Kierunki wykorzystania preparatów enzymatycznych:

1. Przemysł gorzelniczy i browarniczy

   • Amylazy – upłynnianie i scukrzanie skrobi do cukrów fermentujących → intensyfikacja fermentacji

Peptydazy – usuwanie zmętnień białkowych, klarowanie i stabilizacja piwa i wina, [uwalnianie aminokwasów dla prawidłowego funkcjonowania drożdży]

• Oksydaza glukozy – uwalnianie tlenu → stabilizacja piwa, wina

1. Przemysł piekarski i cukierniczy

   • Amylazy – intensyfikacja fermentacji [scukrzanie skrobi do cukrów fermentujących] → zwiększenie pulchności ciasta

   • Peptydazy – częściowa degradacja glutenu mąki, skracanie czasu wyrabiania ciast

   • β-galaktozydaza – zapobieganie krystalizacji laktozy

   • β-fruktofuranozydaza – produkcja cukru inwertowanego, sztucznego miodu

   • Glukoamylaza – scukrzanie skrobi

   • Lipazy – poprawa cech organoleptycznych produktów

   • Izomeraza glukozowa – produkcja wysokofruktozowych syropów

2. Przemysł mleczarski

   • Peptydazy – koagulacja mleka, dojrzewanie sera

   • β-galaktozydaza – usuwanie laktozy z mleka i serwatki

   • Lipazy – dojrzewanie serów, produkcja pełnego mleka w proszku oraz koncentratów zapachowych z tłuszczu mlekowego

3. Przemysł mięsny, rybny, drobiarski

   • Peptydazy – kruszenie [tanderyzacja?] mięsa, przyspieszanie dojrzewania farszów, produkcja past i hydrolizatów

   • Oksydaza glukozy – usuwanie tlenu – ochrona produktów paczkowanych przed utlenieniem (konserwy); odcukrzanie masy jajowej

4. Przemysł przetwórstwa owocowo-warzywnego

   • Amylazy – usuwanie skrobi w produkcji soków

   • Peptydazy – ułatwienie ekstrakcji, stabilizacji i klarowności soków

   • Pektynazy – usprawnienie tłoczenia oraz filtracji i klarowania soków

   • Oksydaza glukozy – ochrona konserwowanych napojów bezalkoholowych przed zmianami barwy, zapachu i korozją puszek

Jedynie ligazy nie znalazły do tej pory bezpośredniego zastosowania przemysłowego, lecz są przydatne w inżynierii genetycznej /produkcja białek zrekombinowanych

Natura chemiczna enzymów

• to wysoce wyspecjalizowane białka proste lub złożone o masie od ~10kDa (1 łańcuch polipeptydowy) do 500 kDa (oligomer), zdarzają się pow. 1000kDa

• białka globularne o kształcie owalnym, charakteryzujące się co najmniej strukturą trzeciorzędową,

• właściwości molekularne i funkcję katalityczną enzymów:

- monomerycznych warunkuje ich struktura I, II, III-rzędowa,

- oligomerycznych I, II, III, IV-rzędowa.

Struktura pierwotna białek:

Struktura pierwszorzędowa – liczba i kolejność ułożenia reszt aminokwasowych w łańcuchu polipeptydowym

Struktura wtórna białek:

Struktura drugorzędowa – określa wzajemne położenie fragmentów łańcucha polipeptydowego (α-helisa, struktura β – struktura dywanowa).

Struktura trzeciorzędowa – to przestrzenne ułożenie całego pojedynczego łańcucha polipeptydowego (mogą występować fragmenty o strukturze helisy α i strukturrze β).

Struktura czwartorzędowa – przestrzenne ułożenie podjednostek polipeptydowych i sposób ich połączenia.

Enzymy monomeryczne

• zbudowane z 1 łańcucha peptydowego lub z dwu lub więcej połączonych wiązaniami kowalencyjnymi jak mostki -S-S- (chymotrypsyna – 3 łań),

• [zbudowane ze 100 – 300 aminokwasów, 10 – 35 kDa],

• ukształtowanie przestrzenne łań polipeptydowego (IIIrz) następuje przede wszystkim wskutek oddziaływań hydrofobowych

„dwufazowy” układ przestrzenny cząsteczki, najuboższy energetycznie i najtrwalszy

W mniejszym stopniu struktura stabilizowana przez wiąz wodorowe,mostki –S-S-, oddziaływania van der Waalsa, jonowe

• jest ich mniej niż oligomerycznych, a większość z nich to hydrolazy,

• np. α-amylaz [większość w postaci helisy α], chymozyna, chymotrypsyna.

Występują także fragmenty o zakłóconej strukturze.

Aminokwasy hydrofobowe – w pofałdowanym białku w środowisku wodnym są skierowane do wewnątrz.

Aminokwasy polarne - w pofałdowanym białku w środowisku wodnym są skierowane na zewnątrz (na powierzchni).

Enzymy oligomeryczne

• składają się z 2 lub więcej podjednostek,

• podjednostka może się składać z 1 łańcucha polipeptydowego lub kilku połączonych wiązaniami kowalencyjnymi,

• podjednostka jest to element oligomeru łączący się z innymi wyłącznie wiązaniami niekowalencyjnymi

• podjednostki wiążą się ściśle określonymi i zawsze tymi samymi „obszarami kontaktowymi”

• w stabilizacji monomerów biorą udział oddziaływania hydrofobowe, w mniejszym stopniu wodorowe i jonowe

• [masa oligomeru pow. 35 kDa – 1000 kDa, zdarza się do 10000 kDa]

• np. oksydaza glukozy (homodimer – 2 identyczne podjednostki katalityczne), heksokinaza (heterodimer – 2 różne podjednostki katalityczne).

W skład enzymów oligomerycznych mogą również wchodzić podjednostki regulatorowe (nie mające centrum aktywnego), na których znajdują się centra allosteryczne, do których przyczepiają się aktywatory i inhibitory.

Powody występowania struktury IV-rzędowej enzymów oligomerycznych

• błędne łatwo zastąpić,

• miejsce syntezy ≠ miejsce formowania,

• informacja genetyczna może dotyczyć tylko 1 podjednostki,

• budowa podjednostkowa to strukturalna podstawa do realizacji aktywności,

• większa cząsteczka enzymu to lepiej umocowane grupy tworzące centrum aktywne,

• każda podjednostka katalityczna z centrum aktywnym → wydajniejsza kataliza.

~Jon metalu lub koenzym tylko przejściowo łączący się z apoenzymem podczas reakcji enzymatycznej to tzw. kosubstrat.

Enzymy posiadają ściśle określoną i wysoce uporządkowaną strukturę przestrzenną – konformację – warunkującą ich aktywność biologiczną, a także określoną plastyczność niezbędną do tego działania.

Uszkodzenie tej struktury prowadzi do utraty aktywności biologicznej.

Denaturacja

• zniszczenie wtórnej struktury białka z równoczesnym zanikiem jego aktywności biologicznej i zmianą niektórych właściwości fizykochemicznych prowadzi do rozfałdowania łańcucha, czemu najczęściej towarzyszy wytrącenie białka z roztworu

• jest to proces praktycznie nieodwracalny

• czynniki powodujące to temp, pH, etanol, aceton, promieniowanie UV.

Trzy zasadnicze etapy

reakcji enzymatycznej

Etap pierwszy

związanie cząsteczek substratu na powierzchni enzymu, powstanie kompleksu ES

Etap drugi

oddziaływanie S z E polegające na przegrupowaniach elektronowych pomiędzy grupami funkcyjnymi S i grupami funkcyjnymi aa kontaktowych E, naprężeniach wiązań w substracie

→ powst. wzbudzonej formy kompleksu E-S → E-S‡, utworzenia „stanu przejściowego”

Etap trzeci

zajście reakcji katalitycznej, przekształcenie kompleksu E-S‡, w kompleks E-P i rozpad tego ostatniego na E i P

Centrum aktywne enzymu

• jest to obszar cząsteczki enzymu, w którym cząsteczka(i) substratu zostaje związana i poddana katalizowanej reakcji,

• ma budowę trójwymiarową, leży w zagłębieniu cząsteczki E niedostępnym dla wody

• stanowi tylko niewielką część cząsteczki enzymu

Aminokwasy centrum aktywnego

• k – aminokwasy kontaktowe – leżą w odległości 0,2nm od substratu; biorą udział w wiązaniu substratu z enzymem oraz bezpośrednio udział w katalizie,

• p – aminokwasy pomocnicze – nie stykają się z substratem, lecz pełnią określoną rolę w katalizie,

• s – aminokwasy stabilizujące strukturę przestrzenną centrum aktywnego.

Miejsce aktywne złożone z reszt aminokwasowych, znacznie oddalonych od siebie w liniowym łańcuchu polipeptydowym, ale zbliżonych w przestrzeni na skutek zwinięcia łańcucha w formę globularną.

Centrum aktywne tworzą precyzyjnie, specyficznie ułożone reszty aminokwasów.

W odwracalnym wiązaniu substratu najczęściej biorą udział:

• wiązania elektrostatyczne

• wodorowe

• siły van der Waalsa

• oddziaływania hydrofobowe

• czasem wiązania kowalencyjne

Reszt katalitycznych dostarczają:

• Asp, Glu (dodatkowa gr. –COOH)

• Lys, His, Arg (dodatkowa gr. –NH₂)

• Ser (gr. –OH)

• Cys (gr. –SH)

Modele swoistego wiązania substratu

Pierwszy etap katalizy to utworzenie kompleksu E-S, jednak cechą enzymów jest wybiórczość w stosunku do substratów.

1. Model klucza i zamka, inaczej tzw. „sztywnej struktury” (Fisher, 1890)

• Centrum aktywne jest idealnie komplementarne do substratu pod względem kształtu, chemicznej konformacji.

• Model nie dopuszcza zmian konformacji- centrum aktywne i substrat są strukturami sztywnymi.

• Jeżeli wystąpi symetria w budowie cząsteczki substratu to hipoteza Fishera nie wyklucza przypadkowości w dopasowaniu się substratu przodem lub tyłem.

2. Model wymuszonego/wzbudzonego dopasowania

Enzym i substrat wzajemnie na siebie oddziaływają, czego wynikiem są zmiany konformacyjne centrum aktywnego, ale też i substratu (substrat wykazuje zmiany w momencie wiązania). Te zmiany prowadzą do optymalnego –dla katalizy- ułożenia grup katalitycznych centrum aktywnego względem odpowiednich grup funkcyjnych w substracie. Model poparty badaniami z zastosowaniem metodą krystalografii rentgenowskiej.

Model ten tłumaczy także reakcje dwusubstratowe- po przyłączeniu jednego substratu indukowane są zmiany konformacyjne umożliwiające przyłączenie drugiego substratu.

3. Model trójpunktowego przyłączania substratu (hipoteza Ogstona)

Tłumaczy stereo specyficzność enzymów.

