Wytwarzanie enzymów

1.

Źródła enzymów

2.

Etapy procesu biotechnologicznego

3.

Synteza enzymów na poziomie

molekularnym

4. Podsumowanie

Enzymy możemy podzielić na:



enzymy produkowane i stosowane w dużych ilościach; są to

głównie enzymy hydrolityczne (glukoamylazy, amylazy,

proteazy, pektynazy) o stosunkowo niskich cenach rzędu kilku

dolarów za kilogram preparatu technicznego; produkcja w skali

światowej jest rzędu setek tysięcy ton



enzymy specjalne, produkowane w znacznie mniejszych

ilościach, za to w formie bardzo czystej; ceny są bardzo wysokie

rzędu od kilku do kilkudziesięciu dolarów za gram preparatu;

otrzymywanie enzymów tej grupy ma zwykle charakter

preparatywny i przeprowadzane jest w skali laboratoryjnej.

Ź R Ó D Ł A E N Z Y M Ó W

I Z O L O W A N E

Z R O Ś L I N

I Z O L O W A N E

Z O R G A N I Z M Ó W

Z W I E R Z Ą T

P R O D U K O W A N E

P R Z E Z

M I K R O O R G A N I Z M Y

Źródła enzymów

1.

Rośliny



Kiełkujące ziarna zbóż - amylazy



Rośliny tropikalne :
Carica papaya – papaina
Sok fig – ficyna
Łodyga ananasa – bromelaina



Rośliny uprawne
Chrzan – peroksydaza glukozowa
Jaś biały – ureaza
Cukinia – oksydaza askorbinianowa

Ze 100 kilogramów surowca otrzymuje się 1 do 10

gram enzymów.

Źródła enzymów

2. Organy zwierzęce



Ściany żołądków cieląt - podpuszczka, pepsyna



Wątroba bydlęca – katalaza



Trzustka –trypsyna, chymotrypsyna, lipaza

Z 10 kilogramów surowca otrzymujemy około

10 gram enzymów.

B

I O

M

A

S

A

M

I E

L

E

N

I E

Ł

U

G

O

W

A

N

I E

B

U

F

O

R

E

M

F

I L T

R

A

C

J

A

O

C

Z

Y

S

Z

C

Z

-

A

N

I E

P

R

O

D

U

K

T

 

3. Mikroorganizmy



Pleśnie:
Penicillium – dekstranaza, katalaza, oksydaza glukozowa

Aspergillus – α-amylaza, katalaza, oksydaza glukozowa ,

proteaza
Mucor miehei -podpuszczka
Trichoderma- celulaza



Bakterie:
Bacillus – α i β amylaza, acylaza penicylinowa



Promieniowce :
Actinomyces – enzymy cytolityczne



Drożdże
Saccharomyces – inwertaza, β galaktozydaza
Candida - lipaza

Z 1 kilograma surowca otrzymuje się

od 1 do 10 gram enzymu.

Źródła enzymów

Aspergillus

Saccharomyces

Candida

Bacillus

Trichoderma

Actinomyces

Mikroorganizmy jako źródła enzymów są bardziej

preferowane niż rośliny i zwierzęta ponieważ:



są generalnie tańsze w produkcji



łatwiejsza produkcja wielkoseryjna



uzyskane enzymy są bardziej przewidywalne, proces łatwiejszy w
kontroli



przewidywalna wydajność i aktywność



materiał roślinny i zwierzęcy zawiera więcej potencjalnie szkodliwych
składników niż mikroorganizmy np. związki fenolowe z roślin



łatwość ekstrakcji



niezawodność w dostarczeniu materiału

Mikroorganizmy jako

żywe fabryki

Proces biotechnologiczny można w ogólnym zarysie

przedstawić jako kombinację następujących operacji:

W Y B Ó R

M I K R O O R G A N I Z M U

P R Z Y G O T O W A N I E

P O Ż Y W K I

H O D O W L A

M I K R O O R G A N I Z M U

W Y D Z I E L E N I E

I O C Z Y S Z C Z E N I E

P R O D U K T U

Proces biotechnologiczny

Wybór

mikroorganizmu

Izolacja szczepów

Podstawowymi źródłami

mikroorganizmów są:



Środowisko naturalne



Kolekcje czystych kultur

Poszukiwanie drobnoustrojów w

środowisku naturalnym:

W Y B Ó R

M I E J S C A

P O B R A N I E

P R Ó B E K

M I K R O O R G .

