chromatografia gazowa pestycydów

CHEMIA ● DYDAKTYKA ● EKOLOGIA ● METROLOGIA 2008

R. 13, NR 1-2

Anna Sadowska-Rociek

i Ewa Cieślik

Małopolskie Centrum Monitoringu i Atestacji śywności

Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie
ul. Balicka 122, 30-149 Kraków
tel./fax 012 662 48 27, fax 012 662 48 25
email: asadowska-rociek@ar.krakow.pl

STOSOWANE TECHNIKI I NAJNOWSZE TRENDY

W OZNACZANIU POZOSTAŁOŚCI PESTYCYDÓW W śYWNOŚCI

METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

APPLIED AND RECENTLY DEVELOPED METHODS FOR DETERMINATION OF PESTICIDE

RESIDUES IN FOOD BY GAS CHROMATOGRAPHY

Streszczenie: Omówiono zagadnienia dotyczące oznaczania pozostałości pestycydów w produktach spożywczych metodą
chromatografii gazowej. Scharakteryzowano zarówno dotychczasowe, jak i nowo opracowane techniki używane do ekstrakcji
pestycydów oraz metody oczyszczania ekstraktów. Przedstawiono trudności analityczne występujące przy przygotowaniu
próbek do analizy spowodowane obecnością w żywności złożonej matrycy biologicznej, zróżnicowanymi właściwościami
fizykochemicznymi pestycydów, a także małymi stężeniami tych związków w żywności. Scharakteryzowano najnowsze
trendy w ich analityce: dwuwymiarową chromatografię gazową, metodę QuEChERS, a także zastosowanie kalibracji
z wykorzystaniem matrycy próbki oraz związków chroniących anality.

Słowa kluczowe: pestycydy, żywność, metody analityczne, chromatografia gazowa, QuEChERS

Summary: The paper deals with the issues relating to determination of pesticide residues in food by gas chromatography. The
commonly known as well as recently developed techniques used for the extraction of pesticides and methods for cleaning-up
extracts are characterised. Analytical problems occurring in the preparation of samples for analysis (the presence of complex
matrix, diverse physicochemical properties of pesticides, their low concentrations in food) are briefly described. The paper also
presents the latest trends in analytics of these compounds: two-dimensional gas chromatography, the QuEChERS method, the
application of matrix-matched calibration, and the use of analyte protectants.

Keywords: pesticides, food, analitycal methods, gas chromatography, QuEChERS

Wprowadzenie

Pestycydy są jednymi z najbardziej toksycznych sub-

stancji zanieczyszczających środowisko. Szczególnie nie-
bezpieczna jest ich obecność w żywności, ponieważ stanowi
ona łatwe źródło narażenia zdrowia ludzkiego na zatrucia.
Dlatego też niezbędne jest kontrolowanie poziomu pozosta-
łości pestycydów w żywności za pomocą dostępnych metod
analitycznych. Wybór odpowiedniej procedury badawczej
w dużej mierze uwarunkowany jest rodzajem produktu spo-
ż

ywczego (matrycą próbki) oraz strukturą i budową che-

miczną oznaczanego pestycydu. Obecnie dąży się jednak do
opracowania tzw. multimetod (multiresidue methods), zwa-
nych także metodami wielopozostałościowymi lub techni-
kami

równoczesnego

oznaczania

pozostałości

wielu

składników [1, 2]. Techniki te pozwalają oznaczyć w danej
grupie produktów żywnościowych pozostałości pestycydów
należących do różnych grup chemicznych. Jest to o tyle

trudne, że związki te w zależności od budowy chemicznej
mają zróżnicowane właściwości fizykochemiczne [3].

Optymalna, wielopozostałościowa metoda oznaczania

pozostałości pestycydów w żywności powinna spełniać na-
stępujące kryteria [4]:

•

umożliwić jednoczesne wykrywanie dużej liczby sub-
stancji należących do różnych grup związków chemicz-
nych,

•

zapewnić maksymalne oczyszczanie próbki ze zbędnych
substancji (usunięcie matrycy),

•

charakteryzować się dużym odzyskiem związków, dobrą
precyzją i wysoką czułością,

•

być tania w eksploatacji, szybka i łatwa w wykonaniu
oraz bezpieczna dla środowiska (małe zużycie próbki
i odczynników, w tym przede wszystkim rozpuszczalni-
ków organicznych).

CHEMIA ● DYDAKTYKA ● EKOLOGIA ● METROLOGIA 2008

R. 13, NR 1-2

Podstawowym problemem oznaczania pozostałości pe-

stycydów w materiałach biologicznych jest obecność skom-
plikowanej i zróżnicowanej matrycy, zawierającej związki,
które, interferując z analitami, poszerzają piki chromatogra-
ficzne, a także mogą uszkodzić sprzęt wykorzystywany do
analizy. Do związków tych należą przede wszystkim kwasy
tłuszczowe, sterole oraz barwniki. Kwasy tłuszczowe i stero-
le pogarszają parametry rozdziału chromatograficznego oraz
powodują zanieczyszczenie wkładki dozownika i kolumny
chromatograficznej. Obecność barwników w próbce zakłóca
pracę spektrometru masowego [5, 6].