• Enzym może odróżnić jeden z dwóch identycznych podstawników w symetrycznie zbudowanej cząsteczce wytwarzając tylko jeden rodzaj enancjomeru

• Substrat przyłącza się do powierzchni enzymu w co najmniej 3 punktach

• Reakcja zachodzi tylko w jednym z trzech punktów przyłączenia

Gdy cząsteczka substratu o podstawnikach ABC łączy się z 3 komplementarnymi grupami na asymetrycznej powierzchni enzymu to 2 atomy. A nie są już równoważne i substrat ma tylko jeden możliwy sposób przyłączenia.

rys. model Ogstona

1. Specyficzność w stosunku do substratu (specyficzność substratowa)

Zdolność do wiązania tylko określonych substratów i katalizowania reakcji z ich udziałem

Jest uwarunkowana głównie budową centrum aktywnego (konfiguracją przestrzenną grup wiążących substrat) i jego zdolnością do konformacyjnego dopasowania do substratu

a) specyficzność absolutna – wiązany może być tylko 1 specyficzny substrat np. ureaza, oksydaza glukozowa

b) specyficzność grupowa – enzym może wykorzystywać jako substrat grupę strukturalnie podobnych związków np. heksokinaza (aldoheksozy), oksydaza aminokwasowa, dehydrogenaza alkoholowa (różne alkohole), lipaza (estry glicerolu)

c) stereospecyficzność (s. stereochemiczna)- substratem jest tylko jeden z izomerów optycznych, związku. Względem:

- szeregu konfiguracyjnego L i D np. oksydaza glukozowa

- izomerów geometrycznych cis i trans np. hydrolaza jabłczanowa

- wiązań α– i β- glikozydowych

D ) specyficzność w stosunku do kierunku działania (specyficzność działania) – dany enzym jest zdolny do przekształcania danego substratu w ściśle określonym kierunku czyli katalizuje tylko jedną z możliwych reakcji chemicznych, w których może brać udział dany substrat.

Kwas glutaminowy (dekarboksylaza glutaminianowa, dehydrogenaza glutaminianowa, aminotransferaza asparaginianowa)

E) specyficzność względem położenia rozkładanego wiązania : egzo i endoprotezy; egzo i endoamylazy

F) specyficzność względem długości łańcucha węglowego w substracie

Niektóre enzymy wykazujące specyficzność w stosunku do określonego typu reakcji mają mniejsze wymagania co do typu substratu:

Lipazy – hydrolizują wiązanie estrowe w dowolnych tłuszczach, ale też mogą rozkładać estry innych alkoholi niż glicerol

Proteazy – katalizują specyficznie rozpad określonego rodzaju wiązań peptydowych w dowolnym białku

Obie grupy związku wykazują specyficzność substratową grupową.

ETAPII

Warunki zajścia reakcji chemicznej

Teoria zderzeń

• Cząsteczki mogą reagować ze sobą tylko jeśli wejdą w kontakt jedna z drugą, czyli dojdzie do ich zderzenia

• Nie wszystkie zderzające się cząsteczki reagują ze sobą, bo:

- nieprawidłowe ukierunkowanie przestrzenne

- brak wystarczającej ilości energii swobodnej do rozerwania jednych wiązań i utworzenia innych (nie mogą pokonać bariery aktywacji)

• Czynniki które zwiększą szybkość i siłę zderzeń np. zwiększenie stężenia reagentów lub temperatury (wzrost energii kinetycznej) zwiększają szybkość reakcji.

Teoria stanu przejściowego (drugi warunek konieczny)

Warunkiem zajścia reakcji jest osiągnięcie przez cząsteczki substratów tzw. Stanu przejściowego, czyli stanu o podwyższonym poziomie energii swobodnej w stosunku do substratów i produktów. Czas trwania ~ 10^-13s → bardzo niestabilny, nietrwały układ.

Najmniejsza ilość energii swobodnej wyrażona w kJ/mol jaka jest potrzebna do osiągnięcia przez cząsteczkę substratu stanu przejściowego to energia swobodna aktywacji Gibbsa (∆G±)

∆G±= G stanu przejściowego – G substratu

Enzymy obniżają energię aktywacji

Zmiany energetyczne zachodzące podczas przebiegu reakcji biochemicznej niekatalizowanej i katalizowanej enzymatycznie:

• Dla reakcji niekatalizowanej enzymatycznie energia pochodzi ze zderzeń->b. wolno->wzrost szybkosci można osiągnąć powodując wzrost energii kinetycznej lub wzrost ciśnienia.

• Enzym obniża wartość energii swobodnej dla zw. W stanie przejściowym, nie S i nie P.

Rola katalityczna enzymu polega na obniżeniu energii reakcji chemicznej poprzez:

• Osłabienie wiązań w substracie

• Wiązanie substratu na powierzchni

• Ustawieniu substratu tak, aby mógł osiągnąć stan przejściowy

• Stabilizowanie stanu przejściowego

Mechanizmy katalizy enzymatycznej:

1. Kataliza przez zbliżenie i ukierunkowanie → obniżanie entropii układu ES

• Zwiększone prawdopodobieństwo zderzeń cząsteczek reagujących ze sobą (bo wiąże je obok siebie)

• Zbliżenie i ukierunkowanie przestrzenne reagujących ze sobą grup funkcyjnych E i S- tzw. sterowanie orbitalami

• Unieruchomienie substratu (ów) w konformacji umożliwiającej wywołanie stanu przejściowego

• Ograniczenie ruchów rotacyjnych i oscylacyjnych reagujących ze sobą grup funkcyjnych→ obniżanie entropii układu

2. Kataliza przez stabilizację i uprzywilejowane wiązanie stanu przejściowego

Enzymy powodują zmiany konformacyjne w substracie.

Enzymy wiążą stan przejściowy silniej niż substraty i produkty. Im silniej E wiąże stan przejściowy w stosunku do S tym reakcja zachodzi szybciej.

Enzymy naprężają (rozciągają) substraty w kierunku geometrii stanu przejściowego (tzw. mechanizm koła tortur)przy pomocy miejsc wiążących do których substrat nie pasuje->wzrost energii potencjalnej → destabilizacja S, osłabienie określonych wiązań w substracie.

Dobry substrat powinien zatem wykazywać wysokie powinowactwo do enzymu po aktywacji do stanu przejściowego.

3. Kataliza elektrostatyczna- destabilizacji substratu

Wiązanie substratu usuwa wodę z bezpośredniego otoczenia substratu → odwodnienie zjonizowanych grup na powierzchni substratu powoduje, że stają się bardziej reaktywne.

Maleje stała dielektryczna w środowisku centrum aktywnego → wzmocnienie oddziaływań elektrostatycznych naładowanych przeciwnie grup w centrum aktywnym.

Rozkład ładunków w centrum aktywnym jest taki, aby stabilizował stan przejściowy.

Czyli:↑ prędkości reakcji poprzez obniżenie energii aktywacji:

- likwidując powstanie niekorzystnych oddziaływań elektrostatycznych substratu ze środowiskiem

- powstaniem pozytywnych oddziaływań jonowych w centrum aktywnym z substratem

4. Kataliza kowalencyjna

Przyspieszenie reakcji następuje poprzez przejsciowe utworzenien wiązania kowalencyjnego między substratem a katalizatorem na skutek ataku nukleofilowego gr. Funkcyjnej E.

Zwykle w miejscu aktywnym enzymu znajduje się silny nukleofil bogaty w e- (gr.-OH seryny ; SH cysteiny; imidazolowi histydyny;), który atakuje fragment substratu tworząc wiąz. Kowalencyjne , następnie kowalencyjny produkt pośredni jest atakowany przez drobnocząsteczkowy nukleofil .p. H20 (drugi substrat) dając produkt reakcji .

5. Ogólna kataliza kwasowo-zasadowa

Grupy funkcyjne w centrum aktywnym enzymu mogą służyć jak kwas (NH₂⁺, COOH) lub zasada (NH₂, COO^-), poprzez oddanie protonu lub jego przyjęcie umożliwiają rozerwanie wiązań w substracie i stabilizację stanu przejściowego

Ogólna kwasowa kataliza – proces w którym częściowe przeniesienie protonu z kwasu Bronsteda (E) obniża energię swobodną stanu przejściowego (energia aktywacji)

Ogólna zasadowa kataliza – przyłączenie protonu przez zasadę Bronsteda (E) obniża energię swobodną stanu przejściowego

6. Kataliza z udziałem jonów metali

Blisko 30% reakcji enzymatycznych wymaga obecności jonów metali

2 klasy wymagających jonów metali:

a) metaloenzymy – zawierają silnie związany jon metalu, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co3+

b) enzymy aktywowane metalem - luźno wiążą jon metalu z roztworu, zwykle Na+, K+, Mg2+, Ca2+

Jony metali:

1. wiążą koordynacyjnie substraty i ustawiają je w odpowiedniej dla reakcji orientacji w centrum aktywnym

2. pośredniczą w reakcjach oksydoredukcyjnych- zmieniając stopień utlenienia przyjmują / oddają e-

3. mogą stabilizować ładunki ujemne działając jako elektrofile

4. ułatwiają powstawanie nukleofilów w wyniku wiązania koordynacyjnego (np. poprzez polaryzację wiązań w poprzedniej cząsteczce)

5. mogą przyspieszac reakcje poprzez polaryzacje wiazan w sąsiedniej cząsteczce np. mogą prowadzić do powstania nukleofilu OH_ poprzez jonizacje cząst. H2O

Energia wiązań chemicznych substratu uwalniana podczas wiązania z enzymem jest wykorzystywana do utworzenia stanu przejściowego. Więc enzymy uwalniają energię w wiązaniach kowalencyjnych w cząsteczce substratu.

Enzymy jako biokatalizatory:

- przyspieszają przemianę substratów w produkty przy czym ich budowa i właściwości pozostają nie zmienione (nie wchodzą w reakcje z substratami)

- mogą przyspieszać przebieg tylko termodynamicznie możliwych reakcji egzoergicznych

- mogą przyspieszac tez reakcję endoergiczne ale muszą być one sprzężone z reakcjami egzoergicznymi

- przyspieszają reakcje poprzez obniżenie energii aktywacji

Cechą odróżniającą enzymy od katalizatorów nieorg. Jest ich wysoka specyficzność substratów oraz swoistość działania.

Systematyka enzymów

Klasy enzymów:

1. Oksydoreduktazy

2. Transferazy

3. Hydrolazy

4. Liazy

5. Izomerazy

6. Ligazy

Łącznie- 4111 sklasyfikowanych enzymów, głównie w pierwszych klasach.

Nomenklatura

• Każdy enzym ma nazwę systematyczną i potoczną

• Nazwa systematyczna jest dwuczłonowa

- część pierwsza o końcówce –aza mówi o typie katalizowanej reakcji

- część druga wskazuje na substrat(y)

W przypadku oksydoreduktaz i transferaz uwzględnia z reguły donor i akceptor, w przypadku ligaz także produkt rozpadu

• Każdy enzym ma swój numer identyfikacyjny (4 cyfry oddzielone kropkami)

• Klasyfikacja enzymów opiera się na typie katalizowanej reakcji

• Nazwa potoczna musi zawierać typ reakcji i substrat

• Zdarzają się nazwy jednoczłonowe (np. ureaza z klasy hydrolaz) dlatego, że jest tylko 1 możliwy substrat (specyficzność absolutna).

1. OKSYDOREDUKTAZY

Katalizują reakcje oksydoredukcyjne, polegające na przenoszeniu e-, H+ lub polegające na bezpośrednim włączaniu tlenu do substratu . Klasa ta obejmuje następujące gr. Enzymów

• Dehydrogenazy- odwodorowanie , utlenianie, przenośniki e- i H+, NAD+, FAD

AH₂+B A + BH₂

• Reduktazy- redukcja , przenośniki e- i H+, NADP+, FAD, ferredoksyna, cytoelektrony

A+BH₂ < AH₂+B

• Oksydazy

2 AH₂ + O₂ <2 A + 2 H2O

2. TRANSFERAZY

Klasa ta obejmuje enzymy katalizujące przeniesienie grup chemicznych pomiędzy poszczególnymi związkami i to zwykle przy udziale specyficznych koenzymów.

W zależności od rodzaju przenoszonych grup lub rodników wyróżniamy m.in.:

• Aminotransferazy: przenoszą grupą aminową –NH₂

• Fosfotransferazy (kinazy): przenoszą grupy fosforanowe z udziałem ATP

• Metylotransferazy: przenoszą grupę –CH₃

• Glikozylotransferazy: przenoszą grupy cukrowe

• Acylotransferazy: przenoszą grupy acylowe 2,4,6-węglowe

2. HYDROLAZY

Enzymy katalizujące reakcje hydrolizy, czyli rozkładu wiązań z udziałem cząsteczki wody.

