IMMUNOFENOTYPOWA

IMMUNOFENOTYPOWA

DIAGNOSTYKA BIAŁACZEK I

DIAGNOSTYKA BIAŁACZEK I

CHŁONIAKÓW NIEZIARNICZYCH

CHŁONIAKÓW NIEZIARNICZYCH

U DZIECI

U DZIECI

Anna Pituch-Noworolska

Zakład Immunologii Klinicznej

Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii

Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego

Kraków

ZAŁOŻENIA DIAGNOSTYKI

ZAŁOŻENIA DIAGNOSTYKI

IMMUNOFENOTYPOWEJ :

IMMUNOFENOTYPOWEJ :

• różne immunofenotypy komórek znajdujących się

w poszczególnych etapach różnicowania w
poszczególnych liniach szpikowych

• wysoka swoistość i specyficzność reakcji

przeciwciał monoklonalnych z antygenem

• monoklonalny rozrost prowadzący do białaczek i

chłoniaków nieziarniczych

• zaburzenia immunofenotypu - efekt zaburzeń

procesów regulacyjnych

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE:

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE:

• immunoglobulina mysia - w większości klasy IgG

(izotyp IgG1, IgG2a, IgG2b)

• sprzężone z fluorochromem: FITC, PE, APC,

PerCP, wykorzystywane w cytometrii

przepływowej

• sprzężone z enzymem (fosfataza, peroksydaza),

biotyną - wykorzystywane w immunohistochemii

• brak reakcji krzyżowych, śladowe reakcje

niespecyficzne (tło)

MATERIAŁ BADANY:

MATERIAŁ BADANY:

BIAŁACZKI:

• szpik kostny jako zasadniczy materiał

diagnostyczny

• krew obwodowa jeśli więcej niż 30% blastów
• inne np. płyn opłucnowy, mózgowo-rdzeniowy,
• wycinek zmiany w postaciach pozaszpikowych

(wątroba, skóra)

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE:

• węzeł chłonny lub wycinek guza
• szpik, krew obwodowa w fazie pełnego rozsiewu

MATERIAŁ BADANY:

MATERIAŁ BADANY:

ZALECENIA:

• pobranie materiału z pierwotnego źródła rozrostu

(szpik, guz, węzeł chłonny)

ZASTRZEŻENIA:

• materiał pobrany z wtórnego źródła komórek (np.

płyn opłucnowy, krew obwodowa) może zawierać

niereprezentacyjna populację komórek

białaczkowych,

• komórki np. we krwi mogą mieć nieco inny

fenotyp niż w szpiku (bardziej dojrzały, bez

koekspresji)

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

BIAŁACZKI:

linia limfocyta T:
CD2 - wczesny prekursor,
CD7 - wszystkie etapy różnicowania od wczesnego
prekursora
CD5 - wszystkie etapy różnicowania od wczesnego
prekursora
CD4 - grasiczy etap różnicowania, subpopulacja
dojrzałych limfocytów T
CD8 - grasiczy etap różnicowania, subpopulacja
dojrzałych limfocytów T
CD3 - dojrzały limfocyt T

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

BIAŁACZKI:

linia limfocyta B:
CD79a - cytoplazma - bardzo wczesny prekursor
CD19 - wszystkie etapy różnicowania od wczesnego
prekursora
CD10 - krótki etap różnicowania („common” ALL+)
CD20 - od etapu „CD10+” do dojrzałego limfocyta B
CD22 - dojrzały limfocyt B
HLA-DR - wszystkie etapy różnicowania od wczesnego
prekurosra
powierzchniowe łańcuchy immunoglobulin - sIg -
dojrzały limfocyt B
kappa lub lambda - łańcuchy lekkie - dojrzały limfocyt B

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

BIAŁACZKI:

mieloidalne:
CD33 - wszystkie etapy różnicowania od wczesnego
prekursora
CD13 - wszystkie etapy różnicowania od wczesnego
prekursora
CD15 - wszystkie etapy różnicowania od wczesnego
prekursora
CD14 - od prekursora do dojrzałego monocyta
CD41 - od prekursora do dojrzałego megakariocyta
HLA-DR - wszystkie etapy różnicowania z wyjątkiem
promielocytów i dojrzałych granulocytów
Glikoforyna - linia erytroblastyczna

