

przeztchawiczego), mocz, kał lub wymaz z odbytu, materiał ze zmian skórnych

(ropa, zeskrobiny, płyn pęcherzykowy, itp.).

Materiał powinien być uzyskany z miejsca, gdzie obserwowany jest

proces chorobo

wy. Należy pamiętać jednak o tym, że większość wirusów wnika

do organizmu przez drogi oddechowe lub przewód pokarmowy, gdzie wstępnie

się namnażają, a podstawowe objawy kliniczne występują w narządach dalej

położonych. W takich przypadkach właściwe jest pobieranie próbek materiałów

z kilku miejsc, niezależnie od miejsca chorobowego. Jest to użyteczne, kiedy

trudno jest uzyskać próbkę z narządu wewnętrznego lub gdy wirus jest trudny

do izolacji z docelowego narządu.

Próbki świeże powinny natychmiast być wykorzystywane do posiewów,

mogą być przechowywane w lodówce w stanie zamrożenia (-70°C). Przy

dłuższym transporcie zaleca się stosowanie podłoży transportowych, często z

dodatkiem antybiotyków w celu zahamowania wzrostu bakterii oraz przesyłanie
w termostatach (+ 4°C).

Techniki izolacji wirusów

Wirusy namnażają się

wyłącznie w żywych wrażliwych
komórkach. W warunkach
laboratoryjnych izolacja wirusa

jest

możliwa

dzięki

zastosowaniu

zwierząt

laboratoryjnych, zarodków
kurzych oraz tzw. hodowli
tkankowych lub komórkowych
prowadzonych w warunkach
sztucznych in vitro

. Używane są

hodowle pierwotne, linie
komórkowe diploidalne oraz
ustalone linie komórkowe –
heteroploidalne.

Typ hodowli

Charakterystyka

Przykłady

Podstawowe

wykorzystanie

Pierwotna

diploid, komórki

mieszanych typów, 1

lub 2 pasaże

pierwotna

nerki małpiej

Influenza,

Parainfluenza,

niektóre enterowi

rusy

Linie komórkowe

diploid, fibroblasty,

ograniczona liczba

pasaży (<50-70)

ludzkie, diploidalne

fibroblasty (WI-38,

MRC-5, HEL)

HSV, CMV, VZV,

Rhinovirus

Ustalone (ciągłe)

linie komórkowe

heteroploid, ciągłe

pasaże in vitro

HeLa, Hep-2

RSV, Adenovirus

Do hodowli ciągłej (ustalonej) używa się tkanek nowotworowych

pasażowanych przez wiele lat. Często używa się tkanek:
- HeLa – z nowotw

oru nabłonkowego szyjki macicy

- KB –

z nowotworu nabłonkowego jamy ustnej i języka

- FL –

tkanka ludzka z błony owodniowej

Linie komórkowe do izolacji wirusów stanowią najczęściej fibroblasty

mysie (L) lub fibroblasty ludzkie (WI-38, MRC-

5, HEL); są to tkanki

prawidłowe.

Wybór odpowiedniego typu hodowli tkankowej lub komórkowej zależy

od powinowactwa wirusa do
takich komórek. W celu izolacji

wirusa HIV stosowane są
specjalne hodowle limfocytów T
CD4 pochodzenia ludzkiego.

Wyizolowanie wirusa

polega na pobraniu

odpowiedniego

materiału

i

wstrzyknięciu

wrażliwemu

zwierzęciu lub zakażeniu zarodka

kurzego, czy też hodowli

tkankowej.

W

zakażonych

narządach lub tkankach po określonym czasie obserwuje się zmiany - efekty
cytopatyczne (CPE).

Liczne wirusy zawie

rają na powierzchni składniki, które mają zdolność

aglutynowania krwinek czerwonych różnych gatunków zwierząt i/lub

człowieka. Zjawisko to jest nazywane hemaglutynacją czynną (HA). Niektóre

wirusy adsorbują się tylko na powierzchni krwinek czerwonych, nie powodując
ich aglutynacji –

zjawisko to nazywane jest hemadsorpcją (HAd). Zjawiska HA

i HAd mogą występować z różnymi krwinkami i w różnych temperaturach

inkubacji. Służą one do dalszej lub jedynej (np. wirus grypy) identyfikacji
wirusów. Dla ostatecznej

identyfikacji wirusów stosuje się swoiste grupowo lub

typowo surowice odpornościowe.