Analiza pozostałości pestycydów utrudniona jest także

ze względu na fakt, iż występują one w produktach spożyw-
czych w bardzo małych stężeniach. Niezbędna jest więc
izolacja związków z matrycy, a następnie ich wzbogacanie
przed ostatecznym oznaczeniem końcowym. Proces ozna-
czania pozostałości pestycydów jest złożony i składa się
z wielu etapów [7, 8]:

•

pobrania próbki,

•

ekstrakcji pestycydów z próbki,

•

oczyszczania ekstraktu i jego odpowiedniego przygoto-
wania do analizy,

•

identyfikacji i oznaczenia analitów wybraną techniką
badawczą.

Przygotowanie próbek do analizy

Procedura pobrania próbki musi zapewnić odpowied-

nią reprezentatywność i jednorodność materiału przeznaczo-
nego do badań. Zarówno ilość próbki, jak i sam proces jej
pobierania są uzależnione od badanego produktu spożywcze-
go i zwykle opisane są w stosownych dokumentach (np.
Polskie Normy, Rozporządzenia Ministrów: Zdrowia lub
Rolnictwa i Rozwoju Wsi).

Jednorodność próbki laboratoryjnej uzyskuje się, za-

zwyczaj poddając ją procesowi homogenizacji (rozdrobnie-
nia). Z tak przygotowanej próbki wydziela się następnie
porcję analityczną przeznaczoną do badań. Jej ilość powinna
być odpowiednio dobrana do stosowanej metody badawczej
(jak najmniejsza, aby zmniejszyć zużycie odczynników, ale
na tyle duża, aby zapewnić wykrywalność analitów).
W dotychczasowych badaniach ilość próbki zazwyczaj wa-
hała się od 10 do 50 g, jednak przy obecnie stosowanych
metodach badawczych około 5 g zazwyczaj jest wystarczają-
ca [4].

Metody ekstrakcji pestycydów ze środków spożyw-

czych uzależnione są od rodzaju matrycy (dotyczy to przede
wszystkim zawartości tłuszczu w produkcie) oraz właściwo-
ś

ci fizykochemicznych danej grupy pestycydów (pestycydy

polarne i niepolarne).

Poniżej scharakteryzowano najczęściej stosowane do-

tychczas metody ekstrakcji.

Ekstrakcja z użyciem rozpuszczalnika (LLE, liquid-

liquid extraction) polega na wyodrębnieniu analitów
z matrycy z wykorzystaniem odpowiednio dobranego roz-
puszczalnika. Najczęściej stosowane są: aceton, acetonitryl,
octan etylu, a także dichlorometan, heksan, eter naftowy,
alkohol izopropylowy, eter dietylowy oraz ich mieszanki.

Aceton i acetonitryl wykorzystywane są raczej do ekstrakcji
pestycydów niepolarnych, octan etylu stosowany jest do
bardziej polarnych pestycydów. Aceton miesza się nieogra-
niczenie z wodą, dlatego też, aby oddzielić anality od wody,
stosuje się odpowiednie dodatki soli (NaCl, Na

). Eks-

trakty acetonowe zawierają jednak dużo związków
z matrycy, które wymagają usunięcia. Stosowanie acetonu
jako rozpuszczalnika do ekstrakcji wykorzystywane jest
w metodzie Luke’a, zwanej także multimetodą DFG S19 [9].
Acetonitryl nieco lepiej oddziela się od wody, ale też naj-
częściej do ekstraktów dodawane są sole w celu lepszego
rozdzielenia faz. Acetonitryl nie ekstrahuje tak dużo tłusz-
czów jak aceton, ponadto charakteryzuje się też większymi
odzyskami związków [4, 10]. Wadą stosowania LLE jest
ryzyko powstania emulsji, która trudno ulega ponownemu
rozdzieleniu,

oraz

stosowanie

w dużych

ilościach

(100÷200 cm

) szkodliwych dla zdrowia rozpuszczalników.

Pestycydy ekstrahowane tą metodą charakteryzują się zróż-
nicowanymi odzyskami dla poszczególnych związków. Me-
toda ta jest praco- i czasochłonna [11, 12].

