ENZYMOLOGIA

dr Agnieszka Wikiera

WYKŁAD 1 20.02.2012

Literatura:

1. Elementy enzymologii Witwicki, Ardelt (pierwsze 3 wykłady)

2. Biochemia Harpera (rozdział enzymologia) (pierwsze 3 wykłady)

3. Biochemia Kączkowski (pierwsze 3 wykłady)

4. Biotechnologia Bednarski (kolejne 4 wykłady)

Egzamin pisemny, otwarte pytania, rysunki reakcji

Obecnie właściwie każda dziedzina stosuje katalizatory. Katalizatory tak wielokrotnie przyspieszają wszelkie reakcje i na tyle je poganiają, że wszędzie gdzie tylko się da próbuje się je „upchać”. Stąd w latach 90-tych ukuto takie powiedzenie jak „zielona chemia”. Bardzo popularna w tej chwili dziedzina, coraz popularniejsza z pogranicza różnych dziedzin, która próbuje różne reakcje chemiczne przerobić tak, żeby wykorzystywać enzymy, żeby je usprawniać. Dzięki temu, że działa katalizator taki jak enzym nie mamy reakcji ubocznych, tylko taki produkt o jaki nam chodzi. Dzięki enzymom możemy z nich usunąć znaczną część odpadów, które powstają w przemyśle, możemy je wtórnie wykorzystać, właśnie dzięki enzymom, to też dobrze dla środowiska. Wszystkie procesy z wykorzystaniem enzymów są procesami łagodnymi, nie trzeba stężonych kwasów, nie trzeba wysokich temperatur, więc oszczędzamy energię i oszczędzamy środowisko, bo stężone kwasy tworzą zakwaszone ścieki, z którymi trzeba coś potem zrobić. Enzymy temu wszystkiemu zapobiegają, stąd stają się coraz bardziej popularne we wszystkich dziedzinach, nie tylko technologii żywności. W technologii żywności mają jednakowoż jeszcze jedną dodatkową zaletę, taką że dzięki nim można otrzymywać produkty prozdrowotne tzn takie, których normalnie trudno byłoby je uzyskać, nie występują w stanie naturalnym. Podczas reakcji kwasowej czy innej powstaje przy okazji tyle produktów ubocznych, że trudno je izolować i byłoby to zbyt drogie. Natomiast enzym jest specyficzny, wystarczy tylko wiedzieć jaki enzym zastosować a możecie otrzymać Bóg wie co, tylko musicie wiedzieć co chcecie otrzymać. A żeby wiedzieć co chcecie otrzymać to powinniście znać metabolizm, bo wtedy wiecie co jest dobre, a co niekoniecznie. No więc to jest ta przyczyna, dla której przedmiot taki jak enzymologia pojawił się teraz na już drugi rok dla technologów żywności. Myślę, że bardzo słusznie, o tym się przekonacie w trakcie.

Katalizatory są to związki i różne substancje, które wielokrotnie przyspieszają reakcję, ale same w trakcie tych reakcji nie ulegają zmianom. Chyba, że stosujemy je bardzo długo, więc jeśli to jest metal który działa katalitycznie też może się zużyć. A dlaczego może dojść do tego zużycia? Bo np. jeśli działamy w jakiejś określonej wyższej temperaturze to on może się niszczyć. Może być odkładanie różnych związków na powierzchni tego katalizatora. Ale to nie jest rzecz, która zachodzi w trakcie każdej reakcji. Enzym czy katalizator nim dojdzie do tego, że zmieni swoje właściwości może wcześniej zkatalizować miliardy reakcji bez tych zmian. Czyli na początku i na końcu jest taki sam, a pośrodku to się dzieją z nim strasznie różne rzeczy.

Co jest konieczne żeby zaszła każda reakcja, nie tylko chemiczna? Muszą być spełnione 3(4) rzeczy:

1. Odpowiednie stężenie

2. Spotkanie się cząsteczek, czyli ich zderzenie

3. Cząsteczki muszą się zderzyć efektywnie, tzn. miejscami reaktywnymi. Nie każde zderzenie jest efektywne.

4. Cząsteczki muszą mieć odpowiednią energię, żeby przereagować.

Jakie cechy powinien mieć katalizator żeby przyspieszyć reakcję? 3 rzeczy jakie musi spełniać efektywnie działający katalizator:

1. Katalizator zatrzymuje na swojej powierzchni substraty. Jak w środowisku znajdzie się enzym czy inny katalizator to stężenie substratu nie jest równomierne w roztworze. Wokół katalizatora się zwiększa, katalizator ściąga te cząstki, ma do nich powinowactwo i na powierzchni je wiąże. Na powierzchni katalizatora jest ich dużo choć w środowisku ich może być mniej wtedy. 1 element czyli zagęszczenie substratu, czyli zwiększenie prawdopodobieństwa zderzenia się cząstek, bo jest ich więcej na jego powierzchni.

2. Co zrobić żeby zderzenia były efektywne? Katalizator nie wiąże cząsteczek przypadkowo, tylko wiąże je odpowiednimi miejscami, tak żeby reaktywne części substratu wystawały do siebie. Czyli ukierunkowuje ich zderzenia, raz że je wymusza (zwiększa ich częstotliwość), dwa ukierunkowuje je, bo wiąże je w ściśle określony sposób na swojej powierzchni.

3. Obniża energię aktywacji dzieląc ją na etapy, poprzez zmianę konformacji związanego na powierzchni substratu, dzięki czemu staje się on bardziej reaktywny. Katalizator dostarcza energii małymi porcjami.

Energia aktywacji jest to najmniejsza porcja energii, którą należy dostarczyć jednemu molowi substratów, aby każda cząsteczka z tych substratów stała się reaktywna. Czyli dla różnej ilości substratu będzie ona różna. Każdy katalizator umiejętnie tę energię aktywacji obniża.

Aby reakcja mogła zajść musi być termodynamicznie możliwa, tzn że energia substratów jest większa od energii produktów, czyli jak przebiega to ta różnica energii się uwolni. Mimo to trzeba trochę dostarczyć energii w postaci energii aktywacji.

