plik

WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA

CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH

MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

ENZYMOLOGIA

Kierunek:

Technologia Żywności

i Żywienie Człowieka

semestr I

Wykład 7

Przegląd najważniejszych enzymów

Zakres materiału ENZYMOLOGIA

1. Biochemia, Autor: Jeremy Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko,

PWN Warszawa (2005)

Rozdziały:

8. Enzymy:: podstawowe pojęcia i kinetyka

9. Strategie katalityczne

10. Strategie regulacyjne:: enzymy i hemoglobina

2. Ćwiczenia z enzymologii i technik biochemicznych. Bartoszewska, Niziołek,

Paszowski, Wydawnictwo SGGW

3. Handbook of Food Enzymology – ed. John R. Whitaker et al., CRC Press; (2002)

4. Enzymes in Food Technology -‐ ROBERT J. WHITEHURST, BARRY A.

LAW, Editors Sheﬃeld Academic Press CRC Press (2002)

3. Food chemistry -‐ Hans-‐Dieter Belitz, Werner Grosch, Peter

Schieberle, Springer (2004)

Enzymy dzieli się na 6 grup (mechanizm reakcji…):
EC 1 oksydoreduktazy: katalizują reakcje utleniania i redukcji,
EC 2 transferazy: przenoszą grupy funkcyjne,
EC 3 hydrolazy: katalizują hydrolizę różnych wiązań,
EC 4 liazy: rozcinają różne wiązania na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie,
EC 5 izomerazy: katalizują zmiany izomeracyjne cząsteczek,
EC 6 ligazy: łączą cząsteczki wiązaniami kowalencyjnymi.

Nazewnictwo/klasyﬁkacja enzymów EC

•  EC1

oksydoreduktazy

-‐ AH

+ B → A + BH

;

•  EC2

transferazy

-‐ AB + C → A + BC;

•  EC3

hydrolazy

-‐ AB + H

O → A + B;

•  EC4

liazy

-‐ AB → A + B;

•  EC5

izomerazy

-‐ AB → BA;

•  EC6

ligazy

-‐ A + B → AB;

E.C. 1.1.1.1 (E.C. – kod enzymu)

Pierwsza liczba -‐ klasa enzymu lub grupa

Druga liczba – grupa utleniona w donorze
Trzecia liczba – akceptor

Czwarta liczba – nazwa systematyczna (wskazuje działanie)

Ok. 4-5%

Oko!o 4100 enzymów sklasyfikowanych

Ponad 80% to enzymy hydrolityczne

20% inne klasy g!ównie

oksydoreduktazy

70% to proteinazy i amylazy

30% inne hydrolazy

Oko!o 100 – 130 enzymów znalaz!o zastosowanie w technologii "ywno#ci

Najważniejsze enzymy w technologii żywności

Jedynie ligazy nie znalazły do tej pory bezpośredniego zastosowania przemysłowego, lecz
są przydatne w inżynierii genetycznej.

PEKTYNAZY – hydrolazy

hydrolizują wiązania glikozydowi w pektynach,

ułatwiają uwalnianie soków z miazgi, klarowanie soków (usuwanie zmętnień

pektynowych),

pektyny są heteropolisacharydami, składają się głównie z połączonych ze sobą

wiązaniami α–1,4– glikozydowymi jednostek kwasu D–galakturonowego, w

znacznej części zestryﬁkowanych gr. metylowymi,

kwas galakturonowy – powstaje na skutek utleniania α–D–galaktozy,
posiada grupę aldehydową przy C1 i karboksylową przy C6.

β–D–galaktozydaza – hydrolaza

(usuwanie laktozy z mleka

)

Reduktaza diacetylowa (RA) – oksydoreduktaza

Diacetyl + NADH + H

↔ NAD + Acetoina

Diacetyl (produkcja piwa)

-‐ diketon o nazwie systematycznej 2,3-‐butandion, zapachu maślanym, znajduje się

w piwie jako produkt uboczny fermentacji przez drożdże, przy odpowiednim

stężeniu wykazuje korzystne właściwości – pozwala dłużej odczuwać w ustach

smak piwa,

-‐ w stężeniu większym niż 0,2 mg/l nadaje piwu niekorzystny „maślany posmak”,

powstaje w wyniku przetwarzania cukrów przez drożdże, czasami bakterie w

procesie fermentacji,

-‐  w czasie leżakowania piwa te same drożdże redukują diacetyl do obojętnych

smakowo produktów (acetoina, butandiol).