Ekstrakcja do fazy stałej (SPE, solid phase extraction)

polega na przepuszczaniu analizowanej próbki (lub jej roz-
tworu) przez złoże sorbentu umieszczonego w kolumnie
i adsorpcji oznaczanych związków na cząstkach złoża. Zaad-
sorbowane anality wymywa się następnie niewielką ilością
odpowiedniego rozpuszczalnika (acetonitryl, octan etylu,
aceton, dichlorometan). Niepolarne anality i średniopolarne
sorbuje się na niepolarnych sorbentach, polarne związki zaś
są zatrzymywane na polarnych sorbentach (Florisil, tlenek
glinu, żel krzemionkowy), modyfikując odpowiednio sorben-
ty poprzez dodatki grup fenylowych, oktylowych itp. [3].
Metoda jest szybka i prosta, łączy w sobie jednocześnie
proces ekstrakcji, oczyszczania oraz wzbogacania analitów.
Odmianą klasycznej metody SPE jest tzw. dyspersyjna eks-
trakcja do fazy stałej (dispersive SPE lub dSPE). W tym
przypadku nie używa się złoża sorbentu, a jedynie sypkiego
sorbentu, dodawanego do roztworu próbki. Jako sorbenty
stosuje się modyfikowane żele krzemionkowe, w tym przede
wszystkim PSA (primary secondary amine) w połączeniu
z GCB (graphitized carbon black) lub C

(modyfikowany

el krzemionkowy z grupami oktadecylowymi). Wybór od-

powiedniego sorbentu uzależniony jest od rodzaju matrycy
i związków, które należy usunąć. I tak, do usuwania kwasów
tłuszczowych stosuje się zazwyczaj PSA, NH

, SAX, C

i DEA, do usuwania pigmentów wykorzystywany jest PSA
i GCB. Najlepsze oczyszczanie uzyskuje się, łącząc szere-
gowo oczyszczanie na PSA i GCB lub też stosując kolu-
mienki wypełnione dwiema warstwami sorbentów [6, 13].

Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME, solid phase

microextraction) jest modyfikacją SPE. W technice tej anali-
ty obecne w ciekłej próbce lub w parach nad jej powierzch-
nią są adsorbowane na włóknie pokrytym odpowiednią fazą
stacjonarną i zamkniętym w mikrostrzykawce. Zaadsorbo-
wany analit zostaje następnie przeniesiony do dozownika
chromatografu gazowego, gdzie następuje jego desorpcja
termiczna. Jej zaletą jest szybkość i brak rozpuszczalników
[4, 14, 15].

CHEMIA ● DYDAKTYKA ● EKOLOGIA ● METROLOGIA 2008

R. 13, NR 1-2

Technika ekstrakcji za pomocą ruchomego elementu

sorpcyjnego (SBSE, stir bar sorptive extraction) korzysta
z tych samych zasad co SPME, natomiast w tym przypadku
sorbent (najczęściej PDMS) umieszczony jest na ruchomym
elemencie sorpcyjnym. Tak zatrzymane anality są następnie
desorbowane termicznie. Technika ta charakteryzuje się
większymi wartościami odzysków związków niż SPME
[2, 11].

W technice ekstrakcji z fazy stałej (MSPDE, matrix so-

lid phase dispersion extraction) dobrze rozdrobnioną próbkę
miesza się ze stałym sorbentem (żel krzemionkowy, Florisil,
C

itp.) i umieszcza się w kolumnie, którą przemywa się

odpowiednio dobranym eluentem (np. dichlorometanem).
Metoda jest prosta, efektywna i umożliwia analizę wielu
próbek, redukuje ilość rozpuszczalników, unika konieczności
stosowania odrębnego procesu oczyszczania. Wadą metody
są stosunkowo małe odzyski związków [5, 14].

W ekstrakcji płynem w fazie nadkrytycznej (SFE, su-

percritical fluid extraction) jako rozpuszczalnik stosuje się
CO

w postaci płynu w stanie nadkrytycznym. Wydajność

ekstrakcji można optymalizować, modyfikując parametry
CO

, np. przez dodanie metanolu. Technika ta nie prowadzi

do degradacji pestycydów, jest szybka, nie wymaga stoso-
wania toksycznych rozpuszczalników, wykazuje dobre efek-
ty w usuwaniu tłuszczów i dobre wydajności w ekstrakcji
pestycydów chlorowcoorganicznych. Wadą metody jest jej
wysoki koszt [4].

Metoda przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem

(ASE, accelerated solvent extraction) polega na ekstrakcji
analitów niewielką ilością rozpuszczalnika w podwyższonej
temperaturze i pod zwiększonym ciśnieniem. Do zalet meto-
dy należy zaliczyć małe zużycie odczynników i krótki czas
operacji, do wad – możliwość degradacji związków lotnych
i nietrwałych termicznie [7, 16].

Ekstrakcja w aparacie Soxhleta polega na cyklicznej

ekstrakcji związków z ciał stałych odpowiednim rozpusz-
czalnikiem lub jego parami. Technika jest powszechnie sto-
sowana do ekstrakcji tłuszczów i zanieczyszczeń z żywności,
lecz jej wadą jest długi czas procesu i znaczne zużycie roz-
puszczalników [16].

