WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA

CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH

MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

ENZYMOLOGIA  

Kierunek:  

Technologia  Żywności    

i  Żywienie  Człowieka  

semestr  I        

Wykład  4  

Kinetyka  reakcji  enzymatycznych  

oraz  inhibitory

 

Zakres  materiału  ENZYMOLOGIA  

1.  Biochemia,  Autor:  Jeremy  Berg,  Lubert  Stryer,  John  L.  Tymoczko,    

PWN  Warszawa  (2005)  

Rozdziały:  

8.  Enzymy::  podstawowe  pojęcia  i  kinetyka    

9.  Strategie  katalityczne    

10.  Strategie  regulacyjne::  enzymy  i  hemoglobina    

2.  Ćwiczenia  z  enzymologii  i  technik  biochemicznych.  Bartoszewska,  Niziołek,  

Paszowski,  Wydawnictwo  SGGW  

3.  Handbook  of  Food  Enzymology  –  ed.  John  R.  Whitaker  et  al.,  CRC  Press;  (2002)  

4.  Enzymes  in  Food  Technology  -­‐  ROBERT  J.  WHITEHURST,    BARRY  A.    

 LAW,  Editors  Sheffield  Academic  Press  CRC  Press  (2002)    

3.  Food  chemistry  -­‐  Hans-­‐Dieter  Belitz,  Werner  Grosch,  Peter    

 Schieberle,  Springer  (2004)  

€

k = ve

−ΔG

RT

Energia  aktywacji    

Energia  aktywacji            -­‐  to  różnica  energii  swobodnej  między  

stanem   przejściowym   a   substratem.   Minimalna   energia   jaką  

musi  posiadać  substrat,  aby  mógł  przereagować.    

Stan   przejściowy   –   stan   o   maksymalnej   energii   na   wykresie  

postępu   reakcji.   Dla   reakcji   enzymatycznych   stanem    

przejściowym  jest  kompleks  enzym-­‐substrat  ES.    

Stałą  szybkości  opisujemy  wówczas  równaniem:  

Szybkość  reakcji  jest  miara  ilości  zużywanych  substratów  lub  

powstających  produktów  w  jednostce  czasu.  Opisujemy  ją  

wzorem:  

• 

Gdzie:                                        -­‐  współczynniki  stechiometryczne  reagentów  

 

 

 A  -­‐  substraty  

 

 

 B  -­‐  produkty  

Doświadczalnie  wyznaczone  równanie  tego  typu  nosi  nazwę  

równania  kinetycznego,  przyjmuje  ono  postać:  

Współczynnik  k  nosi  nazwę  stałej  szybkości  reakcji.    

€

v = −

dc

A

v

A

dt

=

dc

B

v

B

dt

€

v = k A

[ ]

a

B

[ ]

b

...

Kinetyka  reakcji  

ν

A  

A        



ν

B  

B  

Przez  scałkowanie  powyższego  równania  otrzymamy:    

Szybkość  reakcji  chemicznej  a  stałą  szybkości  reakcji  

Co  z  tego  

wynika?  

Rzędowość  reakcji  chemicznych  

Rząd  reakcji  względem  danego  składnika,  to  wykładnik  potęgi,  do  której  podniesione  
jest  stężenie  reagenta  w  równaniu  kinetycznym.  

Całkowity  rząd  reakcji  to  suma  poszczególnych  rzędów  
 a  +  b  +...  w  równaniu  kinetycznym.  

a     –   kinetyka   reakcji   I   rzędu   (linia   prosta   –   zależność   wprost   proporcjonalna   pomiędzy  

badanymi  czynnikami)  

b    –  kinetyka  mieszana  zależność  nieproporcjonalna  
c   –   kinetyka   reakcji   zerowego   rzędu   (szybkość   reakcji   osiąga   V

max

  –   reakcja   przebiega  

zgodnie  z  kinetyką  zerowego  rzędu)  

     
K

m

 -­‐  charakteryzuje  daną  aktywność  enzymu  

-­‐  jest  to  takie  stężenie  substratu  [mol/l],  przy  którym  reakcja  biegnie  z  szybkością  równą  

połowie  szybkości  maksymalnej  

-­‐  jest  to  takie  stężenie  substratu,  przy  którym  połowa  miejsc  aktywnych  jest  obsadzona  

substratem  

-­‐  dla  większości  enzymów  wartości  leżą  w  przedziale  od  10

-­‐1

 do  10

-­‐7

 M  

Reakcja  enzymatyczna  –  szybkość  zależy  od  stężenia  substratu  

Model  Michaelisa-­‐Menten  opisuje  właściwości  

kinetyczne  wielu  enzymów  

1.  Dla  wielu  enzymów  szybkość  katalizy  V  zmienia  się  ze  stężeniem  substratu  [S].  

V  jest  definiowane  jako  liczba  moli  produktu  utworzonego  w  czasie  1  sekundy.  