PEPTYDAZY (enzymy proteolityczne, proteazy

)

-‐ katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach (podstawowe

zadanie),

-‐ należą do klasy 3 – hydrolaz,

-‐ niektóre z nich katalizują ponadto hydrolizę wiązań estrowych i amidowych oraz

reakcję transpeptydacji i transamidacji,

-‐ w odpowiednich warunkach niektóre peptydazy mogą ponadto syntetyzować

wiązanie peptydowe.

Peptydazy – niska specyﬁczność

substratowa, jednakże charakteryzują

się wybiórczością w stosunku do

położenia rozkładanego wiązania w

łańcuchu

polipeptydowym

oraz

swoistością w stosunku do hydrolizy

wiązań

pomiędzy

określonymi

aminokwasami.

PEPTYDAZY -‐ klasyﬁkacja

Egzopeptydazy -‐ EC 3.4.11-‐19 (odcinają 1 lub 2 aminokwasy od końca N lub C)
aminopeptydazy EC 3.4.11: odcinające pojedyncze aminokwasy od końca

aminowego,
karboksypeptydazy EC 3.4.16-‐18: odcinające pojedyncze aminokwasy od końca

karboksylowego,
dipeptydazy EC 3.4.14: hydrolizują wiązania peptydowe w dwupetydach,
dwupeptydylo-‐peptydazy lub tripeptydylo-‐peptydazy: odszczepiają jednostki

dwupetydowe lub tripeptydowe od końca N (EC 3.4.14) lub

końca C (EC

3.4.15),
omega peptydazy EC 3.4.19: odcinające różnie podstawione reszty

aminokwasowe.

Egzopeptydazy ważne dla przemysłu spożywczego:

Aminopeptydazy i karboksypeptydazy

Lactococcus lac1s

Aspergillus sp.

Rhizopus oryzae

Zastosowanie: usuwanie gorzkiego smaku z hydrolizatów białkowych, także przy

produkcji sera.

PEPTYDAZY -‐ klasyﬁkacja

Endopeptydazy (proteinazy) – EC 3.4.21-‐24, EC 3.4.99 (hydrolizują wiązania

wewnątrz łańcucha polipeptydowego)

Na podstawie budowy centrum, wrażliwości na inhibitory oraz mechanizm katalizy

wyróżniono:

serynowe EC 3.4.21

seryna oraz histydyna w centrum aktywnym,

są hamowane przez DFP (diizopropyloﬂuorofosforan)

cysteinowe EC 3.4.22

cysteina i histydyna w centrum aktywnym, wrażliwość na czynniki utleniające,

hamowane przez PCMB (p-‐Chloromercuribenzoic Acid) – reakcja z grupami -‐SH

aspartylowe EC 3.4.23

dwie reszty asparaginianu w centrum aktywnym, aktywność przy niskim pH 1.5-‐5

metaloproteinazy EC 3.4.24

inhibicja przez EDTA

Enzym

EC numer

Preferencyjna hydroliza

Serynowe proteazy
chymotrypsyna
trypsyna
subtylizyna

3.4.21
3.4.21.1
3.4.21.4
3.4.21.12

Tyr-, Trp-, Phe-, Leu-
Arg-, Lys-,
G!ównie hydrofobowe

Cysteinowe proteazy
Katepsyna B*
Papaina*
Ficyna*
Bromalina*

3.4.22
3.4.22.1
3.4.22.2
3.4.22.3
3.4.22.32-33

Arg-Arg-, Lys-, Phe-X-
Arg-, Lys-, hydrofobowe-X-
Phe-, Tyr-
Lys-, Arg-, Phe-, Tyr-

Aspartylowe proteazy
Pepsyna
Chymozyna#

3.4.23
3.4.23.1
3.4.23.4

Phe-, Tyr-, Leu-, Asp-, Glu-
Phe1

-Met

106

w "-kazeinie

Metaloproteazy
Termolizyna
Neutralne proteinazy

3.4.24
3.4.24.27
3.4.24.28

Ile-, Leu-, Val-, Phe-,
Leu-, Phe-, i inne

Endopeptydazy o znaczeniu przemysłowym

* szeroka specyﬁczność w stosunku do aminokwasów hydrolizowanego wiązania peptydowego