Etap oczyszczania otrzymanego ekstraktu jest proce-

sem niezbędnym, który zawsze powinien poprzedzać etap
analizy próbki. Szczególnie ważne jest odseparowanie
związków, które mogłyby zakłócać przebieg analizy, ale
usunięcie matrycy polepsza także wykrywalność analitów
(obniża granicę wykrywalności) oraz zapewnia prawidłowy
przebieg analizy ilościowej [3].

W niektórych przypadkach - przy oznaczaniu pestycy-

dów z wykorzystaniem dwuwymiarowej chromatografii
gazowej (GCxGC) lub tandemowej spektrometrii mas (MS-
MS) - oczyszczanie próbki nie jest konieczne, gdyż zastoso-
wanie wyżej wymienionych technik w pełni zapewnia od-
dzielenie sygnałów analitów od sygnałów matrycy.
Pominięcie etapu oczyszczania ekstraktu może spowodować
jednak pogorszenie pracy urządzeń i krótszy czas ich życia,
powinno się więc poddać oczyszczaniu każdą próbkę, nieza-
leżnie, jaką metodą będzie ona potem badana [5, 9, 14].
Proces oczyszczania może być prowadzony jednocześnie

z procesem ekstrakcji (z wykorzystaniem SPE, MSPDE,
SPME) lub też może być etapem całkowicie odrębnym.

Najczęściej stosowaną techniką oddzielania matrycy od

pestycydów jest chromatografia żelowa (GPC, gel perme-
ation chromatography), która umożliwia odseparowanie
małomolekularnych pestycydów od wielkomolekularnych
substancji obecnych w matrycy [14]. Jako wypełnienie stosu-
je się zazwyczaj żywice (kopolimery styrenu i diwinylo-
benzenu), jako eluenty zaś wykorzystuje się zazwyczaj octan
etylu, cykloheksan, eter dietylowy lub ich mieszaniny. GPC
szczególnie przydatna jest przy analizie produktów o dużej
zawartości tłuszczu (np. oleje), gdyż skutecznie oddziela
tłuszcze od pestycydów. Wadą chromatografii żelowej jest
długi czas analizy, zużycie znacznej ilości rozpuszczalników
oraz trudności w zoptymalizowaniu warunków procesu [14,
17]. Przy analizie pyretroidów należy szczególnie starannie
dobrać parametry oczyszczania z uwagi na duże masy mole-
kularne tych związków, które mogą się eluować wraz
z zanieczyszczeniami [4].

Oddzielanie niepożądanych związków od analitów może

również odbywać się na kolumnie wypełnionej odpowiednim
sorbentem (chromatografia adsorpcyjna). Najczęściej wyko-
rzystywanymi sorbentami są: żel krzemionkowy, Florisil,
tlenek glinu, węgiel aktywny. śel krzemionkowy niezbyt
dobrze oczyszcza pestycydy od innych substancji. Florisil
natomiast skutecznie usuwa chlorofil, triglicerydy i sterole
roślinne. Oczyszczanie ekstraktu tą techniką nie jest tak
efektywne jak przy użyciu chromatografii żelowej, zdarza się
również, że anality są zatrzymywane na sorbencie, co pro-
wadzi do zafałszowania wyników. Dlatego też metoda ta jest
coraz rzadziej stosowana [4, 7].

Oznaczanie pozostałości pestycydów -
chromatografia gazowa

Ostatnim etapem procedury analitycznej jest identyfika-

cja związków i ich ilościowe oznaczenie z wykorzystaniem
właściwie dobranej techniki instrumentalnej. Dobór odpo-
wiedniej metody uzależniony jest od właściwości pestycy-
dów. Do związków polarnych, nietrwałych i niestabilnych
termicznie można stosować chromatografię cieczową. Znane
są także inne metody oznaczania pozostałości pestycydów,
takie jak: chromatografia cienkowarstwowa, spektrometria
UV czy też enzymatyczna analiza immunologiczna (ELISA,
enzyme linked immunosorbent assay) [7, 14].

Najczęściej jednak wykorzystuje się chromatografię ga-

zową, wyposażoną w adekwatne do rodzaju pestycydów
detektor i kolumnę. Stosuje się ją do analizy związków za-
równo polarnych, jak i niepolarnych, a więc doskonale nada-
je

się

równoczesnego

oznaczania

pozostałości

pestycydów chlorowcoorganicznych, fosforoorganicznych,
karbaminianów i pyretroidów.

Wybór właściwej kolumny zapewnia optymalny roz-

dział analizowanej próbki. Do analizy pestycydów niepolar-
nych (chlorowcoorganiczne, pyretroidy) stosuje się kolumny
z wypełnieniem niepolarnym, takie jak: DB 5, HP-5 MS,
DB-XLB,

rozdziału

związków

redniopolarnych

i polarnych (pestycydy fosforoorganiczne) należy użyć ko-

CHEMIA ● DYDAKTYKA ● EKOLOGIA ● METROLOGIA 2008

R. 13, NR 1-2

lumn z wypełnieniami bardziej polarnymi. Przykładami
takich kolumny są: CP Sil 8, CP Sil 13, DB-17, DB-1701
[12, 15, 18].