2.  Przy   stałym   stężeniu   enzymu,   V   prawie   liniowo   zależy   od   [S],   kiedy   [S]   jest  

małe.  Przy  dużych  [S],  V  jest  prawie  niezależne  od  [S],    

3.  W  1913  roku  Leonor  Michaelis  i  Maud  Menten  zaproponowali  prosty  model,  

odpowiadający   takiej   charakterystyce   kinetycznej.   Podstawową   cechą   tego  

modelu   jest   założenie,   że   kompleks   ES   jest   koniecznym   etapem   pośrednim  

procesu   katalitycznego.   Najprostszy   model,   który   odpowiada   właściwościom  

kinetycznym  wielu  enzymów,  wygląda  następująco  

Mechanizm  katalizowanej  reakcji  z  udziałem  
jednego  substratu.  E  –  enzym,  S  –  substrat,  P  –  

produkt,  k

1

 i  k

3

 –  stałe  szybkości  reakcji  

przebiegających  w  prawą  stronę,  k

2

 –  stała  

szybkości  reakcji  zachodzącej  w  lewą  stronę.    

Enzym  E  łączy  się  z  substratem  S  tworząc  
kompleks  ES;  reakcję  charakteryzuje  stała  

szybkości   k

1

.   Istnieją   dwie   możliwe   drogi  

rozpadu   kompleksu   ES.   Może   on  

dysocjować   do   E   i   S   ze   stałą   szybkości   k

2

 

lub   może   się   przekształcać,   tworząc  
produkt   P   ze   stałą   szybkości   k

2

.   Zakłada  

się,   że   produkt   reakcji   nie   może   ulec  
powrotnemu  przekształceniu  w  wyjściowy  

substrat,   warunek,   który   jest   spełniany   w  
początkowym   etapie   reakcji,   zanim  
stężenie  produktu  stanie  się  znaczące.  

Rekacja  enzymatyczna  (równanie  kinetyczne)  

Stała  Michaelisa:  

Ks  -­‐  stała  dysocjacji  kompleksu  ES  do  E  i  S  
-­‐  właściwa  miara  siły  tworzenia  kompleksu  ES,  czyli  powinowactwa  enzymu  do  

substratu  

Ks  -­‐  miara  powinowactwa  E  do  S,  ale  tylko  w  pewnych  warunkach  (tylko  wtedy,  kiedy  k

2

 

>  k

3

)  =  k

2

/k

1

 =  Ks  

• 

K

m

 (stała  Michaelisa)  opisuje  tworzenie  i  rozpad  kompleksu  ES    

• 

jest  miarą  powinowactwa  enzymu  do  substratu  

• 

niska  wartość  K

m

 –  silne  powinowactwo  enzymu  do  substratu  

• 

wysoka  wartość  K

m

 –  słabe  powinowactwo  enzymu  do  substratu  

Stała  Michaelisa  

Gdy                                                to:    

więc:  

                                                     Stała  Michaelisa-­‐Menten                    
 jest  to  stężenie  substratu  (mol/dm

3

),  przy  którym  szybkość  reakcji  

enzymatycznej  jest  równa  połowie  jej  szybkości  maksymalnej.    

Stała  Michaelisa  -­‐  znaczenie  

Równaniem  Michaelisa-­‐Menten:    
gdzie:  V  –  szybkość  początkowa,    

S  –  stężenie  substratu,    
K

m

 –  stała  Michaelisa-­‐Menten.  

Równanie  Michaelisa-­‐Mentena  

1.  Przy  niewielkich  stężeniach  substratu,  kiedy  [S]  jest  znacznie  mniejsze  niż  K

M

,  V=  [S]  V

max

/  

K

M  ;  

oznacza  to,  że  szybkość  reakcji  jest  wprost  proporcjonalna  do  stężenia  substratu.  