Wykorzystywane są odczyny serologiczne:

1.

Odczyn neutralizujący wirusa.

2.

Odczyn wiązania dopełniacza (grupowe antygeny ortomyksowirusów).

3. Odczyn zahamowania hemaglutynacji czynnej – polega na dodaniu

surowicy odpornościowej do hodowli wirusów, które w ten sposób
związane zostają ze swoistymi przeciwciałami i pozbawione wolnych
receptorów biorących udział w połączeniu z krwinką, co w konsekwencji
daje zahamowanie hemaglutynac

ji; np. określane typów serologicznych

wirusa grypy.

4. Odczyn zahamowania hemadsorpcji –

wykorzystuje się hodowlę

kontrolną i zakażoną wirusami. Na powierzchni komórek zakażonych
wirusami adsorbują się krwinki czerwone, Dodanie surowicy
odpornościowej hamuje to zjawisko; zastosowanie w identyfikacji
myksowirusów.

5.

Immunofluorescencja bezpośrednia dla wielu wirusów jest ostatnio

końcowym etapem identyfikacji.

Do identyfikacji wirusów wykorzystywane jest również mikroskop

elektronowy. Swoiste antygeny w hodowli

coraz częściej są identyfikowane za

pomocą przeciwciał monoklonalnych w testach immunofluorescencji i
immunoenzymatycznych oraz neutralizacji wirusa. Coraz szersze wykorzystanie

ma również hybrydyzacja in situ.

BEZPOŚREDNIE WYKAZANIE WIRUSÓW W PRÓBKACH

MATERIAŁÓW

Mikroskop świetlny:

1.

Preparat

bezpośredni

barwiony

barwnikami

do

barwienia

histopatologicznego –

wykazanie obecności ciałek wtrętowych i/lub

komórek olbrzymich

2.

Preparat bezpośredni barwiony metodą immunoperoksydazową (PAP) –

metody immunohistochemiczne

3.

Mikroskopowa faza stała EIA

Mikroskop luminescencyjny:

1.

Technika immunofluorescencji bezpośredniej ze znakowanymi FITC

surowicami odpornościowymi

2.

Techniki immunofluorescencyjne w różnych odmianach (mikroskopowa

faza stała)

Mikroskop elektronowy:

1. Wy

kazanie cząstek wirusa w próbkach kału (Rotavirus, Norwalk,

adenowirusy jelitowe, HAV)

Metody immunologiczne do wykazania antygenów wirusowych:

1.

Różne odmiany metod immunoenzymatycznych (EIA, ELISA, dot-

ELISA) z przeciwciałami monoklonalnymi (np. RSV, Influenzavirus A,
B, Parainfluenza 1-3, HSV, VZV, CMV, Rotavirus)

2. Aglutynacja lateksowa (Rotavirus)

3.

Immunoelektroforeza przeciwprądowa (CIE) (Rotavirus)

4. Western blot (HIV)

Techniki molekularne:

1. Hybrydyzacja in situ

w skrawkach tkanek lub w teście probówkowym:

Adenovirus, CMV, HSV, HPV – sondy genetyczne znakowane
radioaktywnie

2. Hybrydyzacja in situ – sondy nieradioaktywne

a) sondy biotynylowane: handlowe odczynniki Enzo dla wirusów: HSV

1/2, CMV, HBV, HPV-1, EBV, HAV, JC, BK, SV-40, Adenovirus typ
5

b) sondy oligonukle

otydowe znakowane bezpośrednio za pomocą

fosfatazy alkalicznej dla: HSV-1, HSV-2, HSV1/2, HBV-sAg i HBV-
cAg

c) sondy molekularne znakowane chemiluminescencyjnie – gotowe

zestawy handlowe

3. Metody PCR

DIAGNOSTYKA SEROLOGICZNA ZAKAŻEŃ WIRUSOWYCH

W diagnostyce chorób wirusowych wykorzystywana jest rutynowo

diagnostyka serologiczna. Najczęściej wykonywane są testy umożliwiające

wykrycie obecności swoistych przeciwciał wobec określonych antygenów
wirusowych.