W S T Ę P N A

O B R Ó B K A

P R Ó B E K

N A M N A Ż A N I E

D R O B N O U S T R .

S E L E K C J A

C Z Y S T Y C H

K U L T U R

T E S T O W A N I E

S Z C Z E P Ó W

Przy wyborze mikroorganizmu

uwzględniane są następujące kryteria:

1.

Nie może być patogenny

tzn. zawierać czynników chorobotwórczych

powodujących zaburzenia metabolizmu

komórkowego i tkankowego

Kryteria doboru mikroorganizmu

2

. Mało wrażliwy na

warunki otoczenia:



Zdolność mikroorganizmu do wzrostu w aparaturze

przemysłowej



Odporność na typ procesu



Odporność na stosowane materiały



Stabilność cech drobnoustrojów



Odporność na infekcje

Kryteria doboru mikroorganizmu

3.

Łatwy w hodowli:



Ważna jest charakterystyka odżywiania
mikroorganizmu



Łatwość wydzielenia produktu z medium
pofermentacyjnego



Brak toksycznych produktów metabolizmu

Kryteria doboru mikroorganizmu

4.

Produkcyjność

tzn. zdolność przetwarzania substratu w

produkt z wysoką wydajnością

Ulepszanie szczepów



Mutageneza mikroorganizmu



Inżynieria genetyczna

Mutageneza mikroorganizmu



jej celem jest wywołanie błędów

jej celem jest wywołanie błędów

w uniwersalnej cząsteczce

w uniwersalnej cząsteczce

kodującej informacje, jaką jest

kodującej informacje, jaką jest

DNA

DNA

Środki mutagenne :



Mutageny chemiczne:

kwas azotowy, analogi zasad (np.5-

bromouracyl,2-aminopuryna); czynniki

deaminujące, alkilujące; czynniki

interkalujące (bromek etydyny);

rodniki (np.nadtlenek wodoru)



Mutageny fizyczne:

Promieniowanie: ultrafioletowe,

gamma, X

Inżynieria genetyczna



Modyfikacja genomu



Krzyżowanie mikroorganizmów



Konstruowanie mikroorganizmów

niespotykanych w przyrodzie

Ulepszanie szczepów:



wywołanie mutacji

wywołanie mutacji



selekcji mutantów o polepszonych

selekcji mutantów o polepszonych

własnościach

własnościach

Proces biotechnologiczny

Przygotowanie

pożywki

Mikroorganizmy pobierają z medium

hodowlanego substancje niezbędne do

funkcjonowania komórek i budowy

materiału komórkowego

Głównymi składnikami pożywek są

:



substancje stanowiące źródło węgla



substancje stanowiące źródło energii



substancje stanowiące źródło azotu



składniki mineralne



różne substancje będące promotorami lub

prekursorami pożądanych produktów metabolizmu



związki zapewniające właściwe prowadzenie procesu
np. bufory stabilizujące pH, środki antypieniące

Proces biotechnologiczny

Hodowla

mikroorganizmów

Opcje prowadzenia procesu:

Opcje prowadzenia procesu:

1.

1.

Batch culture

Batch culture



Wszystkie substraty dodane do reaktora na początku

Wszystkie substraty dodane do reaktora na początku

2.

2.

Fed-batch process

Fed-batch process



Początkowo niski poziom biomasy

Początkowo niski poziom biomasy



Brak konieczności transportu biomasy

Brak konieczności transportu biomasy



Najczęściej stosowany

Najczęściej stosowany

3.

3.

Continous culture

Continous culture



Można kontrolować szybkość namnażania i poziom

Można kontrolować szybkość namnażania i poziom

biomasy.

biomasy.