2.  Przy  dużych  stężeniach  substratu,  kiedy  [S]  jest  dużo  większe  od  K

M

,  V  =  V

max

,  co  oznacza,  

że  szybkość  jest  maksymalna  i  niezależna  od  stężenia  substratu.    

3.  Znaczenie  K

M

 wynika  z  równania  przedstawionego  wyżej.  Kiedy  [S]  =  K

M

,  wtedy  V  =  V

max

/2.  

Stąd  K

m

 jest  równe  takiemu  stężeniu  substratu,  dla  którego  szybkość  reakcji  osiąga  połowę  

swojej  wartości  maksymalnej.    

4.  Inaczej  mówiąc  K

M

 jest  to  takie  stężenie  substratu,  w  którym  połowa  miejsc  aktywnych  jest  

obsadzona.  

5.  Liczba  obrotów  enzymu  oznacza  liczbę  cząsteczek  substratu  przekształconych  w  produkt  

reakcji  na  jednostkę  czasu,  w  warunkach  pełnego  wysycenia  enzymu  substratem.    

 

   

Wpływ  stężenia  substratu  na  szybkość  reakcji  przy  stałym  stężeniu  enzymu  -­‐  

krzywa  wg  Lineweavera-­‐Burka.  

Teoria  Lineweavera  –  Burka  

max  

Pomiar  aktywności  enzymu  –  polega  na  określeniu  albo  zaniku  substratu,  

albo  powstania  produktu  w  zależności  od  czasu.  Aby  wyznaczyć  aktywność  

enzymu  należy  więc  zmierzyć  szybkość  reakcji.  

Jednostka  aktywności  enzymatycznej  –  katal;  1  katal  (kat)  wywołuje  w  

określonych  warunkach  reakcji  przemianę  1  mola  substancji  w  ciągu  jednej  

sekundy.    

Liczba  obrotów  –  określa  liczbę  cząstek  substratu,  które  w  jednostce  czasu  

(minuta  lub  sekunda)  ulegają  przekształceniu  przez  jedną  cząstkę  enzymu.    

€

v = −

dc

A

v

A

dt

=

dc

B

v

B

dt

Jednostki  enzymatyczne  

Jednostka   enzymu   (jednostka   enzymatyczna),   U   (ang.   unit,   w   pol.   także   J)   –  

jednostka  aktywności  enzymów  wprowadzona  w  1964  przez  Komitet  Nazewnictwa  

Międzynarodowej   Unii   Biochemii   i   Biologii   Molekularnej.   Zdefiniowana   przez  

Komisję  Enzymową  w  1961.  
Jeden   U   to   ilość   enzymu   katalizująca   przemianę   1   μmola   substratu   w   czasie   1  

minuty.   Zwykle   przyjmuje   się   określone   warunki:   temperaturę   30   °C,   dane   pH   i  

maksymalne  wysycenie  enzymu  substratem.  
Ponieważ  minuta  nie  jest  jednostką  SI,  do  określania  aktywności  enzymów  zaleca  się  

stosowanie  katala  (od  1978).  

1  U  =  1  μmol/min  =  1/60  μkatala  =  16,67  nanokatala  

UWAGA:   Jednostka   enzymu   U,   nie   ma   nic   wspólnego   z   IU   (Internawonal   Unit;  

Jednostka  Międzynarodowa),  miarą  aktywności  substancji  biologicznie  czynnych.  

Inhibicja  

Inhibicja   polega   na   blokowaniu   przez   inhibitor   współdziałania   składników  

uczestniczących  w  reakcji  enzymatycznej:  

-­‐  enzym,    

-­‐  substrat(y),    

-­‐   koenzym.    

Szybkość  reakcji  enzymatycznej  zależy  od  czynników  hamujących,  które  dzieli  się  

na  działające  niespecyficznie  i  specyficznie.    