Jest to jedyna klasa enzymów, która nie wymaga obecności koenzymów.

W zależności od rodzaju aktywowanych wiązań rozróżniamy hydrolazy m.in.:

• rozkładające wiązania estrowe – esterazy:

• hydrolizujące wiązania glikozydowe – glikozydazy (np. amylazy, celulaza)

• hydrolizujące wiązania peptydowe – peptydazy (np. trypsyna, pepsyna, chymotrypsyna)

• rozkładające wiązanie C–N inne niż peptydowe, np. w amidach – amidohydrolazy

Np. galaktohydrolaza β-D-galaktozydu - nazwa systematyczna

β-D-galaktozydaza, laktaza - nazwa potoczna

Zastosowanie Laktazy :

• produkcja mleka przy nietolerancji laktozy - niskolaktozowego, hydroliza laktozy do glukozy i galaktozy,

• polepsza rozpuszczalność, zmniejsza koncentrację sacharydów w produktach koncentratów z mleka i serwatki (łatwa produkcja lodów, deserów),

• glukoza słodsza od laktozy,

• rozkład laktozy przyspiesza fermentację mleka w technologii napojów fermentowanych, twarogów, serów,

• można przygotować roztwory o większym stęż cukru i jednocześnie z niższą tendencją do krystalizacji

• produkowana przez: Kuyveromyces lactis i fragilis, Aspergillus niger i oryzae

Inwertaza (sacharaza, β-fruktofuranozydaza) – EC 3.2.1.26

– hydrolizuje wiązanie α-1,4-glikozydowe sacharozy i powstaje α-D-glukoza i β-D-fruktoza

• produkcja miodu sztucznego, cukru inwertowanego

• hydrolizaty sacharozy - środki słodzące w produkcji produktów cukierniczych

• otrzymywanie fruktozy

Fruktoza:

• słodsza od sacharozy

• najlepiej rozpuszczalna w wodzie – słodzenie soków (nie krystalizuje się w czasie przechowywania)

• higroskopijna – zapobiega utracie wilgoci w żywności, np. owoce kandyzowane

Enzymy katalizujące odwracalne lub nieodwracalne rozerwanie różnych wiązań bez udziału wody, przy czym z substratu, na który działa enzym, odłączane są pewne grupy i uwalniane w postaci zw. drobnocząsteczkowych (np. CO₂, H₂O, NH₃, aldehydy).

Ze względu na rodzaj rozszczepianych wiązań wyróżniamy m.in. liazy:

• rozrywające wiązanie C–C - dekarboksylazy – uwalniają CO₂ z substratówą₃

• rozszczepiające wiązanie C–S - desulfhydrazy – odszczepiają H₂S

Do klasy tej należą SYNTAZY, które nie wymagają nakładu energii do syntezy wiązań, równowaga reakcji przesunięta w kierunku syntezy wiąz. (katalizuje reakcje odwracalne – synteza+ rozrywanie

2. IZOMERAZY

Klasa enzymów katalizujących przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe: przegrupowania atomów bądź grup chem. Skład chemiczny związku nie ulega zmianie (w obrębie jednej cząsteczki)

Należą tutaj enzymy katalizujące różne reakcje izomeryzacji, m.in.:

• racemazy i epimerazy – odpowiedzialne za zmianę konfiguracji przy węglu asymetrycznym (wzajemne przekształcenia konfiguracji L i D lub formy α i β)

• mutazy (wew. cząstecz. transferazy) – odpowiedzialne za przemieszczenie grup wewnątrz cząsteczki

• izomerazy cis-trans – izomeria geometryczna (cis-trans)

• izomerazy odpowiedzialne za wewnątrzcząsteczkowe przemiany oksydoredukcyjne (przesunięcie atomów H⁺ w obrębie jednej cząsteczki)

• epimerazy- zmieniające położenie podstawników przy asymetrycznym atomie C np. D-glukoza w D-galaktozę.

Enzym ten bierze udział w przekształceniu ksylozy do ksylulozy, a przedstawiona reakcja zachodzi in vitro i ma zastosowanie w proc technologicznych.

Stosowany do produkcji fruktozy i syropów wysokofruktozowych.

Właściwości słodzące – fruktoza najlepiej rozpuszczalny sacharyd. Spadek tendencji do krystalizacji, wzrost zdolności wiązania wody, zapobiega utracie wilgoci (owoce kandyzowane).

Enzym produkowany przez: Bacillus, Microbacterium, Artobacter, promieniowce Streptomyces, działa poza komórką.

2. LIGAZY, zwane potocznie syntetazami

Są to enzymy katalizujące syntezę – powstanie nowych wiązań: C–O, C–S, C–N, C–C.

Wszystkie reakcje katalizowane przez ligazy zachodzą z udziałem ATP lub innego związku makroergicznego.

Syntetazy katalizujące dołączenie do substratu CO₂ – nazywamy potocznie karboksylazami.

(jedyna klasa enzymów nie mająca bezpośredniego zastosowania w przemyśle spożywczym)

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

Kinetyka – badanie szybkości, z jaką przebiega reakcja chemiczna oraz czynników wpływających na tę reakcję. Nie zajmuje się naturą chemiczną związków.

Kinetyczny opis aktywności enzymów jest konieczny do zrozumienia działania enzymów (jakich czynników wymaga do swojej aktywności)

Czynniki wpływające na szybkość reakcji:

• stężenie enzymów i substratu

• występowanie i stężenie kofaktorów, inhibitorów i aktywatorów

• temperatura

• stężenie H⁺ (pH)

(oddziaływania allosteryczne, modyfikacje kowalencyjne, aktywacja proteolityczna)

Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej

Szybkość reakcji enzymatycznej jest miarą aktywności enzymu.

Szybkość określa się śledząc ubytek substratu lub przyrost produktu w jednostce czasu (częściej przyrost produktu).

Warunki konieczne:

1. Substrat w nadmiarze

2. Oznaczanie aktywności enzymatycznej wykonuje się na początku reakcji enzymatycznej, ponieważ może dojść do:

• hamowania aktywności enzymatycznej poprzez nagromadzenie się produktu, na drodze hamowania zwrotnego,

• denaturacji białka enzymatycznego.

Wpływ temperatury na szybkość reakcji

Temperatura wpływa na szybkość:

- tworzenia kompleksu ES

- przekształcenia go w EP

- dysocjację EP na E i P

Zmiany szybkości r-cji enzymat. pod wpływem wzrostu temp są wypadkową 2 procesów:

• wzrostu energii kinetycznej cząsteczki substratu → wzrost szybkości katalizy

• nasilającej się denaturacji białka E → utrata aktywności

Działa na cząsteczki S i E.

↑ temp. => ↑ en. kinetycznej cz. S

Cząsteczki substratu szybciej się poruszają, zderzają się częściej, więcej z nich może osiągnąć stan przejściowy.

W pewnym momencie osiągnięta zostaje temp. optymalna dla działania enzymu.

Temperatura optymalna – temperatura, przy której szybkość katalizowanej reakcji enzymatycznej jest maksymalna, a nie ma miejsca jeszcze denaturacja białka enzymatycznego. Jej wartość zależy od czasu trwania reakcji.

Na powyższym wykresie, kiedy linia spada już w dół, to oznacza to denaturację termiczną i obniżenie energii kinetycznej

Zbyt wysoka temp powoduje drgania w cz enzymu i dochodzi do rozerwania wiązań w E.

„Optimum temperatury” zależy od czasu przyjętego do obliczenia szyb reakcji, związane jest to z inaktywacją termiczną, którą uwidaczniają krzywe progresji w różnych temp.

Krzywe progresji w różnych temp.

(szybkość tworzenia produktu w różnych temp. jako funkcja czasu)

Optimum temp zależy od czasu przyjętego do reakcji enzymatycznej, więc nie może stanowić wartości liczbowej.

Przy 40ºC szybkość r-cji odpowiada szybkości początkowej, krzywa progresji w temp 40ºC ma cały czas liniowy kształt

Optimum temp w t2 to 70ºC, a w t3 (po 30min) to 50ºC, zaś 80ºC w t2 powoduje denaturację E

W 70ºC szybkość reakcji enzymatycznej (v) powoli spada i nie jest liniowa; osiąga wartość max i potem nie ma przyrostu produktu

Termostabilność – podatność E na denaturację cieplną, charakteryzuje dany E, ma znaczenie w procesach technolog.; jest wartością określoną dla każdego enzymu, którą możemy określić badając zakres temp, w której nie dochodzi do termicznej denaturacji białka i enzym zachowuje pełną aktywność w warunkach optymalnych/ nie dochodzi do inaktywacji enzymu.

v_o a zmiany temperatury

Wsp Q wskazuje ile razy zwiększa się szybkość r-cji, gdy temp wzrasta o 10ºC w zakresie temp < temp optymalnej:

• 2-3 – krotny wzrost szybkości dla reakcji nieenzymatycznej

• 1-2 – krotny wzrost szybkości dla reakcji enzymatycznej, ponieważ Q zależy od energii aktywacji, a dla reakcji enzymatycznej jest ona mniejsza niż dla reakcji nieenzymatyczne

• Dla każdego E istnieje optymalne pH działania, przy którym szybkość katalizowanej r-cji jest max.

- optimum pH 5-7/8, ale b.duża rozpiętość:

• pepsyna – pH b. kwaśne,

• peroksydaza – pH neutralne,

• arginaza – pH b. zasadowe >10.

Optimum pH – wartość pH, przy której szybkość katalizowanej reakcji jest maksymalna = max akt enzymu. Jeżeli E katalizuje r-cje odwracalne, to dla r-cji syntezy optimum pH może być inne niż dla r-cji odwrotnej.

pH środowiska wpływa na:

• wiązanie substratu przez E, aktywność katalityczną E, stan jonizacji substratu, zmiany w strukturze przestrzennej E

pH wpływa na stopień zdysocjowania (uprotonowania):

• grup funkcyjnych centrum aktywnego E, które wiążą substrat,

• grup funkcyjnych w centrum aktywnym, które uczestniczą w katalizie, czyli od których zależy sam akt katalityczny,

• grup funkcyjnych substratu, które uczestniczą w wiązaniu do enzymu,

• grup funkcyjnych leżących w pobliżu/poza centrum aktywnym, które decydują o konformacji tego centrum aktywnego.

Przeważnie grupy czynne c.a. enzymu wykazują właściwości katalityczne tylko w jednej z możliwych jonowych form, podobnie w większości przypadków tylko jedna z możliwych form grup jonizujących substratu jest wiązana i poddawana katalizie.

bie grupy muszą mieć ładunek – wtedy dochodzi doaktywacji enzymu!!!

Enzym w formie katalitycznie czynnej posiada – uprotonowaną grupę aminową i zjonizowaną grupę karboksylową.

Przy niskim pH grupy karboksylowe stopniowo zyskują protony [uprotonowanie] → enzym staje się nieaktywny

Gdy pH środowiska rośnie powoduje oddysocjowanie protonów z grupy aminowej (traci proton) → również powoduje utratę aktywności enzymu (utrata ładunku niezbędnego by E wiązał substrat)

Niewielkie odchylenie pH od wartości optymalnych powoduje nagły spadek szybkości reakcji enzymatycznej.

Stabilność enzymu w warunkach zmieniającego się pH

pH stabilność – zakres pH, w którym nie dochodzi do denaturacji białka enzymatycznego i E wykazuje pełną aktywność (w warunkach optymalnych).