# specyﬁczność podobna do pepsyny

x preferencyjna hydroliza

Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz roślinnych

Papaina, bromelina, ﬁcyna -‐ wewnątrzkomórkowe proteazy cysteinowe, opymum

pH 5-‐7

Enzym

!ród"o

Skala produkcji

G"ówne zastosowanie

Papaina

Sok z niedojrza!ych owoców

papai

(Carica papaya)

> 10 t/rok

Kruszenie mi"sa, browarnictwo

– usuwanie zm"tnienia piwa

Bromelina

Sok (lateks) z pnia ananasa

< 1 t/rok

Browarnictwo,

kruszenie mi"sa

Ficyna

Sok z niektórych odmian drzew

figowych

g!. Ficus glabrata

< 1 t/rok

Modyfikacja sk!adników

#ywno$ci

Komercyjne otrzymywanie papiny

Zebranie mleczka kauczukowego z niedojrzałych owoców papai

-‐ (nacięcie rano, z 1 drzewa 1 l rocznie, mleczko przypomina wyglądem mleko

krowie, po kilku minutach po wypływie z naciętego owocu ścina się i tworzy żel)

Sch!odzenie

Mieszanie mechaniczne " #el w p!yn

Wst$pna filtracja i odwirowanie

Ultrafiltracja

Klarowny i przezroczysty przes%cz zag$szcza si$ w pró#ni

oraz suszy w suszarni rozpy!owej

Mielenie na proszek i pakowanie

Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz zwierzęcych

Zewnątrzkomórkowe enzymy trawienne:

Enzym

!ród"o

Skala produkcji

G"ówne zastosowanie

Chymozyna

!o"#dek m"odych cielaków

> 1 t/rok

Serowarstwo

Pepsyna

!o"#dek $wini

< 1 t/rok

Modyfikacja sk"adników

%ywno$ci, serowarstwo

Trypsyna

Trzustka $wini lub byd"a

< 1 t/rok

Modyfikacja sk"adników

%ywno$ci,

hydrolizaty bia"kowe,

odw"asianie skór

Chymotrypsyna

Trzustka $wini

< 1 t/rok

Modyfikacja sk"adników

%ywno$ci,

odw"asianie skór

Rozdrobnienie i mielenie surowca (wy!ció"ko #o"$dka !wini)

Autoliza !luzówki #o"$dka w obecno!ci HCl

Usuni%cie t"uszczu heksanem

Wysolenie sol$ lub izopropanolem

Rozpuszczenie w wodzie

Filtrowanie, suszenie sublimacyjne (45-55

C) w pró#ni

(odparowanie heksanu i izopropanolu)

Mielenie na proszek i pakowanie

Komercyjne otrzymywanie pepsyny przemysłowej

Enzym

!ród"o

Skala produkcji

G"ówne zastosowanie

Neutralne peptydazy

Bacillus subtilis

> 100 t/rok

Hydrolizaty bia!kowe, dodatek

do proszków do prania,

browarnictwo

Kwa"ne peptydazy g!.

koagulaty bia!ek mleka

Rhizmucor miehei

> 10 t/rok

Serowarstwo

Kwa"ne peptydazy

Aspergillus niger,

Aspergillus oryzae

> 1 t/rok

Piekarnictwo,

wytrawianie skór

Otrzymywanie peptydaz z mikroorganizmów

Neutralne proteinazy Bacillus sub1lis; proteinazy serynowe, metaloproteinazy.

Podpuszczka – handlowa nazwa zalecana dla preparatów z żołądków przeżuwaczy
zawierająca głównie chymozyną i w niewielkim stopniu pepsynę (Międzynarodowa

Federacja Mleczarska).

Peptydazy pochodzenia mikrobiologicznego zdolne do koagulacji białek mleka zaleca się

nazywać koagulantami białek mleka.

Hydrolizaty bialkowe

Produkcja hydrolizatów białkowych odbywa się w wyniku enzymatycznej lub kwasowej/

zasadowej hydrolizy białek)

Enzymatyczne modyﬁkacja składu i właściwości białek -‐ hydrolizaty białkowe

Enzymatyczna hydroliza białek nie powoduje rozkładu aminokwasów, jest bardziej
specyﬁczna od hydrolizy kwasowej i alkalicznej białek.