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

BARWIENIE DWUKOLOROWE - OCENA
RÓWNOCZESNEJ EKSPRESJI DETERMINANT:

• CD45 FITC / CD14 PE
• CD2 FITC / CD3 PE
• CD5 FITC / CD7 PE
• CD4 FITC / CD8 PE
• HLA-DR FITC / CD34 PE
• CD10 FITC / CD19 PE
• CD20 FITC / CD22 PE
• CD13 FITC / CD33 PE
• CD15 FITC / CD14 PE
• kappa PE / lambda FITC

BARWIENIE TRÓJKOLOROWE:

„

dokładanie” przeciwciała dla determinanty typowej dla danej populacji:

CD34/HLA-DR/CD19,
CD34/HLA-DR/CD33

stałe zestawienia pozwalające na wybranie określonej populacji w

oparciu

o jedną determinantę i ocena dodatkowych ekspresji np.
CD19/CD20/CD10,
CD19/CD34/HLA-DR,
CD19/CD22/sIg(lub IgM),
CD19/kappa/lambda,
CD19/CD10/CD33

zestawienie wymuszone sytuacją np. niewielkiej liczby komórek:
CD3/CD4/CD8
CD34/HLA-DR/CD33
CD19/CD10/CD20
CD2/CD5/CD7
CD33/CD15/CD13

BARWIENIE CZTERO- I SZEŚCIO-KOLOROWE:

stałe zestawienia pozwalające na wybranie określonej populacji w
oparciu o jedną determinantę (restrykcyjną dla linii komórkowej)
oraz ocenę innych determinant np.

CD19/CD20/CD10/CD34
CD19/CD34/HLA-DR/CD2,
CD19/CD22/sIg(lub IgM),
CD19/kappa/lambda,
CD19/CD10/CD33/HLA-DR
CD3/CD4/CD8/CD2
CD3/CD5/CD7/CD10
CD3/CD2/CD34/HLA-DR
CD33/CD117/HLA-DR/CD7
CD33/CD13/CD15/CD14

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

POSZUKIWANIE CHOROBY RESZTKOWEJ (MRD):

np. dla common ALL o immunofenotypie: CD19, CD10,
CD20, HLA-DR, CD34 i CD33

• CD19/CD34/HLA-DR
• CD19/CD10/CD20
• CD19/CD22/sIg
• CD19/kappa/lambda
• CD19/CD34/CD33
• CD19/CD10/CD33
• CD19/CD20/CD33
• CD19/HLA-DR/CD33

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

BARWIENIA W NISKOZRÓŻNICOWANYCH
POSTACIACH BIAŁACZEK:

• barwienie powierzchniowe:

CD34, HLA-DR, CD117

+ markery liniowe wczesnych prekursorów: CD33,

CD13, CD19, CD2, CD5

• barwienia cytoplazmatyczne: MPO, TdT, CD79a

(i/lub CD22), CD3

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

DODATKOWE BARWIENIA W RZADKICH
POSTACIACH BIAŁACZEK:

• linia limfocyta T : CD16, CD56 (markery NK)
TCR

α/β

, TCR

γ/δ

• linia limfocyta B: łańcuch ciężki

µ

immunoglobuliny,

CD22 (cytoplazmatyczna ekspresja),

• linia mieloidalna: CD65, CD64, CD61

R1

R2

CD19

CD3

CD45

CD19

CD19

CD34

CD19

CD10

CD19

HLA-DR

HLA-DR

CD34

SIg

CD19

SZPIK PRAWIDŁOWY

SZPIK PRAWIDŁOWY

SZPIK PRAWIDŁOWY

SZPIK PRAWIDŁOWY

CD5

CD7

CD8

CD4

CD19

CD2

CD117

HLA-DR

CD33

CD15

CD34

CD33

CD13

CD14

CD45

KLASYFIKACJA OSTRYCH BIAŁACZEK U

KLASYFIKACJA OSTRYCH BIAŁACZEK U

DZIECI:

DZIECI:

• AUL:

(acute undiffentiated leukemia) - białaczka

niezróżnicowanokomórkowa

• ALL:

(acute lymphoblastic leukemia) - białaczka

limfoidalna: z linii limfocyta B i linii limfocyta T

• AML:

(acute myeloid leukemia) - białaczki mieloidalne

• AML/ALL, ALL/AML

: dwufenotypowe/dwulinowe

• AMLL

: (acute mixed lineage leukemia) - białaczki

mieszanoliniowe

IMMUNOLOGICZNA KLASYFIKACJA

IMMUNOLOGICZNA KLASYFIKACJA

OSTRYCH BIAŁACZEK U DZIECI:

OSTRYCH BIAŁACZEK U DZIECI:

NIEZRÓŻNICOWANOKOMÓRKOWA

CD34, HLA-DR, CC117

cytoplazmatyczna ekspresja*

MPO CD79a, TdT CD3, TdT

AMoL ALL-proB ALL-preT

LINIA LIMFOCYTA B:

LINIA LIMFOCYTA B:

ALL- proB -

CD34, CD19, HLA-DR, CD79a*, CD22*

common ALL -

CD19, CD10, HLA-DR, CD22, CD20

(CD34)

ALL- preB -

CD19, HLA-DR, CD20, CD22,

µ

*, (CD10)

transitional B cell leukemia

- CD19, HLA-DR, CD20,

CD22, sIg(G+A+M), (CD10)

ALL- B -

CD19, CD22, CD20, HLA-DR, sIg,

kappa/lambda

* - cytoplazmatyczna ekspresja
( ) - ekspresja w części przypadków

COMMON ALL

COMMON ALL

R1

CD19

CD3

CD45

CD19

HLA-DR

CD34

CD19

CD34

CD19

CD10

CD19

HLA-DR

COMMON ALL

COMMON ALL

CD22

SIg

CD8

CD4

CD5

CD7

CD34

CD33

CD33

CD15

CD20

CD5

Barwienie cytoplazmatyczne

R1

TdT

CD22

MPO

CD79a

MPO

CD3

LINIA LIMFOCYTA T:

LINIA LIMFOCYTA T:

ALL- preT -

CD34, HLA-DR, CD3*, CD2, CD5, CD7

ALL- T -

CD2, CD5, CD7, CD4/CD8, (CD10, CD3)

ALL- T (dojrzałe limfocyty T)

- CD2, CD5, CD7, CD4 lub

CD8, CD3

Komórki białaczkowe z linii limfocyta T wykazują
znaczną heterogenność immunofenotypów.

* - cytoplazmatyczna ekspresja
( ) - ekspresja tylko w części przypadków

R1

CD19

CD3

CD45

CD3

CD8

CD4

CD3

CD4

CD3

CD8

CD5

CD7

ALL-T

CD3

CD4

CD3

CD8

CD5

CD7

TdT

CD22

CD3

CD79a

Barwienie
cytoplazmatyczne

CD3

CD79a

MPO

CD79a

R1

HLA-DR

CD2

CD34

CD10

CD19

kappa

lambda

CD19

T-ALL - płyn opłucnowy

LINIA MIELOIDALNA:

LINIA MIELOIDALNA:

Klasyfikacja FAB:

AM

o

L -

białaczka mieloblastyczna niezróżnicowana

AM

1

L -

białaczka mieloblastyczna

AM

2

L -

białaczka mieloblastyczna z cechami różnicowania

AM

3

L -

białaczka promielocytowa

AM

4

L -

białaczka monoblastyczna

AM

5

L -

białaczka mielo-monoblastyczna

AM

6

L -

białaczka erytroblastyczna

AM

7

L -

białaczka megakarioblastyczna, megakariocytowa

LINIA MIELOIDALNA:

LINIA MIELOIDALNA:

Klasyfikacja immunofenotypowa:

AM

o

L -

HLA-DR, CD34, MPO*, CD33, CD13, (CD4, CD7)

AM

1

L -

HLA-DR, CD34, MPO*, CD33, CD13, (CD15)

AM

2

L -

HLA-DR, MPO*, CD33, CD13, (CD34)

AM

3

L -

MPO*, CD33, CD13

AM

4

L -

HLA-DR, MPO*, CD33, CD14, CD4, (CD13)

AM

5

L -

HLA-DR, MPO*, CD33, CD13, CD14, CD15,

(CD34, CD4)

AM

6

L -

CD33, CD13, Glikoforyna, (MPO*)