PODZIAŁ  INHIBICJI  

1.  Nieodwracalna  

2.  Odwracalna    

-­‐  kompetycyjna  

-­‐  niekompetycyjna  

-­‐   akompetycyjna  

-­‐   mieszana  

INHIBICJA  AKTYWNOŚCI  ENZYMÓW  umożliwia:  

-­‐  identyfikację  reszt  istotnych  dla  aktywności  enzymów  

-­‐  poznanie  mechanizmów  działania  enzymów  

-­‐  działanie  leków  i  czynników  toksycznych  

-­‐  mechanizm  kontroli  aktywności  enzymów  

1.  INHIBICJA  KOMPETYCYJNA  (WSPÓŁZAWODNICZĄCA)  

!

!

"!#!$!

"$!

"!#!%!

#!

&!

"$!

'()*!(+)*,-.!

/

&

!

[S

o

]  

V

o

K

m

’  

K

m

V

max

K

m

  (K

m

spp

)  

nowa   tzw.   pozorna  

wartość   K

m  

wyznaczona   w  

obecności  

inhibitora  

jest  

wyższa   w   porównaniu   z  
rzeczywistą  K

m

 Wykres  Michaelisa-­‐Menten  

•  inhibitor  kompetycyjny  zmniejsza  szybkość  katalizy  enzymatycznej  przez  zmniejszenie  liczby  

cząsteczek  enzymu  wiążących  substrat,  

•  inhibicję  kompetycyjną  można  znieść  przez  zwiększenie  stężenia  substratu  
•  V

max

 nie  ulega  zmianie,  zwiększa  się  K

m  

PRZYKŁADY:  
a)  działanie  malonianu  CH

2

(COOH)

2  

na  dehydrogenazę  bursztynianową  -­‐  (CH

2

)

2

(COOH)

2  

 

Przykład   ten   jest   wyjątkowym   przypadkiem.   Inne   przypadki   inhibitorów  

konkurencyjnych  wykazują  zazwyczaj  mieszane  działanie,  inhibitora  konkurencyjnego  
i  akompetycyjnego.  

b)   hamowanie   syntezy   białka   przez   analogi   aminokwasów   białkowych   (aminokwasy  

niebiałkowe),  np.  niektóre  leki,  niektóre  pestycydy,  antybiotyki  

c)   hamowanie   oksydazy   polifenolowej   przez   kwas   para-­‐hydroksybenzoesowy  

(brązowienie  warzyw  i  owoców)  

2.  INHIBICJA  NIEKOMPETYCYJNA  (NIEWSPÓŁZAWODNICZĄCA)  

!

E    

ES  

E  +  P  

+  I  

EI  

K

I

+  S    

+  I  

+  S    

K

I

E  +  P  

ESI  

•   wiąże   się   w   miejscu   katalitycznym   (nie   w   miejscu   wiązania   substratu)   lub   poza   nim,  

wywołując  zmiany  konformacyjne  niekorzystne  dla  miejsca  katalitycznego  

•   inhibitor   nie   jest   strukturalnie   podobny   do   substratu,   nie   może   wiązać   się   w   miejscu  

wiązania   substratu,   tylko   w   miejscu   katalitycznym   lub   poza   nim   =>   obniża   szybkość  

maksymalną  katalizy  

•   zmniejsza   szybkość   katalizy   enzymatycznej   poprzez   zmniejszenie   liczby   obrotów   enzymu  

(obniża   stężenie   funkcjonalnego   enzymu,   pozostała   część   funkcjonalnego   enzymu  

zachowuje  się  jak  bardziej  rozcieńczony  roztwór  enzymu)  

•  inhibitor  niekompetycyjny  nie  wpływa  na  przyłączanie  substratu  do  enzymu  –  nie  wpływa  

na  powinowactwo  E  do  S  

•  nie  zmienia  K

m

,  obniża  V

max  

Nie   można   znieść   inhibicji   niekompetycyjnej   zwiększając   stężenie   substratu,   lecz   poprzez  

związanie  inhibitora  przez  inny  związek  

PRZYKŁADY:  
a)  działanie  jonów  metali  ciężkich,  np.  Cu

2+

,  Hg

2+

,  Ag

2+

,  które  wiążą  się  z  gr.  –SH  cysteiny  w  

miejscu  katalitycznym  lub  poza  nim  (tworzą  się  merkaptydy)  

b)  działanie  cyjanków,  azydków  i  fluorków,  które  wiążą  jony  metali  np.  Fe

2+

 lub  Fe

3+

 

(tworzą  one  kompleksy  z  jonami  Fe  podobne  do  żelazicyjanków  i  żelazocyjanków)  

c)  działanie  czynników  chelatujących  dwuwartościowe  kawony,  np.  EDTA  

(etylenodiaminotetraoctan)  wiążący  jony  Mg

2+

.  