Krzywa A nie daje inf czemu szybkość r. enzymatycznej spada poniżej opt pH. Może być to wynikiem nieodpowiedniego stopnia uprotonowania gr. f. w substracie, c.a. enzymu → przywołanie jak pH wpływa na stopień uprotonowania grup funkcyjnych (patrz wyżej)

Spadek akt pomiędzy 5 a optimum oraz optimum i 8 (zjawisko odwracalne) – nieodpowiedni stopień zdysocjowania grup … w c.a. enzymu lub substracie, spadek poniżej 5/8 → denaturacja (zjawisko nieodwracalne). Krzywa pozwala na wyznaczenie stabilności enzymu [zakresu, w którym nie dochodzi do denaturacji jego białek]

Optimum temp - musi być uwzględniony czas, zależy od czasu (bo termiczna deaktywacja E). Oznaczanie akt E prowadzi się w początkowej fazie reakcji.

Przy bardzo wysokich stęż substratu brak zależności między czynnikami → dalszy wzrost stęż S nie

ma wpływu na dalszą reakcję

Km – jest to takie stężenie substratu [mol/l], przy którym reakcja biegnie z szybkością równą połowie szybkości maksymalnej

– jest to takie stężenie substratu, przy którym połowa miejsc aktywnych jest obsadzona substratem (wysycona)

– charakteryzuje daną aktywność enzymu, informuje o jego właściwościach, powinowactwie do S

– dla większości enzymów wartości Km leżą w przedziale od 10^-1 do 10^-7 M (stęż molowe)

Szybkość początkowa r-cji enzymatycznej V_o:

- określa szybkość tworzenia P lub ubytku S we wczesnym etapie r-cji, gdy stęż S nie uległo zmianie i jest równe stęż początkowemu (czyli jest V r-cji w czasie 0)

Zalety wyznaczania w V₀:

- V₀ – bo najłatwiej jest ustalić parametry r-cji

- nie ma denaturacji E (unika się błędów spowodowanych postępującą inaktywacją enzymu)

- stęż P jest niskie/lub go nie ma; produkt hamowałby reakcję – nie trzeba uwzględniać zjawiska inhibicji produktem

- mało P – nie trzeba brać pod uwagę r-cji odwracalnej wpływającej na V r-cji

- znane jest stęż początkowe S

WARUNKI:

1. Substrat jest w nadmiarze (r-cja zgodnie z kinetyką 0 rzędu w stosunku do stęż S)

2. Pomiary V r-cji – dokonywać w fazie początkowej (V nie zmienia się pod wpł czasu r-cji)

Jedn aktywności

• jedn standardowa (uniwersalna) – jest to taka ilość enzymu, która przekształca 1mmol substratu w ciągu 1min w optymalnym pH i temp 30ºC, przy nadmiarze substratu.

• katal – jest to taka ilość enzymu, która przekształca 1mol substratu w ciągu 1s w temp 30ºC przy optymalnym pH i przy nadmiarze substratu. Ponieważ katal w porównaniu do U jest jednostką bardzo dużą, powszechnie stosuje się częściej mikro- i nanokatale.

aktywność właściwa – jest to ilość jednostek uniwersalnych lub katali przeliczona na

KINETYKA R-CJI ENZYMATYCZNEJ 1 SUBSTRATOWEJ NIEODWRACALNEJ – model Michaelisa-Menten uzupełniony przez Briggsa-Hildane’a

ZAŁOŻENIA:

1. konieczność utworzenia odwracalnego kompleksu ES, który może dysocjować z powrotem do E i S lub przekształcić się w P, ale P nie może przekształcić się w S

2. założenie ustalającego się po kilku milisekundach stanu stacjonarnego → stężenie kompleksu ES ([ES]) jest niezmienne

Zaleca się aby pomiarów szybkości katalizy enzymatycznej dokonywać w początkowej fazie r-cji, gdy szybkość r-cji (przyrost [P] lub ubytek [S] w jednostce czasu) nie zmienia się w czasie trwania r-cji i jest równa szybkości początkowej r-cji (v₀).

Przy stałym stężeniu E i S szybkość powinna być wprost proporcjonalna do czasu r-cji.

V₀ – podaje przyrost [P] lub ubytek [S] jaki uzyskano by w dowolnym czasie, gdyby stężenie S nie uległo zmianie i było równe stężeniu początkowemu

Szybkość początkowa – linia prosta (wprost proporcjonalna do czasu trwania)

Podstawową czynnością w badaniu jest:

- ustalenie zakresu czasu, w którym szybkość r-cji enzymatycznej jest wprost proporcjonalna do czasu trwania r-cji; - ustalenie zakresu czasu, w którym reakcja biegnie zgodnie z kinetyką zerowego rzędu

Stała k_cat i jej wyznaczanie:

k_cat – miara wydajności katalitycznej (skuteczności, reaktywności) w warunkach pełnego wysycenia enzymu substratem

[S] >> Km

[E]_T = [ES] warunki pełnego wysycenia E substratem

[E] _T – całkowite stężenie enzymu

[E] – stężenie wolnego enzymu = 0

Stała kinetyczna k₂ zwana jest k_cat – liczba obrotów E, czyli liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkt r-cji w jednostce czasu przez pojedyncze miejsce katalityczne (E z 1 c.a. → zwykle E ma 1 c.a., ale jak ma więcej to trzeba podzielić) w warunkach pełnego wysycenia E substratem. Jej wymiar to s^-1 lub min^-1. Dla większości enzymów w granicach od 1 do 10⁴ s^-1.

Stała k_cat/Km

- określa wydajność katalityczną w warunkach fizjologicznych, niepełnego wysycenia E substratem, czyli [S] << Km

Czyli w warunkach [S] << Km szybkość zależy od k_cat / Km, jej wymiar to s^-1 M^-INHIBICJA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW umożliwia:

• identyfikację reszt istotnych dla aktywności enzymów

• poznanie mechanizmów działania enzymów

• działanie leków i czynników toksycznych

• mechanizm kontroli aktywności enzymów

PODZIAŁ INHIBICJI

1. Nieodwracalna

2. OdwracaPoznanie mechanizmu działania enzymu, umożliwia przewidzenie przy jakim stężeniu substratu dany inhibitor jest najbardziej efektywny:

- kompetencyjne inhibitory są najbardziej efektywne gdy [S] < Km

- akompetycyjne gdy [S] > Km

- niekompetycyjne są efektywne niezależnie od stężenia substratu

INHIBICJA ODWRACALNA

- możliwa jest dysocjacja kompleksu EI

- I wiąze się z E wiąz. niekowalencyjnym

-

-

1. INHIBICJA KOMPETYCYJNA (WSPÓŁZAWODNICZĄCA)

• inhibitor kompetycyjny zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej (kompleks katalitycznie nieaktywny) przez zmniejszenie liczby cząsteczek enzymu wiążących substrat; brak zmian konformacyjnych

• inhibicję kompetycyjną można znieść przez zwiększenie stężenia substratu (wyparcie inhibitora) – odwracalność (zwycięża ten, który jest w nadmiarze)

• V_max nie ulega zmianie (bo konformacja E nie zmienia się, gdy wzrost S to S może przyłączyć się do centr akt i E jest wtedy aktywny - Vmax), zwiększa się K_m

1. działanie malonianu (inhibitor komp) na dehydrogenazę bursztynianowi (E cyklu Krebsa)

Malonian ma bardzo podobną budowę do substratu bursztynianu (jest analogiem).

Przykład ten jest wyjątkowym przypadkiem. Inne przypadki inhibitorów konkurencyjnych wykazują zazwyczaj mieszane działanie, inhibitora konkurencyjnego i akompetycyjnego.

1. hamowanie syntezy białka przez analogi aminokwasów białkowych (aminokwasy niebiałkowe), np. niektóre leki, niektóre pestycydy, antybiotyki

2. hamowanie oksydazy polifenolowej (E katalizujący główny etap enzymatycznego brązowienia warzyw i owoców) przez kwas para-hydroksybenzoesowy (brązowienie warzyw i owoców)

Analog katecholu – grupa -OH w tym samym miejscu, a w drugim -COOH

INHIBITOR NIEKOMPETYCYJNY

(w modelu Koshlanda – 2 msc – msc wiązania S i msc katalityczne)

• Nie zakłóca wiązania S, tylko wiąże się w innym miejscu niż miejsce wiązania substratu lub w c.a., ale w miejscu katalitycznym, wywołując zmiany konformacyjne niekorzystne dla miejsca katalitycznego (dla katalizy)

• inhibitor nie jest strukturalnie podobny do substratu, nie może wiązać się w miejscu wiązania substratu, tylko w miejscu katalitycznym lub poza c.a. → obniża szybkość maksymalną katalizy

• zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej poprzez zmniejszenie liczby obrotów enzymu (obniża stężenie funkcjonalnego enzymu, pozostała część funkcjonalnego enzymu zachowuje się jak bardziej rozcieńczony roztwór enzymu)

• inhibitor niekompetycyjny nie wpływa na przyłączanie substratu do enzymu – nie wpływa na powinowactwo E do S; nie zakłóca wiązania S, ale S nie może dalej być przekształcany w P

• Substrat jest wiązany, bez zaburzeń, ale r-cja jest mniej wydajna

• nie zmienia K_m, obniża V_max (Enzym działa mniej wydajnie, nie jest reaktywny)

Nie można znieść inhibicji niekompetycyjnej zwiększając stężenie substratu, lecz poprzez związanie inhibitora przez inny związek

Stosujemy wysokie stężenie związków, które wiążą inhibitor – można znieść inhibicję niekompetencyjną. Są to związki, do których I ma większe powinowactwo niż do E.

PRZYKŁADY:

1. wzrost [H+] dla chymotrypsyny blokuje akceptor protonów w m. katalitycznym

2. działanie jonów metali ciężkich, np. Cu²⁺, Hg²⁺, Ag²⁺, które wiążą się z gr. –SH cysteiny w miejscu katalitycznym lub poza nim (tworzą się merkaptydy)

3. działanie cyjanków, azydków i fluorków, które wiążą jony metali np. Fe²⁺ lub Fe³⁺ (tworzą one kompleksy z jonami Fe podobne do żelazicyjanków i żelazocyjanków)

4. działanie czynników chelatujących dwuwartościowe kationy, np. EDTA (etylenodiaminotetraoctan) wiążący jony Mg²⁺.

W wielu przypadkach dla inhibitorów nieodwracalnych otrzymuje się parametry kinetyczne (K_m, V_max) charakterystyczne dla inhibitorów odwracalnych niekompetycyjnych, stąd wiele zamieszania, np. co do działania cyjanków.

INHIBITOR AKOMPETYCYJNY

• wiąże się w innym miejscu niż miejsce wiązania substratu, wiąże się do kompleksu ES, tworząc nieaktywny katalitycznie kompleks ESI

• związanie substratu przez enzym odsłania miejsce wiązania inhibitora

• obniża V_max i K_m (rośnie pozorne powinowactwo E do S, I stabilizuje kompleks ES, nie jest przetwarzany w E i P) (spadek Km – pozorny wzrost powinowactwa E do S, z powodu stabilizacji ES w wyniku przyłączenia I)

• nie można go znieść przez zwiększenie stężenia substratu

Ten typ inhibicji jest dość rzadki i może dotyczyć niektórych enzymów multimerycznych, katalizujących reakcje z udziałem wielu substratów.

Mieszana

• inhibitor może wiązać się do E lub kompleksu ES

• nie ważne założenie o niezależności miejsc wiązania S i I, tak jak w inhibicji niekompetycyjnej

• inhibitor może się wiązać w centrum aktywnym (miejscu wiązania substratu lub miejscu katalitycznym) lub poza nim

• inhibitor wpływa jednocześnie na wiązanie substratu, jak również liczbę obrotów enzymu

Aktywność wszystkich enzymów może być regulowana w komórce przez zmiany:

• pH,

• potencjału oksydoredukcyjnego,

• temperatury,

• zmiany stężenia substratów, produktów, inhibitorów i kofaktorów,

• przez czynniki strukturalne.