Stosuje się również testy wykrywające obecność rozpuszczalnych

antygenów wirusowych krążących we krwi.

Przeciwciała i antygeny wykrywane w surowicy nazywane są znacznikami

określonego zakażenia wirusowego. Potwierdzenie istniejącego czynnego

zakażenia wirusowego ma miejsce wówczas, gdy wykazywany jest antygen lub

swoiste przeciwciała IgM albo obserwowana jest serokonwersja ( wzrost 4-
krotny w kolejnym badaniu )

dla przeciwciał klasy IgG.

Przejściowe występowanie swoistych przeciwciał klasy IgM u noworodków

lub niemowląt wskazuje na zakażenie wrodzone lub okołoporodowe . Swoiste

IgM przeciwciała u dorosłych wskazują na kontakt pierwotny z antygenem lub

reaktywacją zakażenia bezobjawowego. Czterokrotne lub większe obniżenie

stężenia przeciwciał IgG , IgA wskazuje na przebyte zakażenie , bez

możliwości określenia czasu. Przeciwciała skierowane wobec licznych

antygenów wirusowych pozostają w organizmie przez miesiące , a nawet lata .
Wielokrotne badania serologiczne , najmniej dwóch próbek surowic , w okresie
2-

3 tygodni , mają zatem znaczenie diagnostyczne.

Do wykrywania obecności przeciwciał w surowicy stosowane są testy tj.:

- test neutralizacji (NT)
-

wiązanie dopełniacza (CF)

-

immunofluorescencji pośredniej (HF)

- zahamowanie hemaglutynacji (IH)
- metody immunoenzymatyczne (EIA)

CHEMIOTERAPIA ZA

KAŻEŃ WIRUSOWYCH.

Istniejecie

wiele

leków,

które

odpowiadałyby

kryteriom

chemioterapeutyków przeciwwirusowych. Oznacza to, że chemioterapeutyk

przeciwwirusowy powinien wykazywać hamujące (wirostatyczne) działanie na

swoiste funkcje wirusa, bez oddziaływania na metabolizm komórki gospodarza,

w której się namnaża. Zastosowanie w lecznictwie znalazły preparaty skuteczne

w zakażeniach wywołanych wirusami z rodziny Herpesviridae, Retroviridae

oraz u chorych z ciężkimi postaciami wirusowego zapalenia wątroby, rzadziej

grypą czy innymi zakażeniami. Spośród naturalnych substancji o działaniu

przeciwwirusowym zastosowanie terapeutyczne znalazły interferony. Hamują

one syntezę białek wirusowych. Uzyskanie drogą inżynierii genetycznej

interferonów r

ekombinowanych stworzyło możliwość ich zastosowania

praktycznego u chorych z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B

i C. Od lat 80, w związku z pojawieniem się problemu AIDS, prace nad nowymi

lekami przeciwwirusowymi koncentrowały się nad preparatami skutecznymi w

leczeniu zakażeń retrowirusowych. Obecnie stosowane, syntetyczne związki

przeciwwirusowe, ze względu na ich mechanizm działania można podzielić na:

I.

Hamujące proces odpłaszczania i uwalniania genomu do cytoplazmy

(amantadyna i rymantadyna).

II.

Hamujące wirusową polimerazę DNA, enzym który umożliwia przyłączenie

kolejnych nukleozydów, czyli reakcję polimeryzacji (widarabina,

idoksyurydyna, triflurydyna, cidofowir). Związki te są analogami naturalnych

nukleozydów, które wbudowują się do łańcucha DNA, uniemożliwiając dalszą

syntezę kwasu nukleinowego. Mają czasem groźne działania niepożądane, gdyż

mogą wbudowywać się także do DNA komórki gospodarza. Niektóre z nich

można stosować tylko miejscowo.

III. Analogi nukleozydów aktywowane przez wirus (acyklowir, walacyklowir,
pencyklowir, famcyklowir, gancyklowir) –

są pochodnymi guanozyny. Ich

mechanizm działania jest podobny do acyklowiru, różnią się biodostępnością i

znajdują zastosowanie w leczeniu zakażeń herpeswirusowych.