(Wykres energii aktywacji ze slajdów)

Katalizatory przyspieszają tylko reakcje dynamicznie możliwe!!! Czyli takie, które i bez nich przebiegają, tylko tak powoli, że normalnie nie obserwujemy tego. Każda reakcja w naszym organizmie przebiega właśnie z udziałem katalizatora.

Każda reakcja przebiega z jakąś stałą równowagi.

10^-4

A + B ↔ AB

10^-6

czyli stężenie produktu AB jest 100 razy większe niż substratu w stanie równowagi

Enzym przyspiesza reakcję w każdą stronę o tyle samo, czyli nie powoduje przesunięcia stałej równowagi reakcji. Powoduje tylko przyspieszenie jej osiągnięcia!!!

Zachodzi reakcja np. przez anhydrazę węglanową

CO₂ + H₂O → H₂CO₃

a tą reakcję katalizuje katalaza

H₂O₂ + H₂O₂ → 2 H₂O + O₂↑

(Rys 1.2 ze slajdów - szybkość przebiegu reakcji z katalizatorami)

Katalizator, który najbardziej obniża energię aktywacji, jest najefektywniejszym katalizatorem.

Jeżeli energia aktywacji obniży się o 5,7 kJ to wówczas szybkość reakcji rośnie 10-krotnie.

Tak więc katalaza przyspieszy reakcję rozpadu nadtlenku wodoru (75,2 - 8,4 ≈ 67, a 67/5,7≈ 11,75) ponad 11 razy.

Bardzo dobrymi katalizatorami są jony metali. Są to metale 4, 5 i 6 okresu układu okresowego, które nie mają zapełnionych powłok (d), dzięki temu są takie bardziej reaktywne. Żeby były jeszcze bardziej reaktywnie proszkuje się je. Używa się więc sproszkowanej platyny (czyli czerń platynowa), pallad sproszkowany (czyli czerń palladowa). Są to katalizatory nieorganiczne i są one mniej reaktywne, mniej wygodne w użyciu, dlatego że nie rozpoznają substratów.

Kwas jest dobrym katalizatorem → jony H⁺, jony OH^- to wszystko są katalizatory, ale jeżeli dodacie to skrobi kwasu to on będzie hydrolizował tą skrobię, jeśli dacie do sacharozy to też ją będzie hydrolizował. Kwas nie rozpoznaje substratu. A więc katalizatory nieorganiczne mogą katalizować reakcje poboczne. Inne katalizatory nieorganiczne to np. zasady, jony

Jeśli dacie do skrobi inwertazę to nic się nie stanie, bo nie rozpozna jej jako substratu, nie będzie katalizować skrobi bo jest ściśle specyficzna, więc to jest przewaga katalizatorów organicznych. Będą one katalizowały tylko te reakcje, które chcemy, żadnej pobocznej. Nie trzeba więc bardzo oczyszczać roztworu bo i tak enzym sobie znajdzie w nim substrat i tylko jego będzie przekształcał. Ponadto katalizatory organiczne przyspieszają reakcje dużo bardziej niż nieorganiczne.

Niektóre cząsteczki RNA mogą mieć zdolności katalityczne. Są one nazywane rybozymami. W zależności od budowy znanych jest kilka takich rybozymów.

Introny typu I i II są rybozymami mają zdolność samowycinania się. Również rRNA w rybozymie to katalizator. Potrafi katalizować tworzenie wiązań peptydowych (na rybozymie odbywa się synteza białek) i okazuje się, że to nie tak do końca tylko enzym, tylko głównie rybozym to katalizuje.

Czym rybozymy różnią się od enzymów?

Przede wszystkim budową. Rybozymy są zbudowane z czterech różnych nukleotydów, w związku z tym są mniej specyficzne niż enzymy, ponieważ enzymy mogą być zbudowane z 21 aminokwasów, a więc mogą mieć dużo więcej kształtów.

Cząsteczki RNA są przez to trochę gorsze od enzymów i mniej specyficzne. Potrafią katalizować reakcje hydrolizy, czyli rozcinania z przyłączeniem wody, lizy czyli rozcinania bez przyłączania wody, ligacji czyli tworzenia wiązań i transferu, czyli przenoszenie nukleotydu z jednego łańcucha nukleotydów na drugi (jeden łańcuch nukleotydowy się wydłuża a drugi skraca). Czyli rybozymy potrafią katalizować 4 rodzaje reakcji i prawie zawsze substratem dla większości są cząsteczki RNA, ewentualnie DNA (za wyjątkiem tego rybozymu - rRNA w rybozymie) . Niczego innego nie rozpoznają. Czyli rybozymy katalizują te 4 rodzaje reakcji na substracie jakim jest RNA i DNA. Czyli mogą hydrolizować RNA lub hydrolizować DNA (inaczej wydłużać łańcuch). Dużo łatwiej jest im wydłużać RNA niż DNA. O tym, że rybozym może być katalizatorem podejrzewano od lat 80-tych Thomas Cech w 1989 roku dostał nagrodę nobla za odkrycie rybozymów.

Dlaczego jest to takie ważne? Biolodzy zastanawiali się co było pierwsze kwasy nukleinowe czy białko. No bo białko buduje wszystko, a więc każdą reakcję tworzenia cukru katalizuje białko, czyli enzym. To skąd się wzięło to białko skoro ono powstaje na RNA i DNA ale żeby powstało RNA i DNA to też potrzebne jest to białko żeby to skatalizować, proces replikacji, transkrypcji i translacji. Dopiero te odkrycia Cech'a pozwoliły stwierdzić, że RNA są to pierwsze katalizatory jakie były na Ziemi i potrafiły robić więcej. I to dzięki nim białka, które na nich powstały wyspecjalizowały się, bo ten rybozym katalizował proces syntezy białka. Dopiero później powstał ten enzym, który się wyspecjalizował (dzięki swojej budowie) i przejął funkcję rybozymu.