Sposoby regulacji aktywności enzymatycznej tzw. enzymów regulatorowych:

1. poprzez odwracalną modyfikację kowalencyjną

2. przez aktywację proteolityczną

3. na drodze oddziaływań allosterycznych

• sprzężenie zwrotne

• działanie hormonów

• kompleksy wieloenzymowe

1. wiązanie białek regulatorowych

• np. kalmoduliny (białko o masie cząsteczkowej 17 kDa aktywuje liczne enzymy w odpowiedzi na wysokie stężenie Ca²⁺

Odwracalna modyfikacja kowalencyjna

• polega na przyłączeniu do cząsteczki enzymu małej grupy niebiałkowej

• przyłączenie to zachodzi za pomocą wiązań kowalencyjnych i przy udziale innej cząsteczki enzymu -> zmiany białka korzystne lub nie

Sposoby odwracalnej modyfikacji kowalencyjnej

- fosforylacja i de fosforylacja

- adenylacja (przyłączanie AMP)

-ADP- rybozylacja

- acetylacja

-alkilacja

Sulfurylacja( siarczanowanie)

- ubikwitynacja

- farnezylacja (gr. Izoprenoidowa)

Fosforylacja i defosforylacja (przyłączenie i odłączenie grupy fosforanowej)

Fosforylacja lub defosforylacja zmienia konformację białka wpływając na jego aktywność katalityczną. Zachodzi tylko wewnątrz komórki, bo wymagany jest ATP.

Istnieją 3 klasy kinaz białkowych:

1. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt –OH seryny i treoniny enzymu

2. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt –OH tyrozyny enzymu

3. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt –OH Ser, Thr lub Tyr

Specyficzność kinaz

1. Specyficzne kinazy białkowe – fosforyzują jedno białko lub kilka bardzo podobnych do siebie

2. Wielofunkcyjne kinazy białkowe- fosforyzują wiele różnych białek , koordynują różne procesy

Fosforylacja i Defosforylacja: 30% białek eukariotycznych podlega fosforylacji

Przykłady:

• Synteza glikogenowa – forma aktywna – forma zdefosforylowana

• Fosforylaza glikogenowa – forma aktywna – forma ufosforylowana

• Reduktaza azotanowa

- forma aktywna – 1 reszta seryny ufosforylowana

- forma nieaktywna 0 3 reszty seryny ufosforylowane

• Lipazy – forma aktywna – forma ufosforylowana

Inne typy odwracalnej modyfikacji kowalencyjnej:

• Adenylacja (przyłaczanie AMP),

• ADP-rybozylacja,

• Acylacja, acetylacja,

• Sulfurylacja (siarczanowanie),

• Ubikwitynacja,

• Farnezylacja.

Aktywacja proteolityczna (np. zymogenów)

• polega na specyficznej hydrolizie jednego lub kilku wiązań peptydowych i odłączeniu fragmentu łańcucha polipeptydowego (odcinka prekursorowego),

• powoduje zmianę konformacyjną białka umożliwiającą wytworzenie lub odsłonięcie centrum aktywnego,

• jest procesem nieodwracalnym (zachodzi tylko 1 raz dla każdego enzymu),

• może zachodzić pozakomórkowo, bo nie wymaga ATP.

Nieaktywny prekursor nazywamy zymogenem lub proenzymem

1. Aktywacja zymogenów proteolitycznych enzymów trawiennych (pepsyna, chymotrypsyna, trypsyna, karboksypeptydaza, elastaza)

2. Krzepnięcie krwi – kaskadowy proces aktywacji proteolitycznej

3. hormony np. proinsulina insulina

4. prokolagen kolagen

Przykłady aktywacji zymogenów enzymów proteolitycznych

chymozyna-Gly syntetyzowana w środowisku żołądka (pH~7) – w tym pH centrum aktywne enzymu jest zasłonięte/blokowane przez odcinek prekursorowi

- lizyna odcinek prekursorowi oddziaływuje elektrostatycznie z dwoma resztami kw. asparaginowego CA

- 6 łańcuchów bocznych lizyny i argininy z odcinki prekursorowym tworzy wiązania jonowe (elektrostatyczne) z grupami karboksylowymi kwasu glutaminowego i asparaginowego z części zymogenu należącego do aktywnej części enzymu

W środowisku kwaśnym pH<5

• Uprotonowanie grup karboksylowych (-COOH) – bez ujemnych ładunków -> zerwanie wiązań jonowych między odcinkiem prekursorowym i częścią tworzącą po aktywacji część aktywną

• Odcinek prekursorowi nie jest stabilizowany w pozycji zasłaniającej CA -> ma miejsce:

• Odsłonięcie CA

• Katalityczna hydroliza wiązania peptydowego między odcinkiem prekursorowym a pozostałą częścią zymogenu, która staje się enzymem aktywnym.

Niezbędne jest środowisko kwaśne do odsłonięcia centrum aktywnego.

Tempo aktywności rośnie wraz ze spadkiem pH (do pH = 2).

Enzym allosteryczny :

– enzym, którego aktywność może być regulowana na drodze oddziaływań allosterycznych-koopertatywne wiaznie substaru(najczęściej pozytywne) oraz modyfikacja aktywności poprzez efektory allosteryczne

Oddziaływania allosteryczne (kooperatywne) – oddziaływania między przestrzennie oddalonymi miejscami w cząsteczce enzymu, czyli pomiędzy:

1. Miejscami wiążącymi substrat (c. aktywnymi)

2. Miejscami wiążącymi efektor (c. allosterycznymi)

3. Miejscami wiążącymi substrat i miejscami wiążącymi efektor (c. aktywne <-> c. allosteryczne)

Centrum allosteryczne – miejsce inne niż centrum aktywne, do którego przyłącza się efektor (inhibitor lub aktywator allosteryczny)

Efektor allosteryczny - drobnocząsteczkowy związek organiczny lub nieorganiczny przyłączający się w innym miejscu niż centrum aktywne (do c. allosterycznego) wpływający na zmiany konformacyjne centrum aktywnego enzymu, wpływa więc na powinowactwo enzymu do substratu, nie wpływa zaś na V_max.

Homotropowa – oddziaływanie pomiędzy dwoma CA

Heterotropowa – oddziaływanie pomiędzy CA a allosterycznym

Kooperatywność pozytywna homotropowa

- np. stymulowanie wiązania substratu przez substrat

Kooperatywność pozytywna heterotropowa

- np. stymulowanie wiązania substratu przez efektor (aktywator allosteryczny)

Kooperatywność negatywna homotropowa

- np. zakłócenie wiązania substratu przez substrat (rzadko)

Kooperatywność negatywna heterotrpowa

- np. zakłócenie wiązania substratu przez efektor (inhibitor allosteryczny)

Enzymy allosteryczne

• Zwykle zbudowane z kilku podjednostek, z których każda ma jedno lub więcej miejsc aktywnych,

• Zwykle poza centrum aktywnym posiada również centrum allosteryczne,

• Aktywność może być regulowana, modyfikowana przez efektory allosteryczne,

• Sigmoidalna zależność V do [S] (nie stosuje się kinetyka Michaelita-Menten).

Allosteryczne efektory - Nie zawsze tworzą kompleksy, które podlegają dalszym zmianom, ale zmieniają konformację enzymu – wpływają na jego powinowactwo do substratu

Zależność sigmoidalna jest wynikiem kooperatywnego wiązania substratu. Związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmieniać powinowactwo innych miejsc aktywnych enzymu – na ogół zwiększenie powinowactwa

Sigmoidalna zależność szybkości reakcji od stężenia substratu dla enzymu allosterycznego

Porównanie modeli allosterycznych

W modelu jednoprzejściowym przyłączenie do jednej podjednostki jednej cząsteczki ligandu powoduje przejście całej cząsteczki enzymu (wszystkich podjednostek) w stan o większym (mniejszym) powinowactwie.

Jeśli ligandem jest substrat, to w większości przypadków jego przyłączenie wywołuje pozytywne oddziaływanie

Negatywne sprzężenie zwrotne

końcowy produkt (względnie produkt pośredni) wieloetapowego szlaku metabolicznego jest inhibitorem allosterycznym enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego szlaku.

Pozytywne sprzężenie zwrotne

ajczęściej substrat pierwszej reakcji wieloetapowego ciągu przemian jest aktywatorem allosterycznym enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego ciągu przemian.

Np. aktywacja syntazy cytrynianowej (acetylo-CoA + szczawiooctan = cytrynian) przez acetylo-CoA

INHIBICJA NIEODWRACALNA

• inhibitor zwykle tworzy kowalencyjnie wiązanie z grupą funkcyjną enzymu lub wiąże się tak silnie, że jego dysocjacja jest bardzo powolna

• w przypadku inhibicji nieodwracalnej nie może być stosowana zależność Michaelisa-Menten (bo stężenie enzymu nie ma wpływu)

c) działanie leków: antybiotyki, penicylina

• penicylina – łączy się z gr. OH w centrum aktywnym enzymu (transpeptydaza peptydoglikanu – odpowiada za prawidłowe struktury, wykształcenie ścian kom. bakterii) hamuje wzrost bakterii

• aspiryna – inh. nieodwracalna – cyklooksygenazy wytwarzają cząst. sygnałowe stanu zaplanego spadek syntezy cząst. sygnałowych

Aktywność wszystkich enzymów może być regulowana w komórce przez zmiany:

• pH,

• potencjału oksydoredukcyjnego,

• temperatury,

• zmiany stężenia substratów, produktów, inhibitorów i kofaktorów,

• przez czynniki strukturalne (głównie bł. kom, bo niektóre z enzymów są zlokalizowane w odp. organellach kom.)

Enz. regulatorowe – E In vitro odp. za regulację tempa przemian szlaków metabolicznych

POZIOMY REGULACJI AKTYWNOŚCI ENZYMÓW:

1. ekspresja genów – odpowiada za liczbę i rodzaj powstających białek enzymatycznych

2. regulacja istniejących enzymów

SPOSOBY REGULACJI AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ TZW. ENZYMÓW REGULATOROWYCH:

1. poprzez ODWRACALNĄ MODYFIKACJĘ KOWALENCYJNĄ

2. przez AKTYWACJĘ PROTEOLITYCZNĄ

3. na drodze ODDZIAŁYWAŃ ALLOSTERYCZNYCH

• sprzężenie zwrotne

• działanie hormonów

• kompleksy wieloenzymowe

1. WIĄZANIE BIAŁEK regulatorowych

• np. kalmoduliny (białko o masie cząsteczkowej 17 kDa aktywuje liczne enzymy w odpowiedzi na wysokie stężenie Ca²⁺

ODWRACALNA MODYFIKACJA KOWALENCYJNA

polega na przyłączeniu do cząsteczki enzymu małej grupy niebiałkowej za pomocą wiązań kowalencyjnych i przy udziale innej cząsteczki enzymu -> zmiany białka korzystne lub nie

Sposoby odwracalnej modyfikacji kowalencyjnej:

1. Fosforylacja i defosforylacja

2. Adenylacja (przyłaczanie AMP),

3. ADP-rybozylacja,

4. Acylacja, acetylacja,

5. Alkilacja (gr. metylowych lub etylowych)

6. Sulfurylacja (siarczanowanie),

7. Ubikwitynacja,

8. Farnezylacja (gr. izoprenoidowa)

A. Fosforylacja i defosforylacja (przyłączenie i odłączenie grupy fosforanowej)

Sama fosforylacja jest nieodwracalna, ale w połączeniu z defosforylacją – tworzy odwracalny proces

Fosforylacja lub defosforylacja zmienia konformację białka wpływając na jego aktywność katalityczną. Zachodzi tylko wewnątrz komórki, bo wymagany jest ATP.