W wyniku częściowej proteolizy
Zmieniają się reologiczne, ﬁzyczne, chemiczne właściwości białek,

Powstają charakterystyczne cechy smakowe i zapachowe produktów.

np.   hydrofobowe   aminokwasy   schowane   wewnątrz   cząsteczki   białka   zostają   odsłonięte,
najczęściej   powstaje   gorzki   smak,   zwiększa   się   rozpuszczalność,   obniża   napięcie
powierzchniowe,   zwiększa   się   zdolność   do   emulgowania   tłuszczów   (tworzenia   emulsji)   i

tworzenia piany, wzrasta strawność i przyswajalność produktu.
Gdy jednak zbyt długo prowadzi się hydrolizę to właściwości emulgujące i tworzenia piany

mogą spadać.

Hydrolizaty białek na skalę przemysłową otrzymuje się z:

białek mleka (kazeiny, albuminy, białka serwatkowe),
białek mięsa, soi, glutenu pszenicy, ﬁbrynogenu lub kolagenu.

Hydrolizaty białkowe – zastosowanie

Jako koncentraty spożywcze i przyprawowe, np. zupy instant, sosy sojowe,

przyprawy do pieczenia mięsa, buliony mięsne w proszku,
Dodatki do żywności wytwarzające i stabilizujące pianę, emulgujące tłuszcze,

modyﬁkujące smak, poprawiające teksturę i ułatwiające krojenie, np. do parówek,
Do otrzymywania żywności przeznaczenia specjalnego:

-‐ odżywki dla niemowląt,
-‐ preparaty odchudzające,
-‐ odżywki białkowe dla sportowców,
-‐  odżywki o obniżonej alergenności dla dzieci „atopowych” oraz z zaburzeniami
-‐  wchłaniania i trawienia o podłożu immunologicznym, niealergizującym,

Wzbogacanie produktów w białko, np. chleba i żywności specjalnej.

Laktoalbumina zawarta w białku serwatkowym mleka krowy oraz albumina jaja

zostały uznane za białka o najwyższej wartości odżywczej przez FAO/WHO (nie

tylko zawartość egzogennych aminokwasów, ale i proporcje aminokwasów

egzogennych do endogennych) => ale RYZYKO REAKCJI ALERGICZNYCH!!!

PROCES PLASTEINOWANIA

Proces plasteinowania, jako przykład polepszania jakości białek

Enzymatyczna reakcja resyntezy wiązań peptydowych (w konkretnych warunkach),

Enzymatyczne

przeprowadzanie

hydrolizatów

białkowych

peptydy

wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne w 10% TCA o konsystencji żelu nazwanego

„plasteiną”.

Proces dwuetapowy:

ETAP 1: polega na częściowej hydrolizie wiązań peptydowych białek przy użyciu

proteinaz, takich jak pepsyna, papaina, α-‐chymotrypsyna.

ETAP 2: otrzymany uprzednio hydrolizat białkowy (mieszanina peptydów), po

zatężeniu, poddaje się reakcji plasteinowania katalizowanej przez enzymy, takie

same bądź inne niż stosowane w procesie hydrolizy, lecz przy pH innym niż w

procesie hydrolizy w wyniku, czego otrzymuje się plasteinę charakteryzującą się, w

porównaniu z białkiem wyjściowym, lepszym składem jakościowym oraz obniżoną

zawartością substancji antyżywieniowych.

Schemat technologiczny otrzymywania plastein

Plasteiny o po!"danym sk#adzie

aminokwasowym

Hydroliza wi"za$ estrowych

Zag%szczenie

Cz%&ciowa hydroliza

do peptydów

Odszczepienie niepo!"danych

aminokwasów

Roztwór bia!ek

Endopeptydaza,

np. pepsyna

Egzopeptydaza

Rozdzielenie

Niepo!"dane

aminokwasy

Woda

Reakcja plasteinowa w 50 %

roztworze substratów

Estry etylowe po!"danych

aminokwasów

Rozpuszczalnik

organiczny

Rozdzielenie

Frakcja zwi"zków

ma#ocz"steczkowych

Alkohol etylowy

NaOH

KIERUNKI WYKORZYSTYWANIA REAKCJI PLASTEINOWANIA

-‐ wbudowywanie aminokwasów egzogennych w białka, np. gluten (białko

zapasowe zbóż) w lizynę, zeinę w lizynę, tryptofan,
-‐ usuwanie niepożądanych aminokwasów w przypadku szczególnych diet, np. w