Równie ważny jest dobór właściwej metody detekcji

związków rozdzielonych na kolumnie. W przypadku ozna-
czenia pestycydów chlorowcoorganicznych takim detekto-
rem jest detektor wychwytu elektronów (ECD, electron
capture detector). Jego zaletą jest wysoka czułość
w stosunku do związków zawierających elektroujemne ato-
my. Detektor płomieniowo-fotometryczny (FPD, flame pho-
tometric detector) jest natomiast wykorzystywany do
detekcji pestycydów fosforoorganicznych [3]. W niektórych
pracach używano także detektora fosforowo-azotowego
(NPD, nitrogen phosphorus detector, zwanego również spe-
cyficznym detektorem termojonowym, TSD, thermionic
specific detector), który doskonale nadaje się do analiz
związków mających w swej strukturze atomy azotu i fosforu
[14, 19].

Oprócz wyżej wymienionych detektorów selektywnych

na wybrane grupy związków bardzo powszechnym
i efektywnym rozwiązaniem jest sprzężenie chromatografii
gazowej ze spektrometrią mas. Spektrometr mas jako detek-
tor uniwersalny charakteryzuje się szerokim zakresem zasto-
sowań i może być wykorzystywany w multimetodach do
jednoczesnego oznaczania pestycydów wywodzących się
z różnych grup chemicznych. Spektrometr mas może praco-
wać w trybie skaningu całkowitego widma mas (full scan)
lub monitorowania wybranych jonów (SIM, selected ion
monitoring), który odznacza się lepszą czułością i selektyw-
nością, ale znacznie redukuje ilość dostarczanych informacji
o badanych związkach [20]. Zwiększenie czułości można
uzyskać, stosując również wielokrotną spektrometrię mas
(MS

, najczęściej MS/MS), w wersji tandemowej w prze-

strzeni (tandem-in-space) lub tandemowej w czasie (tandem-
in-time). W technice tej wybrane jony rozdzielone
w pierwszym analizatorze są następnie ponownie fragmen-
towane, a powstające z nich jony potomne są analizowane
w drugim analizatorze mas [10, 21].

Większą czułość metody, poprawienie rozdziału pików

chromatograficznych oraz zmniejszenie wpływu matrycy na
wyniki oznaczeń można także osiągnąć przy użyciu kom-
pletnej dwuwymiarowej chromatografii gazowej - GCxGC
[18, 22]. W technice tej anality po wstępnym rozdzieleniu na
pierwszej kolumnie ulegają z pewną częstotliwością zatrzy-
mywaniu w kapilarze (lub pułapce kriogenicznej). Następnie
związki są uwalniane poprzez podgrzanie kapilary i dostają
się do drugiej kolumny. Zatrzymywanie i desorpcja analitów
(modulacja) odbywa się cyklicznie. Dobór właściwej kombi-
nacji kolumn pozwala na optymalny rozdział analitów, przy-
kładem może być zastosowanie kolumn DB-17 i HT-8 do
rozdziału pestycydów chloroorganicznych [22]. Często spo-
tykanym rozwiązaniem jest połączenie dwuwymiarowej
chromatografii

gazowej

z detekcją

mas,

zwłaszcza

z zastosowaniem analizatora czasu przelotu - GCxGC-TOF-
MS [23]. Analizator ten charakteryzuje się znaczną szybko-
ś

cią zbierania danych, co doskonale znajduje zastosowanie

w GCxGC, a także w szybkiej chromatografii gazowej (fast
GC), równie często wykorzystywanej do analizy pestycy-

dów. Szybka chromatografia gazowa, w porównaniu do
klasycznej GC, wykorzystuje krótsze (około 10 m) i węższe
kolumny kapilarne (o średnicach od 0,1 mm), z filmami fazy
stacjonarnej o grubości około 0,1 µm, szybsze przepływy
gazu nośnego i jego wyższe ciśnienie. Parametry te pozwala-
ją uzyskać wyniki oznaczeń w krótszym czasie, z większą
precyzją i lepszym rozdziałem pików [8, 15, 24, 25].