Istnieją 2 klasy kinaz białkowych:

1. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt –OH seryny i treoniny enzymu

2. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt –OH tyrozyny enzymu

Specyficzność kinaz:

1. Specyficzne kinazy białkowe – fosforylują 1 białko lub kilka białek podobnych do siebie

2. Wielofunkcyjne kinazy białkowe – fosforyzują wiele różnych białek koordynują różne procesy

Przykłady:

• Syntaza glikogenowa – forma aktywna – forma zdefosforylowana – synteza glikogenu

• Fosforylaza glikogenowa – forma aktywna – forma ufosforylowana – rozkład glikogenu

• Reduktaza azotanowa – wykrywanie azotanów w warzywach i owocach

- forma aktywna – 1 reszta seryny ufosforylowana

- forma nieaktywna 3 reszty seryny ufosforylowane

• Lipazy – forma aktywna – forma ufosforylowana

- forma nieaktywna – forma zdefosforylowana

DLACZEGO FOSFORYLACJA I DEFOSFORYLACJA JEST DOBRYM SPOSOBEM REGULOWANIA AKTYWNOŚCI ENZYMU

• Enzym zyskuje 2 ładunki ujemnie – zniesienie istniejących oddziaływań elektrostatycznych i wytworzenie innych powoduje zmiany strukturalne, które mogą wpływać na powinowactwo E do S i aktywność katalityczną E

• Fosforylacja i defosforylacja mogą przebiegać w czasie krótszym niż 1 sekunda lub kilka godzin, co umożliwia dostosowanie kinetyki tych procesów do potrzeb metabolizmu w danym momencie

• Skutkiem fosforylacji jest silne wzmocnienie sygnału (1 cz. kinazy działa na setki cz. docelowych enzymu)

• Podczas fosforylacji uwalniana jest znaczna ilość energii; część z tej energii służy do podtrzymania nieodwracalnego charakteru reakcji fosforylacji; natomiast część zmagazynowana w ufosforylowanym białku i wykorzystywane jest do zmian konformacyjnych, będących wynikiem przyłączenia reszty fosforanowej

• 2 ładunki ujemne – mogą tworzyć wiązania wodorowe i oddziaływać z donorami protonów.

1. AKTYWACJA PROTEOLITYCZNA (NP. ZYMOGENÓW)

• polega na specyficznej hydrolizie jednego lub kilku wiązań peptydowych i odłączeniu fragmentu łańcucha polipeptydowego (odcinka prekursorowego),

• odłączenie to powoduje zmianę konformacyjną białka umożliwiającą wytworzenie lub odsłonięcie centrum aktywnego,

• jest procesem nieodwracalnym (zachodzi tylko 1 raz dla każdego enzymu),

• może zachodzić pozakomórkowo, bo nie wymaga ATP (a fosforylacja nie może).

NIEAKTYWNY PREKURSOR NAZYWAMY ZYMOGENEM LUB PROENZYMEM (wiele białek sygnałowych- jest jako nie aktywny prekursor, które potem ulegają aktywacji proteolitycznej ) np. :

1. Aktywacja (zymogenów proteolitycznych) enzymów trawiennych (pepsyna, chymotrypsyna, trypsyna, karboksypeptydaza, elastaza) – w miejscu działania ulegają aktywacji

2. Białka, biorące udział w krzepnięciu krwi – kaskadowy proces aktywacji proteolitycznej (zaktywowana forma jednego z czynników powoduje aktywację kolagenu; jeden uaktywniony czynnik aktywuje kolejny)

3. hormony np. proinsulina insulina

4. prokolagen kolagen (białka strukturalne – rozpoznają prekursor )

Przykłady aktywacji zymogenów enzymów proteolitycznych

chymozyna-Gly syntetyzowana w środowisku żołądka (pH~7) – w tym pH centrum aktywne enzymu jest zasłonięte/blokowane przez odcinek prekursorowy nieaktywne

- lizyna odcinek prekursorowi oddziaływuje elektrostatycznie z dwoma resztami kw. asparaginowego c.a.

- 6 łańcuchów bocznych lizyny i argininy z odcinka prekursorowego tworzy wiązania jonowe (elektrostatyczne) z grupami karboksylowymi kwasu glutaminowego i asparaginowego z części zymogenu należącego do aktywnej części enzymu

W środowisku kwaśnym pH<5

• Uprotonowanie grup karboksylowych (-COOH) – bez ujemnych ładunków zerwanie wiązań jonowych między odcinkiem prekursorowym i częścią tworzącą po aktywacji część aktywną; niemożność tworzenia wiązań jonowych z grupami aminowymi naładowanymi dodatnio

• Odcinek prekursorowy nie jest stabilizowany w pozycji zasłaniającej c.a. ma miejsce:

• Odsłonięcie c.a. – aktywacja c.a.

• autokatalityczna hydroliza wiązania peptydowego między odcinkiem prekursorowym, a pozostałą częścią zymogenu, która staje się enzymem aktywnym.

Niezbędne jest środowisko kwaśne do odsłonięcia centrum aktywnego.

Tempo aktywności rośnie wraz ze spadkiem pH (do pH = 2).

III.ODDZIAŁYWANIA ALLOSTERYCZNE (KOOPERATYWNE)

– oddziaływania między przestrzennie oddalonymi miejscami w cząsteczce enzymu, czyli pomiędzy:

1. Miejscami wiążącymi substrat (m. aktywnymi)

2. Miejscami wiążącymi cz. regulatorowe/efektor (m. allosterycznymi, regulatorowymi)

3. Miejscami wiążącymi substrat i miejscami wiążącymi efektor (m. aktywne <-> m. allosteryczne)

Enzym allosteryczny – enzym, którego aktywność może być regulowana na drodze oddziaływań allosteryczncyh.

Centrum allosteryczne – miejsce inne niż centrum aktywne, do którego przyłącza się efektor (inhibitor lub aktywator allosteryczny)

Efektor allosteryczny - drobnocząsteczkowy związek organiczny lub nieorganiczny przyłączający się w innym miejscu niż centrum aktywne (do c. allosterycznego) wpływający na zmiany konformacyjne centrum aktywnego enzymu, wpływa więc na powinowactwo enzymu do substratu, nie wpływa zaś na V_max.

Inhibitor allosteryczny – wpływa na zmianę konformacji niekorzystnej dla przebiegu katalizy/reakcji enzymatycznej, zmniejsza zdolność E do wiązania S, zmniejsza powinowactwo E do S, wpływa na przebieg reakcji E – opóźnia osiągnięcie V_max

Aktywator allosteryczny – przeciwnie

Enzymy allosteryczne

• Zwykle zbudowane z kilku podjednostek, z których każda ma jedno lub więcej miejsc aktywnych, gdy jest ich dużo może nie być podjednostek regulatorowych

• Zwykle poza centrum aktywnym posiada również centrum allosteryczne, kooperatywne wiązanie substratu (najczęściej pozytywna oraz modyfikacja aktywności przez efektor allosteryczny)

• Aktywność może być regulowana, na drodze aktywności allosterycznych wiąże substrat oraz modyfikacja aktywności przez efektory allosteryczne,

• Sigmoidalna zależność V do [S] (nie stosuje się kinetyka Michaelita-Menten).

• BUDOWA: podjednostka katalityczna (wiąże substrat) i ew. podjednostka regulatorowa (miejsce wiązania efektora allosterycznego)

ENZYMY OLIGOMERYCZNE

Negatywny efektor allosteryczny - Nie zawsze tworzą kompleksy, które podlegają dalszym zmianom, ale zmieniają konformację c.a. enzymu (z niekorzystnej na korzystną; łańcuchów bocznych aminokwasów) – wpływają na jego powinowactwo do substratu; przyłącza się w c. allosterycznym, często współzawodniczy o to c. z……………………..

Wzrost powinowactwa E do S wpływa na przebieg reakcji przez przyśpieszenie V_max.

Pozytywna – zwiększenie powinowactwa E do innych cząst. tego samego lub innego ligandu

Negatywna – zmniejszenie -//-

Homotropowa – oddziaływanie pomiędzy dwoma CA; zw. 1 cząst. ligandu (S lub efektor alloster.) wpływa na wiązanie przez E kolejnych cz. tego samego ligandu.

Heterotropowa – oddziaływanie pomiędzy CA, a allosterycznym. Związanie 1 cząst. ligandu wpływa na powinowactwo E do innego ligandu np. efektor wpływa na powinowactwo E do S

Kooperatywność pozytywna homotropowa

- np. stymulowanie wiązania substratu przez substrat

Kooperatywność pozytywna heterotropowa

- np. stymulowanie wiązania substratu przez efektor (aktywator allosteryczny)

Kooperatywność negatywna homotropowa

- np. zakłócenie wiązania substratu przez substrat (rzadko)

Kooperatywność negatywna heterotrpowa

- np. zakłócenie wiązania substratu przez efektor (inhibitor allosteryczny)

Wiązanie inhibitora wpływa na wiąz. cz. S – dlatego heterotropowa

PORÓWNANIE MODELI ALLOSTERYCZNYCH

• W modelu jednoprzejściowym przyłączenie do jednej podjednostki jednej cząsteczki ligandu powoduje przejście całej cząsteczki enzymu (wszystkich podjednostek) w stan o większym (mniejszym) powinowactwie (forma T w formę R po przyłączeniu ligandu). Zachowana symetria cząsteczki.

Jeśli ligandem jest substrat, to w większości przypadków jego przyłączenie wywołuje pozytywne oddziaływanie

• Model sekwencyjny – związanie ligandu do 1 z podjednostek powoduje zmiany konformacji w obrębie 1 podjednostki, które są przenoszone też na podjednostkę z nią sąsiadującą np. powinowactwa występują tylko w 2 podjednostkach. W przypadku przyłączenia kolejnej cz. ligandu kolejne podjednostki ulegają zmianie.

KINETYKĘ ENZYMÓW ALLOSTERYCZNYCH OPISUJE MODEL SIGMODA

Zależność sigmoidalna jest wynikiem kooperatywnego wiązania substratu. Związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmieniać powinowactwo innych miejsc aktywnych enzymu – na ogół zwiększenie powinowactwa

SIGMOIDALNA ZALEŻNOŚĆ SZYBKOŚCI REAKCJI OD STĘŻENIA SUBSTRATU DLA ENZYMU ALLOSTERYCZNEGO

1. karbamoilotransferaza asparaginowa?? Chyba ornitynowa (poniższa r jest do ornitynowej, ale na wd była asparaginianowa) :

- inhibitor allosteryczny :CTP

- aktywator allosteryczny: ATP

R z wd: Karbomoilofosforan + asparaginian N-karbamoiloasparaginian

2. fosfofruktokinaza:

- inhibitor allosteryczny: ATP

- aktywator allosteryczny: AMP, fruktozo-2,6-bisfosforan

Negatywne sprzężenie zwrotne

końcowy produkt (względnie produkt pośredni) wieloetapowego szlaku metabolicznego jest inhibitorem allosterycznym enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego szlaku.

Żródłem enzymów są przede wszystkim:

-grzyby strzępkowe (rodzaje: Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Mucor)

-bakterie (rodzaj Bacillus, rzadziej Escherichia)

-drożdże (rodzaj Saccharomyces, Kluyveromyces

Bezpieczne gatunki powszechnie stosowane:

-grzyby strzępkowe: Asperillus oryzae, Asperillus niger, Rhizomucor miehei

-drożdże: Saccharomyces cerevisiae, Klyveromyces lactis

-bakterie: Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis

Preparaty mikrobiologiczne podlegają ocenie toksykologicznej m. in.: nie mogą być produkowane przez mikroorganizmy: chorobotwórcze, produkujące toksyczne metabolity, wykazujące aktywność antybiotyczną.