Odcinki RNA między rybozymami mogą być różnej długości. Największe rybozymy mają po 350-390 nukleotydów, a mniejsze kilkanaście nukleotydów. Niektóre z rybozymów mogą działać tylko w obecności białka. To białko jest wtedy ich kofaktorem, czyli utrzymuje ich strukturę. Praktycznie wszystkie rybozymy współdziałają z jonami metali. Obecność metalu podnosi ich reaktywność, bo metal łatwo oddysocjowuje i przyłącza protony i to umożliwia reakcję. Bo grupy aminowe, które są w nukleotydach nie są tak bardzo reaktywne jak grupy aminowe w białkach (aminokwasach).

Katalizatory bardzo przyspieszają reakcję a enzymy jeszcze bardziej. (slajd 1.3) Jeżeli reakcja ma energię aktywacji 125 kJ/mol to trwa ona mniej więcej 38 h. Jeżeli ze 125 obniżymy do 62 to trwa 0,007 sekundy. Tyle jest szybsza reakcja z użyciem katalizatora, czyli to ustalanie stanu równowagi reakcji następuje tyle razy szybciej (czyli przy reakcji nie katalizowanej dopiero po 38 h można by było oznaczyć produkt, a przy reakcji katalizowanej już po 0,007 sekundy przy odpowiednio czułej metodzie oznaczenia).

PRZERWA

Przykłady rybozymów działających katalityczne (slajd 1.4)

Co cechuje te rybozymy w stosunku do innych cząsteczek RNA. Jak patrzycie na tą budowę to co widzicie czego zwykle nie ma w RNA. Te literki długie C to są nukleotydy, tak się zaznacza zasady azotowe w nukleotydach. To jest w każdym. Różnicą jest to, że na drugich (długich) odcinkach są sparowane co wcale nie jest stałe dla RNA tylko dla tRNA. Nie tylko tRNA się paruje tu widzicie cząsteczki RNA które również mają na zasadzie komplementaryzacji sparowane zasady i przez to różne kształty. Taki rybozym jak ten pierwszy ze względu na swój kształt nazywa się spinką do włosów, drugi ze względu na swój kształt nazywa się głowa młotka (przez łepek, gdzie ma niesparowane nukleotydy. I jeszcze jedna rzecz, czyli to na jakiej zasadzie rozpoznają substrat na zasadzie komplementaryzacji par zasad, w związku z tym tylko takie związki mogą katalizować. Czyli to że adenina się łączy z uracylem, a guanina z cytozyną. A więc tu macie te dwa przykłady (slajd 1.5 i 1.6) , tu jest przykład już inaczej narysowany, tu jest to RNA cape to jest rybozym, który działa tylko w połączeniu z białkiem. Jest tu zaznaczone na niebiesko to białko, które pomaga utrzymać stałą strukturę rybozymowi, czyli pełni funkcje kofaktora, a nie katalizatora w tym przypadku. Tu macie reakcje o której Wam mówiłam, że na zasadzie komplementaryzacji macie jakiś rybozym jego 5'-koniec i drugi skrótowo H, i tu macie przykład jakieś innego. Kropeczkami zaznaczone są wiązania wodorowe (guanina-cytozyna). Nie będę wymagać od Państwa reakcji dla rybozymów.

Budowa enzymów

Enzymy są bardziej reaktywne ze względu na swoją budowę. Enzymy są zbudowane z aminokwasów, ponieważ wszystkie enzymy są białkami.

21 aminokwasów:

holina, metionina, cystyna, walina, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, histydyna, prolina, seryna, tyrozyna, tryptofan, lizyna, arginina, leucyna, izoleucyna, glicyna...

Wzór ogólny aminokwasu (grupa aminowa, węgiel alfa i grupa karboksylowa, a do tego jest przyłączone R, czyli to co różni każdy aminokwas od siebie)

H₃N-CH-COOH

|

R

(Znać budowę aminokwasów, budowę cukrów i ogólnie jakie reakcje tworzą, jak się wiążą ze sobą, nauczcie się jednego tłuszczu i jednego białka, to rozpiszecie wszystkie reakcje).

Czym aminokwasy się łączą ze sobą żeby utworzyć białko? Wiązania peptydowe to wiązania kowalencyjne: O

=

H₃N-CH-C-N-CH-COO^-

|

R

Wiązanie peptydowe ma swoje właściwości, które wpływają na właściwości enzymu, mianowicie tlen względem wodoru jest zawsze w pozycji trans. Wiązanie między węglem a azotem jest wiązaniem pośrednim między pojedynczym a podwójnym, to znaczy jest krótsze niż pojedyncze, ale trochę dłuższe niż podwójne wiązanie. Wszystkie atomy tworzące to wiązanie - tlen, węgiel, azot i wodór leżą w jednej płaszczyźnie, czyli jest ono koplanarne. Między węglem a azotem nie ma rotacji.

Ilość aminokwasów i ich kolejność to jest struktura pierwszorzędowa. Ile ich jest i jakie są decyduje o strukturze pierwszorzędowej, która jest stabilizowana tylko i wyłącznie wiązaniami kowalencyjnymi, czyli wiązaniami peptydowymi, mocnymi.

Żadne białko nie jest tylko prostym długim łańcuchem. Białka w roztworze chcą się jakoś ułożyć, dlatego że nie każde środowisko pozwala na to żeby wystawiać grupy hydrofilowe albo hydrofobowe. Wśród tych aminokwasów są hydrofilowe i hydrofobowe. Jeśli białko jest w środowisku wodnym to będzie się tak zwijać i tak układać żeby schować aminokwasy hydrofobowe. Jeżeli będzie na odwrót i w środowisku hydrofobowym to odwrotnie, żeby wystawić to co hydrofobowe a ukryć to co hydrofilowe, bo ona inaczej nie mogłaby tam przetrwać. No więc białka przyjmują strukturę wyższego rzędu, czyli na początku zwijają się w struktury drugiego rzędu regularne czyli alfa helisa, beta kartka, spinka do włosów i ewentualnie nieregularna struktura natywnego kłębka (wszystkie są jednakowo ważne). Czyli jak macie alfa helisę to takie aminokwasy, które w strukturze pierwszorzędowej są jeden po drugim to łączą się wiązaniami wodorowymi co czwarty w strukturze alfa helikalnej (pierwszy z czwartym, drugi z piątym, trzeci z szóstym itd.). Tych wiązań tworzy się bardzo dużo, dlatego mimo że są słabe bo tylko wodorowe jak jest ich dużo to będą stabilizowały strukturę. Jak będą co czwarty, to wiązania ułożą się po jednej stronie, w związku z tym jak coś się zwinie po jednej stronie następuje obrót wokół osi i tworzy się w ten sposób spirala. Czyli dlatego się tworzy, że wiązania wodorowe tworzą się co czwarty aminokwas. Wiązanie wodorowe między ugrupowaniami peptydowymi