!

W   wielu   przypadkach   dla   inhibitorów   nieodwracalnych   otrzymuje   się   parametry  
kinetyczne  (K

m

,  V

max

)  charakterystyczne  dla  inhibitorów  odwracalnych  niekompetycyjnych,  

stąd  wiele  zamieszania  np.  co  do  działania  cyjanków.  

[S

o

]  

V

o

K

m

=

 K

m

’

V

max

’  

V

max

’   (V

max

spp

)  

nowa   tzw.  

pozorna  

wartość  

V

max  

wyznaczona  

w  

obecności  

inhibitora   jest   niższa   w  
porównaniu  z  rzeczywistą  V

max

V

max

V

max

’/2

V

max

/2  

2.  INHIBICJA  NIEKOMPETYCYJNA  (NIEWSPÓŁZAWODNICZĄCA)  

V

max

   nie  może  być  osiągnięta  nawet  przy  dużym  stężeniu  substratu  

V

max

’  maleje  proporcjonalnie  do  wzrostu  stężenia  inhibitora  (im  wyższe  stężenie  inhibitora  tym  

niższa  V

max

’)  

3.  INHIBICJA  AKOMPETYCYJNA  

!

E    

ES  

E  +  P  

+  S    

+  I  

K

I

E  +  P  

ESI  

-­‐   wiąże   się   w   innym   miejscu   niż   miejsce   wiązania   substratu,   wiąże   się   do   kompleksu   ES  

tworząc  nieaktywny  katalitycznie  kompleks  ESI  

-­‐  związanie  substratu  przez  enzym  odsłania  miejsce  wiązania  inhibitora  
-­‐  obniża  V

max

 i  K

m

 

-­‐  nie  można  go  znieść  przez  zwiększenie  stężenia  substratu  

[S

o

]  

V

o

K

m

V

max

’  

V

max

’   (V

max

spp

)  

nowa   tzw.  

pozorna  

wartość  

V

max  

wyznaczona  

w  

obecności  

inhibitora  

jest  

niższa  

w  

porównaniu  z  rzeczywistą  V

max

V

max

V

max

’/2

V

max

/2  

K

m

’

3.  INHIBICJA  AKOMPETYCYJNA  

Ten   typ   inhibicji   jest   dość   rzadki   i   może   dotyczyć   niektórych   enzymów   mulwmerycznych,  
katalizujących  reakcje  z  udziałem  wielu  substratów.  

4.  INHIBICJA  MIESZANA  

E    

ES  

E  +  P  

+  I  

EI  

K

i

+  S    

+  I  

K

I

E  +  P  

ESI  

E  +  P  

K

i

 ≠  K

I

K

i

 –  stała  dysocjacji  EI  

K

I

 –  stała  dysocjacji  ESI  

•  inhibitor  może  wiązać  się  do  E  lub  kompleksu  ES  
•   nie   ważne   założenie   o   niezależności   miejsc   wiązania   S   i   I,   tak   jak   w   inhibicji  

niekompetycyjnej  

•  inhibitor  może  się  wiązać  w  centrum  aktywnym  (miejscu  wiązania  substratu  lub  miejscu  

katalitycznym)  lub  poza  nim  

•   inhibitor   wpływa   jednocześnie   na   wiązanie   substratu,   jak   również   liczbę   obrotów  

enzymu  

Rozróżnianie  rodzajów  inhibicji  

 

Wykresy  Lineweavera-­‐Burka  

 

Wykresy  Eadie-­‐Hofsteego  

INHIBICJA  NIEODWRACALNA  

inhibitor  nieodwracalny  zwykle  tworzy  kowalencyjnie  wiązanie  z  grupą  funkcyjną  enzymu  
lub  wiąże  się  tak  silnie,  że  jego  dysocjacja  jest  bardzo  powolna  
w   przypadku   inhibicji   nieodwracalnej   nie   może   być   stosowana   zależność   Michaelisa-­‐
Menten.  

PRZYKŁADY:  
działanie   gazów   paraliżujących   układ   nerwowy,   które   polega   na   inaktywacji  

acetylocholinoesterazy