Izoluje się gen odpowiadający za dane enz. –wszczepia się te geny obu i „zmusza się go” do produkcji danego ezn.

Dezintegracja komórek mikroorganizmów:

1. Mechaniczne

   • Rozcieranie z substancjami ściernymi, np. z piaskiem

   • Ucieranie w ciekłym azocie

   • Rozcieranie w homogenizatorach, np. typu Pottera-Elvehjem’a (homogenizator tłokowo-ściskowy)

   • Homogenizatory nożowe (elementy rozdrabniające – nożyki)

   • Młyny kulowe - dezintegracja polega na bardzo, bardzo szybkim mieszaniu komórek organizmów z kulkami szklanymi- mechanizm uszkadzania ścian komórkowych

   • prasy wysokociśnieniowe, np. prasa typy French’a (spręża się komórki w powietrzu, N, CO₂- a następnie szybko rozpręża)

   • bonifikacja (ultradźwięki) – wibracje tzw. fale kawitacji wywoływane przez ultradźwięki mechanicznie uszkadzają ściany komórkowe

2. Fizyczne

   • szok osmotyczny (zmiany ciśnienia osmotycznego)

   • szok ciśnieniowy

   • kilkakrotne zamrażanie i rozmrażanie, np. w ciekłym N (wzrost objętości zamarzającej w cytoplazmie wody oraz powstają kryształy lodu → uszkodzenie błony komórkowej)

   • suszenie (powietrzem, w próżni, liofilizacja, acetonem)

3. Chemiczne

   • Detergenty (Triton x-100) siarczan dodecylu sodu, siarczan sarkozylu, zastępują lipidy i powodują dezintegrację błony komórkowej

   • rozpuszczalniki organiczne (rozpuszczające głównie fosfolipidy) mogą być niebezpieczne w stosowaniu: aceton, alkohol, może powodować denaturację enzymów

4. Enzymatyczne

   • enzymy lityczne rozkładają składniki ściany komórkowej, stosuje się najczęściej: lizozym, glukanazy, hitynazy, glikozydazy

   • lizozym trawiący bakteryjne peptydoglikany

   • glukanaza trawiąca glukan u drożdzy

   • ellulaza u roślin

Na skalę przemysłową stosuje się najczęściej:

-dezintegrację ciśnieniową

-mechaniczną (z kulami szklanymi)

-prasa typu French’a

Bufor ekstrakcyjny - właściwości:

1. enzym powinien być rozpuszczalny w roztworze ekstrakcyjnym, pH odległe od punktu izoelektrycznego białka (bo wtedy białko łatwo wypada z roztworu)

2. odpowiednia siła jonowa(odp. Stężenie soli) i odpowiednie stężenie rozpuszczalnika oganicznego

3. odpowiednia pojemność buforowa (aby utrzymać odpowiednie pH po dezintegracji błony komórkowej)

4. temperatura buforu w okolicy +4ºC (ogranicza denaturację białek, hamuje peptydazy (optimum temp. 20-30 ºC)

5. stosowanie inhibitorów peptydaz

   • Pepstatyna- hamuje peptydazy aspartylowe np. chymozyna- w centrum aktywnym zawierają kwas asparaginowy

   • Leupeptyna- hamuje peptydazy serynowe lub cysteinowe

   • EDTA-tworzy kompleksy chylatowe za pomocą 4 atomów tlenu i 2 atomów azotu z dwuwartościowymi jnami większości metali , hamuje metalopeptydazy lub metaloproteinazy- helatują jony metali. Zazwyczaj stosowany w postaco soli disodowej ze względu na jej wiekszą rozpuszczalność w wodzie.

1. obecność dodatków stabilizujących cząsteczki białka, głównie grupy karboksylowe COO^- i aminowe NH₃⁺, gdyż związki te ograniczają niekorzystne działanie H₂O

• Glicerol

• Sacharoza

• Glikol polietylenowy

Zmuszają białko do przyjęcia struktury zwartej, gdyż są bardziej hydrofobowe od wody, stymulują otoczenie białek w komórce.

1. związki redukujące mostki siarczkowe - w centrum aktywnym często występują grupy –SH, aby zapobiec ich utlenianiu i powstawaniu mostków S-S, stosujemy związki zawierające również grupy –SH i to one się utleniają, a nie centrum aktywne

• Glutation

• Merkaptoetanol

• DTT (1,4-ditiotreitol) – redukuje mostki siarczkowe, a sam się utlenia, jest dodawany w nadmiarze do grup –SH występujących w CA

Glicerol i sacharoza:

Stabilizują strukturę przestrzenną białka podczas:

1. Ekstrakcji białek

   1. Symulują otoczenie białek w komórkach, powodują wzrost gęstości, działają jak osmolity → roztwór izotoniczny

   2. Zmuszają białka do zachowania zwartej struktury, ponieważ oddziaływania białko-glicerol są niekorzystne → układ dąży do zmniejszenie powierzchni kontaktu rozpuszczalnik-białko

2. Długotrwałego przechowywania – obniżają temperaturę zamarzania roztworów, zaburzają uporządkowaną strukturę wody → roztwór nie może formować stabilnej struktury kryształów do określonej temperatury poniżej zera

Rozpuszczalność białka zależy od:

• Charakteru białka (hyrofilowy, hydrofobowy)

• Struktury białka(masa, kształt)

• Dostępność łańcuchów bocznych AA hydrofilowych i hydrofobowych

• Od pH (w pH = Pi rozpuszczalność białek jest najmniejsza)

• Siły jonowej (stężenia soli, typu jonów soli w roztworze) – jony dwuwartościowe (Mg²⁺, SO₄^2- ) są relatywnie bardziej wydajne niż jony jednowartościowe)

• Temperatury

• Ilości i rodzaju rozpuszczalnika organicznego

Wstępne podczyszczanie:

1. W przemyśle enzymy oczyszcza się w ograniczonym stopniu, stosuje się preparaty wstępnie podczyszczone. Jest to możliwe dzięki:

• optymalizacji biosyntezy: warunków hodowli i składników pożywki- aby uwarunkować produkcję na konkretne białko enzymatyczne.

• Mutanty otrzymane metodą inżynierii genetycznej także uwarunkowane na produkcję konkretnego białka

1. czasami stosuje się preparaty surowe lub wysuszone- przemysł gorzelniczy, skórzany, tekstylny

2. całe drobnoustroje- wypiek ciasta, sery pleśniowe

3. w przemyśle farmaceutycznym, do celów analitycznych oraz badania jakości stosuje się wysoko oczyszczone preparaty.

Główne oczyszczanie: -frakcjonowanie oparte na podstawie różnic w rozpuszczalności a następnie metodą chromatografii jonowymiennej lub sita molekularnego

• Chromatografia jonowymienna- dość tania

• Chromatografia powinowactwa- oczyszczanie nawet kilka tysięcy razy, ale bardzo duże koszty

• Chromatografia sita molekularnego- preparat rozwodniony, długotrwała ale tania

• Chromatografia hydrofobowa- droga

Najczęściej w technice preparowania enzymu zawartość enzymu nas interesującego w nieoczyszczonym preparacie powinna być wyższa niż 10%.

Rozdzielanie białek na zasadzie różnic w rozpuszczalności

1. Frakcjonowanie solami nieorganicznymi- wysalanie białka

Wysalanie białka- wytrącanie białka z roztworu pod wpływem wysokich stężeń soli obojętnych będących elektrolitami. Polega na zniszczeniu płaszcza wodnego wokół białka.

Na powierzchni białka występują aminokwasy hydrofilowe. Cząsteczki białka otoczone są płaszczem wodnym, cząsteczki wody ustawiają się wokół cząsteczki białka. Gdy białko ma dodatni ładunek, to woda ustawia się ujemną stroną i na odwrót. Sprawia to, że białko jest rozpuszczalne w roztworach wodnych.

Gdy do roztworu dodamy np. siarczan amonu (najczęściej stosowany, ale można użyć także siarczan magnezowy lub sodowy), którego cząsteczki silniej przyciągają wodę niż białko, płaszcze wodne tworzą się wokół jonów (analogicznie jak przy białku, gdy jon ujemny, to miałko dodatnią stroną i na odwrót).

Białko pozbawione otoczki wodnej łączy się z innymi białkami w podobnej sytuacji. Powstają agregaty białek, które wytrącają się z roztworu.

Właściwości tych związków wynikają z tzw. Szeregu Hofmeistera przedstawiającego sole zgodnie z rosnącą zdolnością wysalania białka:

Aniony: SCN^-<CIO₄^-<NO₃^-<Br^-<Cl^-<CH₃COO^-<SO₄^2-<PO₄^3-

Kationy: Ba²⁺<Ca²⁺<Mg²⁺<Li⁺<Cs⁺<Na⁺<K⁺<Rb⁺<NH₄⁺

Słabe elektrolity Mocne elektrolity, całkowicie

zdysocjowane

-Jest to proces odwracalny, po usunięciu soli,

-Przeprowadza się w temp. 2-4 ºC,

-pH zbliżone do pH izoelektrycznego białka,

-tani, łatwy proces

-powoduje minimalne straty enzymu

Białka które są bardziej hydrofilowe ulegają wysoleniu w wyższych stężeniach soli.

Osad z każdego wirowania badany pod kątem obecności oczyszczonego białka.

Wsalanie białka- niskie stężenie tzw. soli obojętnych zwiększa rozpuszczalność wielu białek nierozpuszczalnych w czystej wodzie np. globuliny ekstrahuje się z tkanek roznień. roztworami soli.

1. Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi

Rozpuszczalniki organiczne obniżają stałą dielektryczną, zmniejszają stopień uwodnienia lub jonowy co powoduje wzrost siły przyciągania pomiędzy przeciwnie naładowanymi grupami na powierzchni cząsteczki białka. Najczęściej używane: etanol, aceton. Ze względu na niebezpieczeństwo denaturacji białka metoda ta jest rzadziej stosowana niż wysalanie.

1. Frakcjonowanie rozpuszczalnymi polimerami niejonowymi

Powodują odwodnienie białka poprzez współzawodnictwo z białkiem o cząsteczke wody.

Np. dekstran i glikol polietylenowy w sposób niezupełnie wyjaśniony mogą wypierać białka i inne cząsteczki z roztworu, czyli przyjęcie zwartej struktury. Wielkość i kształt cząsteczek białka decyduje o rozpuszczalności polimeru. Najczęściej 20% glikol polietylenowy

1. Frakcjonowanie przez denaturację termiczną

Wykorzystuje się różnice w temperaturach denaturacji różnych białek, jedne denaturują w temperaturze 40ºC a inne np. w 60ºC.

1. Wytrącanie w punkcie izoelektrycznym

W pH= pkt. Brak ładunków na powierzchni, białka są elektrycznie obojętne , najmniejsze powinowactwo do wody, brak wzajemnego odpychania się cząsteczek białka spadek rozpuszczalności w pH=Pi , białka izostabilne utrzymuja się w roztworze a izolabilne koagulują.