(rysunek z notatek)

(czyli ten z tego węgla karboksylowego łączy się z azotem z wiązania peptydowego, ale tego czwartego w kolejności aminokwasu)

czyli każdy tlen i każdy azot angażuje się w tworzenie wiązania i powstanie alfa helisa, która pozwala na dość mocne skręcenie białka

Innym przykładem struktury regularnej jest struktura beta kartki, która wygląda jak papier złożony w harmonijkę (ściąga). Widzicie że to już jest takie, białko samo z siebie takie jest, te wiązania tworzą się pod kątem 120°, więc ono samo zawsze jest takie. Białko może się zwinąć w alfa helisę albo utworzyć beta kartkę. Żeby się zwinęło białko w beta kartka to łańcuch zakręca i idzie pod spodem a potem znowu zakręca. np. łańcuch białka zakręca jeśli jest prolina którą nazywamy łamaczem helisy, nie pozawala na tworzenie wiązań wodorowych, bo wygląda inaczej niż wszystkie inne aminokwasy

To jest prolina łańcuch boczny jest połączony nie tylko z węglem alfa, tylko jeszcze z azotem i wtedy ten azot nie może utworzyć wiązania wodorowego. Stąd prolina zaburza inne struktury i tworzy się np. struktura spinki do włosów. Łańcuch się zawija i idzie w inną stronę. I jak już tak zawinie to znajdujące się pod sobą łańcuchy białkowe mogą się wiązać wiązaniami wodorowymi (między ugrupowaniami peptydowymi nie między łańcuchami bocznymi) Takich łańcuchów pod sobą może być od 2 do najczęściej 6 (czasem zdarza się więcej ale rzadko).

To że białka taką strukturę przyjmują łatwo zaobserwować bo np. białko keratyna, która tworzy włosy jest rozciągliwa, bo pękają wiązania wodorowe. Natomiast keratyna tworząca paznokcie ma strukturę beta kartki i jeśli pękną tam wiązania wodorowe to białko dzieli się na warstwy i dlatego paznokieć się rozwarstwia. W przypadku alfa helisy gdy pękną wiązania wodorowe białko się rozciąga, bo ma zwiniętą strukturę jak sprężyna.

Drugorzędową nieregularną strukturą białka jest struktura natywnego kłębka. Ta struktura jest również stabilizowana wiązaniami wodorowymi ale w zupełnie przypadkowych miejscach, dlatego białko wygląda jak taki kłębek. Ta struktura jest równie ważna jak inne, jest po prostu nieregularna.

To były struktury drugorzędowe, ale żaden z enzymów nie kończy na strukturze drugorzędowej, bo to by im nie umożliwiało w pełni działania. Wszystkie enzymy posiadają trzeciorzędową strukturę,a duża ich część nawet czwartorzędową strukturę.

Trzeciorzędowa struktura to jest ukształtowanie już takich łańcuchów z drugiej struktury w przestrzeni. Czyli jak macie strukturę alfa helikalną, np. kabel od telefonu i jak go zwinięcie jeszcze bardziej to powstanie struktura trzeciorzędowa, stabilizowana wiązaniami kowalencyjnymi - mostkami disiarczkowymi. Czyli cysteina z cysteiną, czyli ta struktura utworzy się wtedy jeżeli białko posiada przynajmniej kilka cystein. Mostek disiarczkowy tworzą się tylko między cysteinami, bo to jedyne aminokwasy, które mają tak położoną grupę SH, żeby móc utworzyć wiązanie.

Jakie jeszcze wiązania? Oddziaływania hydrofobowe, są one bardzo ważne bo to one narzucają tworzenie się struktur trzeciorzędowych. Bo białko będzie się zawsze tak skręcać żeby do środowiska wystawiać te reszty, które są odpowiednie do środowiska (w środowisku wodnym hydrofilowe, a w środowisku hydrofobowym odwrotnie).

Również wiązania wodorowe mogą się tworzyć pomimo tego że wiązania peptydowe są już zaangażowane w tworzenie wiązań, bo tworzą struktury drugorzędowe, to przecież są jeszcze łańcuchy boczne aminokwasów, które również mogą tworzyć takie struktury. Oczywiście jeśli się zbliżą na odległość wystarczającą do utworzenia wiązania.

Niektóre enzymy tworzą strukturę czwartorzędową

Struktury czwartorzędowe to są zawsze więcej niż jedno białko, więcej niż jeden łańcuch połączone innym niż kowalencyjne wiązanie, bo jeśli łańcuchy łączą się wiązaniami kowalencyjnymi to jest to dalej uważane za strukturę pierwszorzędową. Czyli jeśli mamy łańcuch peptydowy z wiązaniami peptydowymi i nagle mostkiem disiarczkowym przyłączy się drugi łańcuch tak jest np. w przypadku chymotrypsynie. Ma ona strukturę pierwszorzędową ponieważ są 3 łańcuchy ale połączone mostkami disiarczkowymi. Natomiast w strukturze czwartorzędowej te oddzielne łańcuchy peptydowe, oddzielne białka, nie są przyłączone kowalencyjnie, tylko poprzez siły Van der Valsa, czyli na dużej powierzchni się zbliżają do siebie, oddziaływania hydrofobowe, siły jonowe, czyli minus przyciąga plus a plus minusa.