IV. Inhibitory rewertazy HIV –

hamujące odwrotną transkryptazę, enzym

kluczowy w procesie replikacji wirusa, przepisujący informację zawartą w RNA

na komplementarną nić DNA. Związki należące do tej grupy ze względu na

strukturę chemiczną dzieli się na nukleozydowe (np. zidowudyna, zalcytabina,
stawudyna, lamiwudyna, didanozyna) i nienukleozydowe (np. delawirydyna,
efawirenz, newirapina).

V. Inhibitory proteaz (np. amprenawir, indinawir, nelfinawir, sakwinawir,
ritonawir). Ta grupa leków blokuje miejsce aktywne enzymu, który jest

niezbędny w procesie dojrzewania i formowania cząstek wirusa HIV.

Unieczynnienie tego enzymu zatrzymuje proces namnażania wirusa w komórce.

VI

. Związki o szerokim zakresie działania (rybawiryna, foskarnet) – hamują

polimerazy wirusowe, a prz

ez to namnażanie zarówno DNA, jak i RNA

wirusów m.in. grypy, paragrypy, bunyawirusów, arenawirusów, retrowirusów,
adenowirusów.

VII.

Związki hamujące uwalnianie potomnych wirionów (zanamiwir i

oseltamiwir) – to niedawno odkryte selektywne inhibitory neuraminidazy wirusa

grypy typu A i B. Stosuje się także z dobrym skutkiem, szczególnie w

przypadkach osób zakażonych HIV, a ostatnio HBV i HCV, leczenie skojarzone
kilkoma lekami. Terapia HAART (ang. highly active anti–retroviral therapy)
polega na podawaniu

zazwyczaj 3 leków antyretrowirusowych o różnych

mechanizmach działania. Celem terapii HAART jest maksymalne obniżenie

poziomu wirusa we krwi, ochrona lub odbudowa układu immunologicznego,

poprawa jakości życia chorych, opóźnienie wystąpienia AIDS i wydłużenie

czasu życia zakażonych. Całkowita eradykacja HIV przy obecnych

możliwościach chemioterapii nie jest możliwa.

Największą grupę przebadanych związków stanowią inhibitory syntezy kwasów

nukleinowych, będące analogami nukleozydów. Odpowiedniki nukleozydów

mogą hamować funkcje enzymów uczestniczących w metabolizmie puryn lub

pirymidyn, polimerazy biorącej udział w replikacji kwasu nukleinowego, lub

mogą blokować syntezę kwasów nukleinowych poprzez wbudowanie się do

cząsteczki kwasu.

W lecznictwie znalazły praktyczne zastosowanie tylko:

- idoksurydyna
- widarabina
- triflurydyna
- rybawiryna
- acyklowir
- gancyklowir
- zydowudyna

Z wyjątkiem acyklowiru, gancyklowiru i zydowudyny analogi nukleozydów są
inhibitorami niespecyficznymi komórkowej i wirusowej replikacji. Tylko w.w.

związki charakteryzują się selektywnym działaniem wobec enzymów
wirusowych.
Idoksurydyna-

analog tymidyny działa na Hermes- i poxvirusy. Nie działa

wybiórczo. Mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy DNA.
Stosowany miejscowo w pryszczkowym zapaleniu rogówki.
Widarabina-

działa na wirus opryszczki, Epsteina-Barr, ospy wietrznej, HBV.

Działanie polega na inhibicji syntezy DNA wirusa. Możliwość stosowania
doustnego.
Triflurydyna-

Działa na HSV 1 i 2, CMV, działa też na komórki gospodarza.

Mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy DNA. Stosowany w
opryszczkowym zapaleniu rogówki.
Rybawiryna

stosowany w ciężkich zakażeniach wirusem RSV, wirusem HCV

(w połączeniu z interferonami alfa-2) i w innych infekcjach wirusowych.