Problemy kalibracji w oznaczaniu
pozostałości pestycydów

Istotną kwestią w analizie pozostałości pestycydów jest

uzyskanie wiarygodnych wyników oznaczeń ilościowych.
Najczęściej spotykanymi metodami kalibracji w chromato-
grafii gazowej są: metoda serii wzorców (wzorca zewnętrz-
nego) oraz metoda wzorca wewnętrznego. Roztwory
kalibracyjne sporządzane były zazwyczaj w odpowiednich
rozpuszczalnikach (heksan, acetonitryl itp.). Wyniki ozna-
czeń obarczone były jednak pewnymi błędami, wynikający-
mi z różnic pomiędzy roztworami stosowanymi do kalibracji
(czysty rozpuszczalnik) a analizowanym roztworem próbki
rzeczywistej (obecność, nawet w ilościach śladowych, ma-
trycy). Podczas wstrzykiwania próbki zawierającej matrycę
do układu chromatograficznego jej składniki mają tendencję
do blokowania miejsc aktywnych, co zmniejsza straty anali-
tów spowodowane ich adsorpcją lub degradacją w tych miej-
scach. Zjawisko to prowadzi do podwyższenia sygnałów
pochodzących od analitów, w porównaniu do próbek nieza-
wierających matrycy [26].

Problemem jest również dobór odpowiedniego wzorca

wewnętrznego, który powinien być pod względem właściwo-
ś

ci fizykochemicznych jak najbardziej zbliżony do oznacza-

nych związków. Pewnym rozwiązaniem jest dodatek
wzorców wewnętrznych izotopowo oznakowanych (SIDA,
Stable Isotope Dilution Assay). Technika ta polega na doda-
waniu do roztworu badanej próbki wzorca wewnętrznego,
który jest izotopem analitu. Zarówno oznaczany związek, jak
i jego izotop (wzorzec wewnętrzny) mają niemal identyczne
właściwości fizykochemiczne i podobnie reagują podczas
przygotowania próbki i w warunkach przeprowadzania anali-
zy chromatograficznej [24].

Aby natomiast zrekompensować skutki obecności ma-

trycy, oprócz dodawania do roztworów wzorca wewnętrzne-
go,

stosuje

się

technikę

sporządzania

roztworów

kalibracyjnych nie z czystego rozpuszczalnika, a z roztwo-
rów zawierających matrycę pochodzącą z danej próbki, wol-
ną jednak od oznaczanych analitów (matrix-matched
calibration). Zapewnia to uzyskiwanie porównywalnych
sygnałów pochodzących od analitów obecnych zarówno
w badanej próbce, jak i w roztworach stosowanych do kali-
bracji [26].

Takie podejście skomplikowane jest jednak ze względu

na trudności w uzyskaniu matrycy o składzie zbliżonym do
analizowanej próbki, która jednocześnie nie zawiera anali-
zowanych związków. Innym sposobem - zaproponowanym
przez Anastassiadesa i współprac. [7] - ochrony analitów
przed adsorpcją lub degradacją w układzie chromatograficz-
nym - jest dodatek odpowiednich związków ochronnych

CHEMIA ● DYDAKTYKA ● EKOLOGIA ● METROLOGIA 2008

R. 13, NR 1-2

(analyte protectants), np. D-sorbitolu czy też 3-etoksy-1,2-
propanediolu. Wykazano, iż obecność tych substancji
zmniejsza ryzyko strat analitów podczas analizy chromato-
graficznej [13, 26, 27].

Stosowanie kalibracji z wykorzystaniem roztworów za-

wierających matrycę czy też dodatek związków chroniących
analit jest rekomendowane przez Dyrekcję Generalną ds.
Zdrowia i Ochrony Konsumentów (SANCO, organ Unii
Europejskiej) w instrukcji do metod walidacji i kontroli jako-
ś

ci w oznaczaniu pozostałości pestycydów w żywności

i paszach [28].

Najnowsze trendy w analityce pestycydów -
metoda QuEChERS

Obecne kierunki badań skłaniają się ku opracowaniu

procedur badawczych, które spełniałyby wszystkie warunki,
jakie powinna mieć idealna metoda oznaczania pestycydów.
Taką techniką jest metoda QuEChERS (Quick, Easy, Cheap,
Effective, Rugged and Safe - szybka, prosta, tania, efektyw-
na, bezpieczna).

QuEChERS opracowane zostało kilka lat temu przez

Anastassiadesa i współpracowników. Technika ta oparta jest
na kilku etapach [27, 29]:

•

ekstrakcji pestycydów z próbki za pomocą niewielkiej
ilości acetonitrylu (10 cm

•

dodatku około 1 g NaCl i 4 g MgSO

w celu rozdziele-

nia warstw wody i acetonitrylu,

•

oczyszczania wydzielonej objętości ekstraktu metodą
dyspersyjnej SPE z zastosowaniem różnych sorbentów;
podstawowym sorbentem jest PSA (zazwyczaj stosuje
się go w ilości 25 mg na 1 cm

roztworu),

•

dodatku 5% roztworu kwasu mrówkowego w acetonitry-
lu (osiągnięcie wartości pH wynoszącej około 5),

•

oznaczania metodą GC lub LC.
Zaletą metody jest niewielkie zużycie próbki (około

5÷10 g) i odczynników, w tym toksycznych rozpuszczalni-
ków, prostota wykonania - w procedurze wykorzystuje się
jedynie wytrząsanie i wirowanie. Wszystkie powyższe cechy
wpływają także na redukcję kosztów analizy. Metoda ta
charakteryzuje się również bardzo dobrymi efektami
w usuwaniu matrycy i wysokimi odzyskami analizowanych
związków [14].