O takich białkach, o takich enzymach mówimy że mają strukturę oligomeryczną. Każde z białek tworzące tą strukturę nosi nazwę monomeru. Czyli jeżeli białko ma strukturę czwartorzędową to znaczy, że jest oligomerem zbudowanym z wielu merów. Mer, czyli ta podjednostka, to pojedyncze białko.

Oczywiście taką strukturę najchętniej tworzą te białka, które mają dużo aminokwasów hydrofobowych są w środowisku hydrofilowym. Jeżeli białko ma w łańcuchu pierwszorzędowym więcej niż 30% aminokwasów hydrofobowych, to nie może się tak powyginać żeby je wszystkie schować i jakieś mu wystają. Dlatego szuka innego białka, które też ma takie wystające grupy hydrofobowe. Chowa hydrofobowe aminokwasy między struktury, czyli struktury asocjują wtedy, po to żeby hydrofobowe aminokwasy ukryć. Czyli jeżeli białko ma więcej niż 30% aminokwasów hydrofobowych prawie na pewno stworzy struktury czwartorzędowe, wiele enzymów, nawet nie wiem czy nie większość tworzy struktury czwartorzędowe.

Monomer to jest pojedyncze białko - ma pierwszo-, drugo- i trzeciorzędową strukturę

Oligomer to jest białko zbudowane z kilku połączonych podjednostek

Co daje enzymom to że się łączą w monomery, no bo wiele enzymów jest monomerami? Wykazano że np. od tego czy białko będzie występowało w formie monomerycznej czy oligomerycznej zależy jego aktywność, bo białko może (31.54) dysocjować i oddysocjowywać te jednostki, to nie musi być związane z denaturacją. I teraz okazało się, że niektóre enzymy jeśli oddysocjują od nich podjednostki, np. jakieś to zmieniają aktywność, czyli ich natura w każdej podjednostce może być inna. Takie enzymy są wielofunkcyjne, mogą być takie, że mają inna aktywność.

Może być tak, że te podjednostki są takie same, wtedy o takim białku czy enzymie mówimy, że jest homooligomeryczny. No więc jest homooligomerem, czyli zbudowany z takich samych podjednostek. I jeżeli są zbudowane z takich samych podjednostek to oznacza właściwie, że w każdej z tych podjednostek jest takie samo centrum aktywne, taka sama aktywność, no bo muszą być identyczne. Jeżeli jest heterooligomerem, bo takie też są (to znaczy że podjednostki mogą być różne) to w białkach najczęściej część podjednostek jest podjednostkami regulatorowymi (pełni funkcje regulatorowe), a część podjednostkami o funkcji katalitycznej (bo mają centrum aktywne).

Białka mogą być zbudowane od 2 do o takich słyszałam, że jest 24 podjednostek.

Białka mogą być monomeryczne. Monomer może mieć różne struktury w sobie no bo każde białko może mieć kawałek takiej struktury czy innej, a na końcu zwinąć się w trzeciorzędową strukturę jeszcze. (slajd 1.6) Zwykle takimi falami oznacza się alfa helisę, strzałkami beta kartkę. Jak strzałki są w jednym kierunki to znaczy że beta kartki są równoległe, a jak przeciwne to antyrównoległe czyli koniec jednego białka jest inny niż koniec drugiego.

To jest białko oligomeryczne (slajd 1.7), czyli łączą się te podjednostki (monomery) ze sobą.

Jeżeli białko jest oligomerem to te podjednostki mogą ze sobą oddziaływać. Nawet jeśli są takie same, identyczne, czyli białko jest homooligomerem.

Jeśli mamy białko zbudowane z dwóch podjednostek i jeśli jedna z nich przyłączy substrat to zmienia swoją konformację, tak że ta druga jeszcze chętniej chce przyłączyć substrat. Czyli to będzie zmieniało kinetykę działania enzymu, o tym będziemy mówić przy kinetyce działania enzymu, ale chciałam powiedzieć, że podjednostki enzymów na siebie oddziaływują, mogą ale nie muszą. Może być tak, że enzym zwiąże substrat i ta podjednostka nie działa na koleżankę, tak żeby chętniej wiązała substrat i też go przekształcała. Ale najczęściej jest tak że działa. Jak macie enzym zbudowany z czterech podjednostek, to jak jedna z nich przyłączy substrat, to zmienia swoją konformację, tak że pozostałe tak się ustawiają żeby też przyłączyć substrat. Będą chciały związać substrat jeszcze bardziej niż na początku. Wtedy jest jednoprzejściowy model oddziaływania, ale może być też tak że jak jedna podjednostka przyłączy, to tylko najbliższą aktywuje do przyłączenia substratu, a jak już obie mają przyłączony substrat to wtedy aktywują następną podjednostkę. Czyli następuje to sekwencyjnie, czyli po kolei każda następna podjednostka zyskuje większe powinowactwo. Czyli jednostki mogą oddziaływać na siebie w sposób jednoprzejściowy, czyli jak jedna przyłączy to wszystkie podjednostki już stają się bardziej aktywne, bądź w sposób sekwencyjny, czyli łańcuszkiem.

Kataliza to jest jedna z możliwości enzymu, niesamowicie ważna i niezastąpiona, ale oprócz tego ma wiele innych twarzy. Chciałam wam opowiedzieć o towarzyskiej stronie enzymów, ponieważ nie są one pojedyncze, tylko jest ich więcej. Enzymy mają na swojej powierzchni różne domeny.

Zmiana konformacji jest to nietrwała zmiana kształtu, podczas której nie zachodzi tworzenie nowych wiązań ani rozrywanie już istniejących, tylko tak się przegrupowują atomy, że troszkę się zmienia kształt. To nie jest zauważalne dla naszego oka, ale niewątpliwe wyczuwalne dla substratów.

Domena kawałek białka, kawałek jakiejś sekwencji aminokwasowej odpowiedzialny za jakąś konkretną funkcję. Jest to układ aminokwasów (może mieć 100 a nawet 200 aminokwasów w białku) i wydziela się te domeny ze względu na budowę czyli np. są w iluś tam białkach takie same, czyli są konserwatywne, taka sama sekwencja aminokwasów, taki sam kształt jaki ma białko na tym odcinku. Są to domeny ze względu na konformację wyróżnione, a drugie ze względu na funkcje, czyli jakaś sekwencja która w danym białku pełni konkretną funkcję.