Rybawiryna jest analogiem nukleozydów

purynowych. Jej działanie polega na

hamowaniu replikacji RNA i DNA niektórych wirusów, takich jak:

•

myksowirusy

•

paramyksowirusy

•

arenawirusy

•

retrowirusy

•

adenowirusy

•

flawiwirusy

•

niektóre pokswirusy

Lek stosowany jest w leczeniu przewlekłej formy wirusowego zapalenia

wątroby typu C w połączeniu z interferonem alfa-2a lub alfa-2b oraz z
peginterferonem alfa-2a lub alfa-2b (peginterferony to inaczej interferony
pegylowane

czyli z dołączoną cząsteczką glikolu polietylenowego

]

). Lek należy

zawsze łączyć z interferonem, ponieważ rybawiryna podawana w monoterapii u

chorych zakażonych HCV jest nieskuteczna. Ponadto rybawirynę stosuje się

podając wziewnie w ciężkich zakażeniach wirusem RSV u dzieci.

Acyklowir

Jest kompetytywnym inhibitorem polimerazy DNA-wirusa HSV

(opryszczki) i wirusa półpaśca (VZV). W komórkach zakażonych wirusem jest
aktywowany przez enzym wirusowy –

kinazę tymidynową, ulega fosforylacji do

monofosforanu,

z którego pod wpływem enzymów komórki powstaje

trójfosforan. Hamuje on wybiórczo nukleotydylotransferazę DNA- wirusa

zapobiegając jego namnażaniu. Wykazuje również słabsze działanie wobec

wirusów nie kodujących kinazy tymidynowej tj. EBV i CMV. Wśród wirusów

opryszczki spotyka się szczepy oporne na acyklowir, dotyczy to szczepów

mutantów niesyntetyzujących własnej kinazy tymidynowej. Lek wchłania się

dobrze z nabłonka rogówki, błony śluzowej nosa i z przewodu pokarmowego.

Podawany może być miejscowo, doustnie i dożylnie.
Gancyklowir

Swoisty inhibitor polimerazy wirusa cytomegalii (CMV). Wykazuje

również skuteczność w leczeniu zakażeń przewodu pokarmowego, zapalenia

płuc oraz objawów mononukleozy zakaźnej. Ze względu na wysoką toksyczność
( hamowanie funkcji szpiku) zastosowanie w.w. leku jest ograniczone do

przypadków zagrażających życiu.
Zydowudyna

Jest odpowiednikiem tymidyny, który ulega fosforylacji w zakażonych i

nie zakażonych komórkach do trójfosforanu tj. aktywnej zydowudyny. W takiej
postaci j

est wbudowana za pomocą odwrotnej transkryptazy (rewertazy), gdyż

silnie i selektywnie neutralizuje wirusową rewertazę. Mimo dużej toksyczności
lek stosowany jest w leczeniu HIV.

W leczeniu zakażeń wirusowych oraz innych chorób, zwłaszcza u

pacjentów z im

munosupresją, mają zastosowanie także różne leki o

właściwościach immunomodulujących. Duże nadzieje wiązane są z
wykorzystaniem rekombinowanych interferonów i innych cytokin oraz

przeciwciał monoklinalnych swoistych dla antygenów wirusowych, receptorów
komórkowych lub inhibitorów indukowanych przez wirusy.

Zakażenia herpeswirusowe

Zakażenia układu oddechowego Wirusowe zapalenia wątroby

Preparat

Zastosowanie

Preparat

Zastosowanie

Preparat

Zastosowanie

Idoksyurydyn
a

HSV –
zapalenie
rogówki (tylko
miejscowo)

Amantadyna

Wirus grypy
typu A

Lamiwudyna

Wirus
zapalenia

wątroby typu B

Triflurydyna

HSV –
zapalenie
rogówki (tylko
miejscowo)

Rymantadyna

Wirus grypy
typu A

Rybawiryna

Wirus
zapalenia

wątroby typu C

Widarabina

HSV –
zapalenie
rogówki (tylko
miejscowo),

Rybawiryna

Wirus grypy
typu A i B,
wirus RS

Interferon

Wirus
zapalenia

wątroby typu B
i C

Acyklowir

Zakażenia

wywołane przez
HSV i VZV

Zanamiwir

Wirus grypy
typu A i B

Walacyklowir

Zakażenia

wywołane przez
HSV i VZV

Pencyklowir

Zakażenia

wywołane przez
HSV i VZV

Gancyklowir

Zakażenia

wywołane przez
CMV

Foskarnet

Zakażenia

wywołane przez
CMV

Cidofowir

Zakażenia

wywołane przez

CMV, a także
HSV, VZV,
EBV