W zależności od poziomu zawartości tłuszczu

w produktach spożywczych metoda QuEChERS może być
odpowiednio modyfikowana przez dodatek, np. C

lub GCB

jako sorbentów, które efektywnie usuwają tłuszcz, sterole
i pigmenty [10, 14], lub kwasu octowego w celu polepszenia
ekstrakcji polarnych pestycydów fosforoorganicznych [6].
Tłuszcz lub woski wyekstrahowane z próbek (głównie zbóż
i owoców cytrusowych) mogą być usunięte również przez
wymrażanie próbki co najmniej przez 1 godz. w niskiej tem-
peraturze [29].

Istnieją także pewne odmiany tej metody (buffered Qu-

EChERS, modified QuEChERS), w których stosuje się bufor
cytrynianowy (dodatek cytrynianu i wodorocytrynianu sodu
przy ekstrakcji acetonitrylem) lub octanowy (użycie do eks-
trakcji 1% roztworu kwasu octowego w acetonitrylu z dodat-

kiem octanu sodu zamiast chlorku sodu [14, 21].
W przypadku analizy owoców cytrusowych, czarnych porze-
czek i malin zalecany jest dodatek 5 M roztworu NaOH
w celu osiągnięcia pH około 5 [29].

Pewnym problemem metody są końcowe objętości uzy-

skanego ekstraktu do analizy. W przypadku dozowania do
chromatografu objętości próbki rzędu 1÷2 nm

(µl), otrzy-

mane sygnały analitów mogą znajdować się poniżej granicy
wykrywalności związków. W takich przypadkach stosuje się
metodę dozowania większych (niż 3 nm

(µl)) objętości

próbki (LVI, Large Volume Injection) z możliwością odpa-
rowania próbki w dozowniku z programowaną zmianą tem-
peratury (PTV, Programmed Temperature Vaporizer) [1,
30]. Innym rozwiązaniem jest wzbogacenie próbki przed
wstrzyknięciem jej do chromatografu poprzez odparowanie
części rozpuszczalnika, np. z 4 do 1 cm

[29].

Technika QuEChERS jest coraz bardziej rozpowszech-

niona na świecie. Obecnie prowadzone są badania nad jej
zoptymalizowaniem do analiz zróżnicowanych grup związ-
ków oraz produktów żywnościowych. Została ona również
zatwierdzona jako oficjalna metoda badań pestycydów we-
dług Europejskiego Komitetu Normalizacyjnego (CEN,
fr. Comité Européen de Normalisation), a od grudnia 2008 r.
funkcjonuje też w zbiorze Polskich Norm jako (obecnie
jedynie w wersji anglojęzycznej): PN-EN 15662 śywność
pochodzenia roślinnego. Oznaczanie pozostałości pestycy-
dów metodą GC-MS i/lub LC-MS(/MS) po uprzedniej eks-
trakcji i rozdziale acetonitrylem oraz oczyszczaniu metodą
dyspersyjnej SPE. Metoda QuEChERS [31].

Podsumowanie

Pestycydy są jednymi z najbardziej niebezpiecznych

substancji chemicznych obecnych w środowisku, głównie ze
względu na ich odporność na degradację oraz długofalowe
skutki działania w organizmach żywych. Ich obecność
w żywności stwarza szczególne zagrożenie narażenia zdro-
wia, dlatego też niezbędne jest monitorowanie i badanie ich
pozostałości w środkach spożywczych. Szereg opracowa-
nych do tej pory procedur badawczych i technik przygoto-
wania próbek umożliwia oznaczenie pozostałości tych
związków w całej gamie artykułów spożywczych i rolnych.
Oznaczanie pozostałości pestycydów w żywności utrudnione
jest jednak ze względu na obecność w próbkach matrycy
i małe stężenia pestycydów w żywności, co pociąga za sobą
konieczność stosowania praco- i czasochłonnych metod.
Dlatego też trwają badania nad udoskonaleniem wykorzy-
stywanych technik i opracowaniem nowych, które w sposób
szybki, prosty, tani, skuteczny i bezpieczny dla środowiska
pozwalałyby jednocześnie oznaczyć pestycydy wywodzące
się z różnych grup chemicznych, uzyskując wiarygodne
wyniki analiz.

Literatura

[1]

Gnusowski B., Nowacka A., Giza I., Sztwiertnia U., Łozowicka B.,
Kaczyński P., Szpyrka E., Rupar J., Rogozińska K., Kuźmenko A.
i Sadło S.: Post. Ochr. Roślin, 2007, 47, 38-41.