Czyli domena jest to fragment łańcucha peptydowego odpowiedzialny za jakąś konkretną funkcję, więc w wielu białkach, które są różnymi białkami, z przypadku w różnych enzymach może pojawić się ta sama domena. Powiedzmy że 3 enzymy które co innego robią chcą być związane z błonami, np. enzymy łańcucha oddechowego, to enzymy związane z błonami i muszę mieć coś wspólnego co pozwoli im się na tych błonach zakotwiczyć. I to co mają to są domeny, w każdym taka sama. Domena rozpoznająca fosfolipidy, bo to na fosfolipidach się zakotwiczają. Czyli fragmencik białka, łańcucha peptydowego pełniący określone funkcje. Ta sama domena może być w bardzo różnych białkach ale umożliwia im tą samą rzecz np. zakotwiczanie się na błonach, rozpoznawanie innego białka.

Domeny można podzielić na domeny rozpoznające krótkie sekwencje aminokwasowe w innych białkach, które umożliwiają enzymom kontakt, żeby się na chwilę skontaktować dopóki tamten nie zmienił konformacji, że jego domena się trochę wykrzywiła i już się nie poznają.

Enzymy uczestniczą w czymś takim jak przekaz sygnałów w komórce. Jeżeli do komórki dochodzi z zewnątrz sygnał w postaci np. podniesionego poziomu insuliny we krwi. Na powierzchni komórki są białka, przyłaczają się do swojego receptora który jest enzymem i zmieniają jego komformacje ten niekoniecznie musi katalizować inna rekacje wystarczy że się przyłączy do innego enzymu i przeniesie te zmiane konformacji na niego.

Występują sekwencje rozpoznające krótkie sekwencję do takich najczęściej występujących na enzymach należą domeny SH2 to jest domena która rozpoznaje fosfotyrozynę i przyłącza się do niej ale oprócz fosfotyrozyny identyfikuje jeszcze co najmniej 3 aminokwasy. Jeśli jakieś białko ma ufosforylowana tyrozynę to inne białko które ma domenę SH2 może się tam przyłączyć. Bardzo ważnymi domenami są SH3 one umożliwiąją kontakt z białkiem mającym dużo proliny. SH3 rozpoznaje sekwencje prolina..aminokwas …aminokwas…prolina i dopiero wtedy się przyłącza. (Domeny ww rozpoznają tez prolinę sekwencja prolina, prolina, jakiś aminokwas, prolina.)? Ich rolą jest nie tylko katalizowanie reakcji ale również komunikacja. Aby katalizować reakcję to trzeba odbierać jakieś sygnały, każdy proces który zachodzi w naszym organizmie musi być regulowany, wiec obecność tych domen pozwala na regulację z różnych stron.

Domeny rozpoznające inne domeny czyli znacznie większą sekwencję.

Domeny umożliwiające komplementaryzację czyli umiejscowienie we właściwym miejscu, są to domeny wiążące swoiście fosfolipidy. Fosfolipidy budują błony komórkowe w naszych organizmach, w komórkach(wewnątrzkomórkowe błony). Enzym błonowy zaczepia się dzięki domenie PX, PH, może rozpoznać fosfolipid i tam się zakotwiczyć. Jego domena rozpoznaje ujemnie naładowane reszty fosfolipidów, na zasadzie wiązań wodorowych tam się zaczepia. Istnieją jeszcze domeny umożliwiające enzymom rozpoznanie cząsteczek DNA i RNA. To są domeny rozpoznające kwasy nukleinowe i to są takie domeny jak spinka, ? zamek leucynowy?.

Ze względów katalitycznych najważniejsza częścią w enzymie są jest centrum aktywne, ponieważ umożliwia przeprowadzania reakcji. Centrum aktywne spełnia wszystkie założenia domeny. Centrum aktywne w białku monomerycznym to bardzo głeboka szczelina a na powierzchni tej szczeliny przy powierzchni białka zwykle znajdują się aminokwasy hydrofobowe po to aby do centrum dostawała się woda. W centrum aktywnym większości enzymów nie ma wody, woda jeśli by tam była utrudniałaby oddziaływania elektrostatyczne. Większość enzymów nie posiada w centrum aktywnym wody. Do wyjątków należą te dla których woda jest drugim substratem czyli hydrolaty, najczęściej stosowane w technologii. Centrum aktywne jest utworzone przez aminokwasy, które w strukturze pierwszorzędowej mogą być bardzo od siebie oddalone. W każdym centrum aktywnym ze względu na jego funkcje można wyróżnić 2 miejsca, jedno to jest miejsce kontaktowe- miejsce wiązania substratu a drugie to jest miejsce katalityczne tu zachodzi reakcja. Aminokwasy najczęściej występujące w centrum aktywnym to aminokwasy mające łatwo dysocjujące grupy. Aminokwasy występujące w centrum aktywnym można podzielić na aminokwasy kontaktowe czyli takie które zbliżają się na odległość wiązań oraz aminokwasy katalityczne. Kontaktowe wiążą substrat a katalityczne odpowiadają za akt katalityczny. Kolejne to aminokwasy pomocnicze, które już nie zbliżają się tak do substratu ale pełnią ważne funkcje w odpowiednim ułożeniu substratu w centrum aktywnym i aminokwasy strukturalne to te które zapewniają stałą, niezmienną strukturę enzymu.

Kofaktory to aminokwasy te, które wiążą substrat i pełnią funkcje katalityczne, aminokwasy pomocnicze i aminokwasy strukturalne. I o ile strukturalne i pomocnicze mogą być różne o tyle aminokwasy pełniące funkcje katalityczne bądź biorące udział w wiązaniu (czyli aminokwasy kontaktowe), w większości enzymów są takie same, powtarzają się. No więc zawsze są to takie aminokwasy, które mają łatwo dysocjujące grupy, bo to umożliwia łatwe przyłączanie substratu.