AM

7

L -

HLA-DR, CD33, CD13, CD41, CD61

* - ekspresja cytoplazmatyczna
( ) -ekspresja tylko w części przypadków

AML – bramka R 1

R1

R2

CD19

CD3

CD8

CD4

CD34

CD10

CD19

CD10

CD22

SIg

CD5

CD7

HLA-DR

CD34

AML – bramka R 1

CD117

HLA-DR

CD34

CD117

CD41

glikoforyna

CD7

CD33

CD33

CD15

CD34

CD33

CD2

HLA-DR

CD14

CD45

AML – bramka R 2

R1

R2

CD45

CD19

CD45

CD3

CD117

HLA-DR

HLA-DR

CD34

CD34

CD117

CD5

CD7

AML – bramka R 2

CD41

glikoforyna

CD7

CD33

CD33

CD15

CD34

CD15

CD34

CD33

CD13

CD14

CD45

AML ekspresja cytoplazmatyczna

R1

TdT

CD22

CD3

CD79a

MPO

CD79a

NIETYPOWE IMMUNOFENOTYPY:

NIETYPOWE IMMUNOFENOTYPY:

• NIEPEŁNY

- brak ekspresji determinanty obecnej w

prawidłowym różnicowaniu danej komórki

• KO-EKSPRESJA

- obecne jedna lub więcej

determinant z innej linii aniżeli linia
pochodzenia danej komórki

• HYPEREKSPRESJA

- nadmierna ekspresja

• ASYNCHRONICZNY

- równoczesna ekspresja

determinant z prekusorowego i dojrzałego
etapu rozwoju komórki

NIETYPOWE IMMUNOFENOTYPY:

NIETYPOWE IMMUNOFENOTYPY:

• NIEPEŁNY -

common ALL - CD19, CD10, CD34, brak

HLA-DR

• KO-EKSPRESJA:

common ALL+My - CD19, CD10, CD34, HLA-DR,

CD33, CD13
common ALL+Ly - CD19, CD10, CD20, HLA-DR,
CD2, CD7
ALL-T + My - CD2, CD5, CD7, CD13, CD33
AML + Ly - CD33, CD13, CD4, CD15, CD2

- CD33, CD13, CD15, CD19, CD10

NIETYPOWE IMMUNOFENOTYPY:

NIETYPOWE IMMUNOFENOTYPY:

• ASYNCHRONICZNY

ALL- T - CD34,CD2, CD5, CD7, CD10, CD4, CD3
ALL-B - CD34, CD19, CD20, CD22, HLA-DR, sIG,

• BIAŁACZKI DWULINIOWE:

AML/ALL-T

- CD2, CD4, CD5, CD7, HLA-DR, CD33,

CD13, MPO*

ALL-T/AML

- CD2, CD4, CD5, CD7, HLA-DR, CD33,

CD13, CD3*

AML/commonALL

- CD33, CD13, CD4, HLA-DR,

CD19, CD10, CD20, MPO*

commonALL/AML

- CD33, CD13, CD4, HLA-DR,

CD19, CD10, CD20, CD79a*

RZADKIE POSTACIE OSTRYCH BIAŁACZEK:

RZADKIE POSTACIE OSTRYCH BIAŁACZEK:

• AMLL

CD33, CD13, HLA-DR, CD15
CD2, CD4, CD5, CD7
CD19, CD10, CD22

• Występuje częściej u dzieci z niedoborami

immunologicznymi (zespół ataksja-teleangiektazja),
wadami genetycznymi - zespół Downa, zespołami
łamliwości chromosomów.

TRUDNOŚCI DIAGNOSTYCZNE BIAŁACZEK:

TRUDNOŚCI DIAGNOSTYCZNE BIAŁACZEK:

• diagnostyka w okresie noworodkowym
• dysplazje szpikowe (SAA, AA, MDS)
• białaczki rozwijające się na podłożu dysplazji
• pozaszpikowe postacie ostrych białaczek
• immunofenotypy nietypowe
• rzadkie postacie białaczek
• białaczki niezróżnicowane i niskozróżnicowane
• częściowe zajęcie szpiku (niski odsetek blastów)
• autofluorescencja
• słaba ekspresja determinant

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE (NHL) U DZIECI:

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE (NHL) U DZIECI:

• 3 zasadnicze typy:

z linii limfocyta T

z linii limfocyta B
anaplastyczny:

z linii limfocyta T

z linii limfocyta B
bezmarkerowy (null type)

większość NHL u dzieci należy do rozrostów o
wysokim stopniu złośliwości

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

• standardowy:

CD45 FITC
CD2 FITC / CD3 PE
CD4 FITC / CD8 PE
CD 5 FITC / CD7 PE
CD10 FITC/ CD19 PE
CD20 FITC/ CD22 PE
HLA-DR FITC
CD15 FITC
CD30 FITC
sIg (G+A+M)
kappa FITC / lambda PE

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

ZESTAW PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH:

• uzupełniający:

CD16 FITC / CD56 PE
T

αβ

FITC / T

γδ

PE

ALK-1
EMA
CD3

ε

CD34
CD33
CD13
bcl-2
bcl-6
CD79a*

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE Z LINII

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE Z LINII

LIMFOCYTA B:

LIMFOCYTA B:

• chłoniak typu Burkitta
• chłoniak B o wysokiej złośliwości (nie-

Burkitt)

• olbrzymiokomórkowy chłoniak B
• olbrzymiokomórkowy chłoniak B z

pierwotnym guzem w śródpiersiu

• pierwotny chłoniak wysiękowy (bardzo

rzadki)

• chłoniak B bogaty w limfocyty T

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE Z LINII

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE Z LINII

LIMFOCYTA B:

LIMFOCYTA B:

• chłoniak typu MALT ( z tkanki limfoidalnej

przewodu pokarmowego)

chłoniak o niskim stopniu złośliwości
występuje u starszych dzieci i młodzieży

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE Z LINII

CHŁONIAKI NIEZIARNICZE Z LINII

LIMFOCYTA T:

LIMFOCYTA T:

• z prekursorów limfocyta T:
wczesny tymocyt
tymocyt
dojrzały tymocyt

• olbrzymiokomórkowy, anaplastyczny

IMMUNOFENOTYP CHŁONIAKÓW Z LINII

IMMUNOFENOTYP CHŁONIAKÓW Z LINII

LIMFOCYTA B:

LIMFOCYTA B:

• CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD79a*,

µ.

*,

sIg (M, G, A), kappa lub lambda

• CD10 +/-, CD5 (u dzieci brak ekspresji), bcl-2,

bcl-6 - ekspresja zmienna,

IMMUNOFENOTYP KOMÓREK W:

IMMUNOFENOTYP KOMÓREK W:

olbrzymiokomórkowym chłoniaku B
bogatym w limfocyty T:

• limfocyty B: CD19, CD20, CD22, CD79a*,
sIg (M, G, A), kappa lub lambda,
(HLA-DR, CD10)

• limfocyty T: fenotyp dojrzałych limfocytów T,
(subpopulacje CD3+/CD4+ i
CD3+/CD8+, cechy aktywacji)

IMMUNOFENOTYP KOMÓREK W:

IMMUNOFENOTYP KOMÓREK W:

chłoniaku B typu MALT :

• CD19, CD20, CD22, CD79a*, sIg (M, G, A),

kappa lub lambda, część

µ

*, bcl-2

• brak ekspresji CD5, CD10

IMMUNOFENOTYP CHŁONIAKÓW Z LINII

IMMUNOFENOTYP CHŁONIAKÓW Z LINII

LIMFOCYTA T:

LIMFOCYTA T:

• CD2, CD4, CD8, CD5, CD7, CD6, CD3*,

• CD10 +/-, CD20 +/-, CD16, CD56,
• olbrzymiokomórkowe: CD30, ALK-1, EMA,
CD15, CD3

ε

• T

αβ

, T

γδ

ZASADY DIAGNOSTYKI CHŁONIAKÓW

ZASADY DIAGNOSTYKI CHŁONIAKÓW

NIEZIARNICZYCH :

NIEZIARNICZYCH :

• histologiczna wstępna ocena wycinka

(„intra”)

• immunofenotyp komórek uzyskanych z

wycinka

• ocena histologiczna łącznie z badaniami

immunohistochemicznymi

• ostateczne ustalenie rodzaju i formy

chłoniaka

TRUDNOŚCI DIAGNOSTYKI CHŁONIAKÓW

TRUDNOŚCI DIAGNOSTYKI CHŁONIAKÓW

NIEZIARNICZYCH :

NIEZIARNICZYCH :

• Trudności uzyskania materiału (wycinek z

guza, pobranie węzła chłonnego)

• Brak komórek chłoniaka w pobranym

materiale

• Postacie rzadkie i nietypowe
• Postacie anaplastyczne i

olbrzymiokomórkowe

• Chłoniaki nieziarnicze u nastolatków