Rzadko stosowany z powodu braku odpowiednich

Rzadko stosowany z powodu braku odpowiednich

technologii

technologii

Stosowane są dwa główne systemy

hodowli mikroorganizmów:



W podłożach stałych (HPS)



Hodowle wgłębne (HPC)

Zalety hodowli w podłożach stałych:



prosta aparatura



możliwość uzyskanie wyższych stężeń

produktów



uzyskiwanie wysokich wydajności

wytwarzania metabolitów dzięki wzrostowi

grzybów w warunkach zbliżonych do

naturalnych



wykorzystywanie surowców odpadowych

Wady hodowli w podłożach stałych :



utrzymanie jednolitych warunków wzrostu
drobnoustrojów

Zalety hodowli wgłębnej:



Łatwość utrzymania warunków jałowych



Możliwość kontrolowania stężenia substratu



Elastyczność prowadzenia hodowli

Wady hodowli wgłębnej :



straty materiału biologicznego



konieczność oddzielania biomasy
mikroorganizmów od płynu pohodowlanego



ograniczone możliwości zastosowania
procesów ciągłych

Jednym z rozwiązań jest prowadzenie

hodowli dwuetapowo:



etap pierwszy –następuje intensywne
namnożenie biomasy mikroorganizmów



etap drugi-prowadzony w odrębnym
reaktorze i zmienionych warunkach , w
którym następuje wytwarzanie enzymów

Proces biotechnologiczny

Wydzielanie i

oczyszczanie

Metody wydzielania i oczyszczania

substancji białkowych muszą:



Zapewniać zachowanie aktywności

biologicznej enzymu
oraz przeciwdziałać jego
dezaktywacji !

Produktami procesu

biotechnologicznego mogą być:



biomasa mikroorganizmów  w produkcji

enzymów wewnątrzkomórkowych
(intracelularnych)



produkt metabolizmu wydzielany do środowiska
hodowlanego  w produkcji enzymów

zewnątrzkomórkowych (extracelularnych)

F E R M E N T A C J A

M I K R O O R G A N I Z M Y

I N T R A -

C E L U L A R N Y

E N Z Y M

E X T R A -

C E L U L A R N Y

E N Z Y M

D E Z I N T E G R A C J A

F I L T R A C J A

Z A T Ę Ż A N I E

O C Z Y S Z C Z A N I E

S U S Z E N I E

P R O D U K T

Naturalnym dążeniem

technologicznym jest używanie

mikroorganizmów, które wydzielają

enzymy do środowiska hodowlanego

-produkują

enzymy extracelularne

!

Synteza enzymów na

poziomie

molekularnym

Synteza enzymów na poziomie

molekularnym

Gen

transkrypcja

mRNA

translacja

bialko

obróbka

posttranslacyjna bialko

egzocelurarne

Czynniki

negatywne

Hydroliza mRNA

Modyfikacja
sekwencji DNA
odpowiedzialnej za
syntezę enzymow
hydrolizujacych
mRNA (liaz)



DNA antisens



Si RNA

Jak im

zapobiegać ?

Czynniki

negatywne

Jak im

zapobiegać ?

Proteoliza

białek

Wprowadzenie

kofaktorów



jony metali, np.
żelaza, miedzi,
cynku, magnezu



koenzymy



grupy prostetyczne

Czynniki

negatywne

Jak im

zapobiegać ?

Tworzenie

adduktów

białkowych

Obniżenie stężenia

białek



obniżenie
temperatury
(21-25°C)



zwiększenie liczby
chaperonów

Czynniki

negatywne

Jak im

zapobiegać ?

Proteoliza

na zewnątrz

komórki

Stabilizacja



tworzenie mostków

disiarczkowych

Pomyślna realizacja

procesu

biotechnologicznego

wymaga harmonijnego

zgrania wszystkich

elementów składowych

Głównym kryterium efektywności procesu

technologicznego jest

ekonomika produkcji

.

Oznacza to, że nie wystarczy uzyskiwać

określony produkt, ale należy ten produkt

wytwarzać tak, aby produkcja przynosiła

zysk

!

Globalny rynek enzymów w latach

2002-2009

($ Millions)