I teraz jakie to będą aminokwasy? Lizyna, metionina, bo one same z siebie mają ładunek dodatni, mają w łańcuchu bocznym dodatkową grupę aminową, która może łatwo dysocjować. Kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, bo mają grupę karboksylową w bocznym łańcuchu, glutamina i asparagina, bo tworzy się sól z nich i mają grupę aminową wtedy (znać wzory aminokwasów), seryna i tyrozyna, bo mają grupę -OH, cysteina i metionina, bo mają grupę tiolową -SH, histydyna, bo ma dodatkowy azot w łańcuchu bocznym, który łatwo dysocjuje. Te aminokwasy zawsze są w centrum aktywnym, w różnych konfiguracjach będą pełniły swoje funkcje.

Już wiemy co to jest centrum aktywne. Dla wielu enzymów samo białko nie zapewnia jeszcze struktury w pełni funkcjonalnej. Wiele enzymów do tego by funkcjonować dobrze i sprawnie wymaga obecności koenzymu.

KOENZYMY - są to cząsteczki niebiałkowe, bardzo często związki organiczne o budowie nukleotydowej. Mogą to być same witaminy albo jony metali, które znajdują się w centrum aktywnym. Odpowiadają w enzymie za ataki katalityczne, za akcję katalityczną. Enzym rozpoznaje substrat, on katalizuje reakcję, ale w czasie reakcji tak naprawdę najczęściej zmienia się koenzym, to on bezpośrednio może oddawać swoje wodory lub je przyłączać (jak koenzymy NAD, NADP). Koenzymy znajdują się w centrum aktywnym, albo przynajmniej jakaś ich część należy do centrum aktywnego. Biorą bezpośredni udział w reakcji - rozszerzają kierunki działania enzymu, mogą być dostarczycielami protonów i elektronów bądź ich biorcami. Do takich koenzymów, które bezpośrednio przenoszą protony i elektrony w czasie reakcji (czyli w reakcjach utleniania i redukcji będą uczestniczyć )należą: FAD, NAD, hem (rysunki). Oprócz tego mogą przenosić fragmenty własnych struktur. Przykładem takim jest ATP (adenozynotrójfosforan) - jest to związek makroergiczny,ale przede wszystkim też koenzym - zapewnia reakcje katalizowane przez kinazy. Rysunek z tablicy:

ATP

GLUKOZA ------ GLUKOZO-6-FOSFORAN + ADP

Enzymów się nie zapisuje w reakcjach, bo są takie same przed jak i po reakcji. Ale zapisuje się koenzymy. ATP będzie tu dawcą fosforu. Enzym działający to kinaza glukozowa, która rozpoznaje glukozę. Jej koenzymem jest ATP. I ten enzym rozpoznał glukozę i dzięki niemu koenzym oddaje fosfor na glukozę i dzięki temu może ona zostać w komórce, bo w komórkach nie ma glukozy ufosforylowanej, taka tylko w krwi może być. A glukozę transportuje się do komórek, żeby mogły się pożywić. Koenzym zmienia się w trakcie reakcji (oddał 1 resztę fosforanową). FAD, NAD przenoszą wodory, ATP, UTP - przenoszą reszty fosforanowe.

Część koenzymów jest przyłączona do enzymów w sposób trwały, nie może oddysocjować. O takich koenzymach mówi się czasem, że są to grupy prostetyczne. Wtedy enzym żeby móc zachować swą aktywność musi umieć katalizować reakcję również odwrotną. A skoro koenzym zmienia się w trakcie tej reakcji, to enzym musi katalizować jeszcze inną reakcję żeby koenzym wrócił do poprzedniego stanu. Inaczej byłby enzymem jednokrotnego użytku.

Rysunek z tablicy:

H₂O₂ O₂

FAD FADH₂

GLUKOZA (w formie beta) ----------- kwas glukonowy

Enzym w tej reakcji to oksydaza glukozowa. Jej koenzymem jest FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy) Jest on trwale związany z białkiem enzymu. Co on robi? Zabiera 2 wodory z glukozy i staje się FADH₂. Jak temu wielohydroksyalkoholowi (właściwie to aldehydowi, bo glukoza to aldehyd) Jeżeli zabierze się aldehydowi wodory to się go utlenia. Jeśli się go utleni to stanie się kwasem glukonowym. Taki enzym -oksydaza glukozowa, już dalej nie mógłby działać (zmienił się bo jego koenzym się zmienił, choć białko się nie zmieniło to koenzym się zmienił) i jak już zabrał 2 wodory to gdzie kolejne 2 przyłączy? Nigdzie. Jest wtedy nieprzydatny a tak być nie może. Więc co on zrobi? Ten sam enzym potrafi katalizować jeszcze jedna reakcję. Drugim jego substratem jest tlen. Te reakcje zacznie katalizować tylko wtedy, gdy w środowisku będzie tlen. Jak będzie ten tlen O₂ to ten sam enzym przeniesie te wodory na tlen, (który jest w powietrzu) i powstanie H₂O_2. Koenzym wrócił do pierwotnej postaci i enzym może dalej działać. Jeden substrat enzymu to glukoza, a ten drugi substrat to tlen i to on umożliwia regenerację koenzymu. Bo skoro koenzym jest trwale związany to musi się na tym samym enzymie zregenerować.

Dla wielu koenzymów jest tak, że są bardzo słabo związane z enzymem i łatwo oddysocjowują, bez szkody dla enzymu i mogą się regenerować na innym enzymie. Czyli jeden koenzym może działać z różnymi enzymami. Takie koenzymy, które nie są stale związane z enzymem umożliwiają w komórkach i we wszystkich związkach tzw. sprzężenie reakcji (koenzymatyczne). Sprzęgają różne reakcje. To bardzo ważne zadanie koenzymu.