[2]

Sandra P., Tienpot B. i David F. [w:] Nowe horyzonty i wyzwania
w analityce i monitoringu środowiskowym. Namieśnik J., Chrzanow-

CHEMIA ● DYDAKTYKA ● EKOLOGIA ● METROLOGIA 2008

R. 13, NR 1-2

ski W. i Szpinek P. (red.): Centrum Doskonałości Analityki i Monito-
ringu Środowiskowego, Gdańsk 2003, 1-32.

[3]

Štajnbaher D. i Zupančič-Kralj L.: J. Chromatogr. A, 2003, 1015,
185-198.

[4]

Hercegová A., Dömötörová M. i Matisová E.: J. Chromatogr. A, 2007,
1153, 54-73.

[5]

Ferrer C., Gómez M.J., García-Reyes J.F., Ferrer I., Thurman E.M.
i Fernandez-Alba A.R.: J. Chromatogr. A, 2005, 1069, 183-194.

[6]

He Y. i Liu Y-H.: Chromatographia, 2007, 65, 581-590.

[7]

Pestycydy: występowanie, oznaczanie i unieszkodliwianie. Biziuk M.
(red.). Wyd. Nauk.-Tech., Warszawa 2001.

[8]

Cajka T., Hajslova J., Lacina O., Maštovská K. i Lehotay S.J.:
J. Chromatogr. A, 2008, 1186, 281-294.

[9]

Walorczyk S.: J. Chromatogr. A, 2007, 1165, 200-212.

[10]

Leandro C.C., Fussell R.J. i Keely B.J.: J. Chromatogr. A, 2005, 1085,
207-212.

[11]

Blasco C., Lino C.M., Picó Y., Pena A., Font G. i Silveira M.I.N.:
J. Chromatogr. A, 2004, 1049, 155-160.

[12]

Cencič Kodba Z. i Brodnjak Vončina D.: Chromatographia, 2007, 66,
619-624.

[13]

Przybylski C. i Hommet F.: J. Chromatogr. A, 2008, 1201, 78-90.

[14]

García-Reyes J.F., Ferrer C., Gómez-Ramos J.M., Molina-Díaz A.
i Fernández-Alba A.R.: Trends Anal. Chem., 2007, 26, 828-841.

[15]

Hercegová A., Dömötörová M., Matisová E., Kirchner M., Otrekal R.
i Štefuca V.: J. Chromatogr. A, 2005, 1084, 46-53.

[16]

Garrido Frenich A., Martínez Vidal J.L., Cruz Sicilia A.D., González
Rodríguez M.J. i Plaza Bolaños P.: Anal. Chim. Acta, 2006, 558,
42-52.

[17]

Liu L.-B., Hashi Y., Qin Y.-P., Zhou H.-X. i Lin J.-M.: J. Chromatogr.
B, 2007, 845, 61-68.

[18]

Zrostlíková J., Hajšlová J. i Čajka T.: J. Chromatogr. A, 2003, 1019,
173-186.

[19]

Guardia-Rubio M., Marchal-López R.M., Ayora-Caňada M.J.
i Ruiz-Medina A.: J. Chromatogr. A, 2007, 1145, 195-203.

[20]

Tahboub Y.R., Zaater M. F. i Barri T. A.: Anal. Chim. Acta, 2006,
558, 62-68.

[21]

Garrido Frenich A., Plaza Bolaños P. i Martínez Vidal J.L.: J. Chroma-
togr. A, 2008, 1203, 229-238.

[22]

Bordajandi L.R., Ramos J.J., Sanz J., González M.J. i Ramos L.:
J. Chromatogr. A, 2008, 1186, 312-324.

[23]

Van Der Lee M.K., Van Der Weg G., Traag W.A. i Mol H.G.J.:
J. Chromatogr. A, 2008, 1186, 325-339.

[24]

Kirchner M., Húšková R., Matisová E. i Mocák J.: J. Chromatogr. A,
2008, 1186, 271-280.

[25]

Walorczyk S. i Gnusowski B.: J. Chromatogr. A, 2006, 1128, 236-243.

[26]

Díez C., Traag W.A., Zommer P., Marinero P. i Atienza J.: J. Chroma-
togr. A, 2006, 1131, 11-23.

[27]

Anastassiades M., Maštovská K. i Lehotay S.J.: J. Chromatogr. A,
2003, 1015, 163-184.

[28]

SANCO/2007/3131:http://ec.europa.eu/food/plant/protection/resources
/qualcontrol_en.pdf (15.10.2008).

[29]

Anastassiades M.: http://www.quechers.com (15.10.2008).

[30]

González Rodríguez R.M., Rial-Otero R., Cancho-Grande B.
i Simal-Gándara J.: Food Chem., 2008, 107, 1342-1347.

[31]

Polski Komitet Normalizacyjny: http://www.pkn.pl (20.12.2008).