fenyloketonurii konieczne jest wyeliminowanie z produktów fenyloalaniny (do

produkcji hydrolizatów wykorzystywane są rybny koncentrat białkowy i białko

sojowe),
-‐ usuwanie gorzkiego smaku hydrolizatów białkowych – usunięcie aminokwasów

hydrofobowych lub ich ukrycie wewnątrz długich łańcuchów plastein,
-‐  usuwanie właściwości alergennych białek – usunięcie części epitopów (z końca N

lub C) ,
-‐  rozbicie epitopów lub ich ukrycie wewnątrz łańcuchów plastein => konieczność

poznania sekwencji aminokwasowych uczulających.

ZASTOSOWANIE PEPTYDAZ

PIEKARNICTWO

-‐  rozluźnienie zbyt mocnego białka glutenowego mąki, co prowadzi do skrócenia

czasu wyrabiania ciasta,

-‐  polepsza jego pulchność i konsystencję (peptydazy grzybowe i bakteryjne),

BROWARNICTWO

-‐ podczas przerobu zbożowych surowców niesłodowanych w celu zapewnienia

odpowiednich właściwości organoleptycznych (zapachu, pienistości, klarowności)

=> stabilizacja piwa (szczególne znaczenie przy schładzaniu piwa),

-‐ przy słodowaniu jęczmienia i w początkowej fazie zacierania słodu => odpowiedni

stopień rozkładu substancji białkowych,

PRZEMYSŁ MIĘSNY

-‐ przyspieszenie procesu dojrzewania mięsa, głównie wołowego, poprzez częściowy

rozkład ... białka włókna mięśniowego uzyskuje się poprawę konsystencji

(delikatność, kruchość), poprawę wartości odżywczej i cech organoleptycznych

=> 2-‐3 x skrócony czas dojrzewania => zwiększona strawność,

-‐ oddzielenie resztek mięsa od kości – zwiększenie odzysku białka,

-‐ zmiękczanie, odwłasianie skór,

-‐ zwiększenie wydajności ekstrakcji tłuszczu,

ZASTOSOWANIE PEPTYDAZ

PRZEMYSŁ RYBNY

-‐ dojrzewanie solonych, marynowanych śledzi (pleśnie Aspergillus),

MLECZARSTWO

-‐ koagulacja białek mleka w produkcji sera,

-‐ produkcja hydrolizatów kazeiny,

-‐ produkcja mleka sojowego, mleka w proszku,

-‐  w procesie dojrzewania sera – proces złożony, proteoliza niezbędna do uzyskania

prawidłowej struktury, głębokiego smaku,

-‐  dostarczenia aminokwasów niezbędnych do wytworzenia charakterystycznego

smaku i zapachu.

Reakcje katalizowane przez transglutaminazę

-‐ sieciowanie łańcuchów polipeptydowych.

Transglutaminaza
-‐ występuje w krwi ssaków, uczestniczy w wytwarzaniu skrzepów;
-‐ produkowana także przez drobnoustroje;
-‐ jako acylotransferaza, katalizuje reakcje łączenia reszty acylowej glutaminy

wbudowywanej w białko lub w peptyd z pierwszorzędową grupą aminową

aminokwasu wolnego lub wbudowanego w białko lub peptyd (lizyna).

O O

|| ||
bia!ko

-(CH

)

-C-NH

+ H

N-(CH

)

-bia!ko

! bia!ko

-(CH

)

-C-N-(CH

)

-bia!ko

+ NH

      H
O         O
||     ||

bia!ko-(CH

)

-C-NH

+ H

NR ! bia!ko-(CH

)

-C-N-R + NH

wolny |
aminokwas H

Jedynym producentem enzymatycznych preparatów amylolitycznych, pektynolitycznych i
proteolitycznych w Polsce są Zakłady Przemysłu Ococowo-‐Warzywnego PEKTOWIN w Jaśle.

Enzymy proteolityczne otrzymywane głównie w wyniku biosyntezy bakterii Bacillus sub1lis,
szczepu Aspergillus niger.