Rysunek sprzężenia koenzymatycznego :

CH₃-CH₂-OH NAD dwie cysteiny (enzymem dehydrogenaza alkoholowa)

CH₃-O=O NADH+H H₃N -CH-COOH

H CH2

C

C

CH₂

H₃N-CH-COOH

Z alkoholu (etanol) powstaje aldehyd. Jest to reakcja utleniania. Enzymem katalizującym tą reakcję musi być jakaś oksydoreduktaza. Koenzymem będzie NAD. Po reakcji otrzymujemy NADH+H. Enzym - dehydrogenaza alkoholowa jest bardzo specyficzny. Nie umie niczego innego rozpoznać oprócz tego swojego substratu - alkoholu. Koenzym jest łatwo z nim związany, nie mocno, oddysocjowuje, może się przyłączać do innego enzymu (do reduktazy np.).

Powstały dwa aminokwasy połączone mostkiem disiarczkowym czyli cystyna. Takie coś stabilizuje strukturę III rzędową białka. I teraz, jeżeli ten koenzym oddysocjuje od tej dehydrogenazy, przyłączy się do reduktazy cystynowej to odda na nią te dwa wodory. Dlatego oddysocjowuje, bo chce się pozbyć tych wodorów-inaczej nie mógłby działać. Więc odda wodory i otrzymamy dwie cząsteczki cysteiny. Jest to sprzężenie koenzymatyczne. Czyli koenzymy umożliwiają sprzęganie dwóch różnych reakcji, jeśli są luźno połączone ze strukturą białka enzymowego. Ponadto stabilizują strukturę białka, usztywniając je (sa dość dużymi cząsteczkami). Enzym, który normalnie działa z koenzymem, jeśli ten koenzym ma przyłączony to jest mniej wrażliwy na zmiany np. temperatury, pH, bo jest sztywniejszy.

Trzeba umieć identyfikować koenzymy i znać ich nazwy! Również znać funkcje koenzymów(na przykładach).

Często funkcje koenzymów pełną METALE. Mogą być w centrum aktywnym i odpowiadać za przyłącznie substratu, szczególnie metale dwuwartościowe. Najczęściej w centrum aktywnym spotyka się takie metale jak miedź, magnez, żelazo, cynk, mangan, kobalt. Metale mogą być w centrum aktywnym lub pełnić funkcje katalityczne czyli służyć jako dawca bądź biorca protonów w akcie katalitycznym, ale mogą też występować poza centrum aktywnym i wtedy pełnią funkcje głównie strukturalne. Mniej więcej 25% znanych enzymów wymaga do swojego działania obecności jonów metali. Te jony metali jeśli są w centrum aktywnym mogą uczestniczyć nawet w wiązaniu substratu, wtedy substrat może być wiązany na 4 różne sposoby:

1) Mamy enzym, który ma metal i dopiero przez ten metal wiązany jest substrat, Czyli to nie enzym łączy bezpośrednio substrat, tylko metal, który jest w centrum aktywnym.

2) Enzym przyłącza substrat, ale żeby mógł zkatalizować reakcję musi jeszcze przyłączyć metal, bo ten metal będzie zmieniał konformację czy ładunek substratu. Ten typ kompleksu występuje tylko w enzymach aktywowanych przez ten metal.

Enzymy ze względu na to, jak bardzo potrzebują metalu dzielimy na metaloenzymy, które mają stale związany metal w swojej strukturze i enzymy aktywowane przez metal czyli mogą oddysocjowywać.

3) Jest metal, który jest w strukturze enzymu i jak on tam jest to dopiero wtedy enzym może wiązać substrat. Metal w tym wypadku jest poza centrum aktywnym i nie bierze udziału w reakcji. Jednak jak go nie ma enzym nie może przyjąć prawidłowej struktury i przyłączyć substrat.

4) Mostek cykliczny przez metal. Metal w centrum aktywnym, ale substrat się przyłącza i do enzymu i do metalu.

Wykazano, że jeśli w jakiś enzymach zastąpi się jeden metal innym metalem to taki enzym zmienia swoje właściwości katalityczne (przykład karboksypeptydazy A, która jest przykładem proteazy -katalizuje białka. W centrum aktywnym występuje cynk. Jak cynk wymieni się na rtęć to nie będzie katalizy białek, tylko bedziebędzieność esterazowa).

Adenina, ryboza - trzy reszty fosforanowe. Oddaje jedna będzie ADP, oddaje dwie będzie ANP czyli jeden koenzym, który jest dawcą własnych grup. Nie, że przenosi z jednych na drugi, tylko własne nawet oddaje w czasie reakcji enzymatycznej.

*koenzymy przenoszące wodory:

-FADH₂

-NADH

-hem

-CoQ

-LipS₂

Oprócz nich są takie koenzymy, które przenoszą reszty inne niż wodory (np. wielowęglowe). Będą tu działały enzymy transferazy, mające za zadanie przenosić jedna grupę ze związku na inną grupę. Z nimi będą współpracować takie koenzymy jak np. CoA-SH, bo przenosi acyle lub acetyle.

*przenoszące inne grupy:

-ATP

-DPT (difosforan tiaminy)

-THF (kwas tetrahydrofoliowy)

-CoA-SH (przenosi acyle czyli reszty kwasów tłuszczowych, acetyl jest to reszta dwuwęglowa kwasu dwuwęglowego -octowego; mówimy acylo-koenzym A jeśli ma przyłączony substrat)

-PLP

-kobamid/kobalamina

-biotyna (przenosi reszty jednowęglowe i jest witaminą B7)

-fosforan pirydoksalu

SLAJDY

(Żywienie człowieka ma wiedzieć jakie witaminy w jakich koenzymach i znać wzory)

Siła witamin polega na tym, że są częściami koenzymu. Jak ich nie ma to te koenzymy nie mogą istnieć, być syntetyzowane, nie działają prawidłowo więc nie ma reakcji katalizowanych przez enzymy, które je wymagają. I stąd bierze się potrzeba, stad jest później szkorbut bo nie było witaminy C, nie dlatego, że jak nie ma witaminy C to się białko niszczy, tylko dlatego, że enzym katalizujący hydroksylacje proliny nie może działać (bo jego koenzymem jest witamina C).

---