METODY CHROMATOGRAFICZNE

Chromatografia- metoda rozdzielania mieszanin, których składniki ulegają zróżnicowanemu podziałowi pomiędzy dwie fazy: nieruchomą (stacjonarną) i ruchomą.

w wyniku tego procesu poszczególne składniki migrujące przez złoże chromatograficzne z różną prędkością liniową, uzależnioną od ich powinowactwa do fazy stacjonarnej i fazy ruchomej.

złoże chromatograficzne= najczęściej nośnik (porowata nierozpuszczalna stała substancja) + faza stacjonarna

Zachowanie się substancji podczas rozdziału określa współczynnik podziału Kd

Kd= stężenie substancji w fazie A/stężenie substancji fazie B

Faza stacjonarna: ciało stałe (np. adsorbent, jonit), ciecz (np. płyn w porach żelu, płyn wiązany przez celulozę w chromatografii bibułowej)

Faza ruchoma: ciecz lub gaz przepływający przez azę stacjonarną

Chromatografia cieczowa- faza ruchoma ciecz

Chromatografia gazowa- faza ruchoma gaz (wykorzystywana w badaniach analitycznych)

Techniki chromatograficzne (sposoby prowadzenia chromatografii):

-bibułowa (nośnik= bibuła)

-cienkowarstwowa (nośnik= warstwa nośnika (np. celuloza, żel krzemionkowy) w postaci warstwy na płytce szklanej lub plastikowej)

-kolumnowa (nośnik w kolumnie chromatograficznej)

Najczęściej stosowana do oczyszczania enzymów jest cieczowa chromatografia kolumnowa:

-na kolumnę (złoże) nakłada się roztwór białka

-przepłukuje rozpuszczalnikiem aby wymusić ruch fazy wodnej

-białka poruszają się z różną prędkością w zależności od powinowactwa do fazy ruchomej i stacjonarnej

-do różnych probówek zbierane różne frakcje białka.

Metody chromatograficzne (na podstawie sił fizycznych decydujących o rozdziale):

1. Chromatografia sita molekularnego- kształt i wielkość cząsteczek

2. Chromatografia jonowymienna- wypadkowy ładunek cząsteczek

3. Chromatografia hydrofobowa- właściwości hydrofobowe

4. Chromatografia powinowactwa- powinowactwo do ligandu

5. Chromatografia podziałowa- odmienna rozpuszczalność w 2 fazach

Techniki chromatograficzne (ze względu na różnice w ciśnieniach

przepompowywania fazy ruchomej przez fazę stacjonarną):

-LPLC- low pressure liquid chromatography (niskociśnieniowa chromatografia cieczowa), często ruch fazy ruchomej wymuszany tylko grawitacyjnie

-FPLC- Fast protein liquid chromatography (szybka chromatografia cieczowa)

-HPLC- high performance/pressure liquid chromatography (wysokociśnieniowa.wysokosprawnościowa chromatografia cieczowa)

Techniki te różnią się rodzajem złóż i przyłożonym ciśnieniem, zasada rozdziału jest taka sama:

LPLC < 0,5MPa

FPLC 0,5-5 MPa

HPLC 5-35 MPa

HPLC w stosunku do LPLC

-szybsza metoda

-wysoka wydajność

-stosowanie wysokiego ciśnienia konieczność odpowiednich złóż- odpornych na wysokie ciśnienie. Nośnik w kolumnie ze stali nierdzewnej. Wielkość ziaren nośnika 3-10 μm- z tym związana jest wysoka rozdzielczość i ostrość rozdziałów:

• Im mniejsze ziarna nośnika tym większa powierzchnia czynna z którą ma oddziaływać rozdzielane białko, tym większa zdolność rozdzielcza

• Im mniejsza średnica ziaren tym większy opór dla fazy ruchomej, dlatego trzeba użyć wysokiego ciśnienia do jej pompowania.

Należy znać elementy zestawu do chromatografii:

Chromatogram- zapis sygnałów z defektora przedstawia w sposób ciągły zmiany w składzie eluatu w zależności od jego objętości i czasu.

Eluat- faza ruchoma opuszczająca złoże chromatograficzne zawiera sam rozpuszczalnik, bądź rozpuszczalnik wraz z rozdzielanymi białkami.

Chromatografia sita molekularnego:

• Kryterium rozdziału -na podstawie różnic w wielkości i kształcie cząsteczek

• Zasada rozdziału- rozdział mieszanin substancji o różnych masach cząsteczkowych opiera się na różnej szybkości migracji poszczególnych substancji przez złoże ułożone z granulek żelu o porach o określonej wielkości.

- duże cząsteczki (większe od wilkości porów) nie są w stanie wniknąć w granulki żelu ze względu na rozmiar- szybko przechodzą przez wolne przestrzenie między granulkami i mogą szybko wędrować wraz z czołem rozpuszczalnika

-mniejsze cząsteczki przenikają do wnętrza porów- prędkość migracji jest znacznie mniejsza.

Im cząsteczka mniejsza:

- tym głębiej penetruje pory granulek

-tym dłuższa jest droga migracji

-tym wolniej porusza się przez złoże

-tym później pojawia się w eluacie.

Chromatografia sita molekularnego

• filtracja żelowa/ sączenie molekularne/ chromatografia rozdzielcza

• rozdział na podstawie różnic w wielkości i kształcie cząsteczek

Białka ulegają rozdziałowi między 2 fazy płynne:

• faza ruchoma (płyn na zewnątrz ziaren żelu)

• faza stacjonarna (płyn zalegający wewnątrz ziaren żelu)

• fazę ruchomą i stacjonarną stanowi ten sam roztwór.

Upakowane złoże żelu można matematycznie opisać:

V_t = V₀ + V_i + V_p

V_t = objętość całkowita złoża w chromatografii sita molekularnego

V₀ = objętość zerowa – objętość fazy ruchomej (przestrzeni między ziarnami żelu)

V_i = objętość wewnątrz złoża (objętość fazy stacjonarnej – wewnątrz granulek żelu)

V_p = objętość polimeru (żelu, nośnika) – objętość wypełnienia przez substancję żelową

V₀ wyznacza się najczęściej za pomocą barwnika – błękit bromofenolowy

• cząsteczki tego barwnika są na tyle duże, że nie wnikają w pory żelu i wędrują razem z czołem rozpuszczalnika

• wyznacznik objętości wewnątrz żelu – z nim będą wędrować białka niewnikające w pory

V_E – objętość elucyjna (w której pojawia się dane białko)

• dla białek niewnikających w pory żelu V_E = V₀

Współczynnik podziału

• określa zachowanie się danej cząsteczki podczas rozdziału

Żele:

• usieciowane hydrofilowe żele składające się z regularnie porowatych żeli upakowanych w kolumnę

• są one usieciowanymi polimerami, które po uwodnieniu pęcznieją, tworząc żel => po napęcznieniu formuje się ze w kolumnę

3 rodzaje żeli – w chromatografii żelowej tworzą żele, a w innych rodzajach chromatografii wykorzystywane są jako nośniki:

Ad1) Żel dekstranowy – gł. Sephadex

Dekstran

• polisacharyd zbudowany z monomerów glukozy połączonych wiązaniami
  α-1,6-glikozydowymi w prostym łańcuchu,

• rozgałęzienia tworzone przez wiązania α-1,4-glikozydowe lub 1,3-glikozydowe,

Żele dekstranowe:

• zbudowane z łańcuchów dekstranu, połączonych ze sobą mostkami poprzecznymi z epichlorohydryny

• od liczby tych mostków zależy stopień usieciowania żelu (im więcej mostków, tym większy stopień usieciowania, mniejsze pory), a w konsekwencji zdolność rozdzielcza

• nierozpuszczalne w roztworach wodnych

• dość duża odporność chemiczna

• stabilność w pH = 2÷12

• dość szeroka zdolność rozdzielcza białek (szeroki zakres frakcjonowania) – możliwość rozdziału białek o masie od 100 – 600 000 Da

Ad2) Żel agarozowy – gł. Sepharose

Agaroza – jest polimerem zbudowanym z powtarzających się reszt D-galaktozy i
3,6-dehydrogalaktozy, połączonych wiązaniem 1,3 i 1,4-glikozydowym (naturalny polimer, składnik agaru).

Po rozpuszczeniu w wysokich temperaturach w wodzie i ochłodzeniu do niższych temperatur agaroza spontanicznie/ samoistnie ulega usieciowaniu.

Struktura stabilizowana jest wiązaniami wodorowymi.

Żele agarozowe:

• przeznaczone do frakcjonowania białek o dużej masie – od 40 000 kDa – pory dość duże

• sztywne, ale termowrażliwe (>45°C => postać płynna)

• mniejsza zdolność rozdzielcza, mniejsza stabilność chemiczna niż pozostałe rodzaje żelu

• stabilne przy pH = 5÷9

• wielkość porów zależy od stężenia % agarozy

Ad3) Żel poliakryloamidowy - gł. Bio-Gel P

• syntetyczny polimer monomerów akryloamidu i N,N’-metylenobisakrylamidu,

• inicjatorem kopolimeryzacji jest nadsiarczan amonu a katalizatorem Temed (N,N,N,N’-tetrametylo-etylenodiamina).

Za usieciowanie tego żelu odpowiedzialny jest metylenobisakryloamid.

• stopień usieciowania zależy od stężenia akryloamidu i metylenobisakryloamidu oraz od wzajemnych proporcji tych dwóch polimerów (wyższe stężenie, więcej formy metylenobis => wyższy stopień usieciowania, mniejsze pory)

Cechy żeli akryloamidowych:

• bierne chemicznie

• charakteryzują się dość dużą wytrzymałością mechaniczną i termiczną

• regulując stężenia polimerów możemy precyzyjnie regulować wielkość porów

• ALE TOKSYCZNY!!! – akryloamid w formie proszku jest neurotoksyną!

• stabilne przy pH = 1÷10

• oporne na wysokie stężenia związków denaturujących

• nie poddają się działaniu drobnoustrojów

• do rozdziału białek o małej masie do 400 kDa

CHROMATOGRAFIA PODZIAŁOWA W TZW. ODWRÓCONYM UKŁADZIE FAZ

Faza stacjonarna – niepolarna (alkilosilany)

Faza ruchoma – polarna (woda, etanol, acetonitryl i ich mieszaniny)

Złoże chromatograficzne: żel krzemionkowy powleczony silnie hydrofobowymi łańcuchami węglowodorowymi, alkilosilanami)

Najczęściej R to dimetylooktadecylosilan -O-Si-(OCH₃)₂(-O-C₁₈-H₃₇).

Kolumny z takim złożem nazywa się w skrócie ODS.

Łańcuchy węglowodorowe związane na powierzchni krzemionki stanowią rodzaj półpłynnej, silnie hydrofobowej otoczki.

Do celów analitycznych stosowana HPLC (ocena jakości żywności).

Związki bardziej hydrofobowe zatrzymywane są przez fazę stacjonarną, w której lepiej się rozpuszczają niż w fazie ruchomej. Elucję związanych związków hydrofobowych z kolumny przeprowadza się wzbogacając fazę polarną w mniej polarny rozpuszczalnik, np. (wodę w metanol) przez obniżenie pH => wymywanie z kationitu.

Ta zmiana fazy ruchomej na mniej polarną osłabia wiązanie cząsteczek/substancji do złoża i substancja zostaje wymyta.

IMMOBILIZACJA ENZYMÓW LUB KOMÓREK

- zespół metod umożliwiających unieruchomienie enzymów lub całych komórek w wyniku ich związania na powierzchni nośnika (adsorpcja, wiązania kowalencyjne), zamknięcie w porach żelu lub kapsułkach z półprzepuszczalnych błon bądź unieruchomienia w wyniku kowalencyjnego usieciowania.

Największe zastosowanie immobilizowanego enzymu w produkcji przemysłowej dotyczy izomerazy glukozowej.

ZALETY STOSOWANIA IMMOBILIZOWANYCH ENZYMÓW

1. możliwość wielokrotnego użycia enzymu lub użycie go w procesie ciągłym,

2. wzrost stabilności struktury białka enzymatycznego (zazwyczaj, ale nie zawsze) => czasem może to prowadzić do niekorzystnych zmian w strukturze białka => wpływ na aktywność,

=> zazwyczaj wzrasta termo- i pH stabilność, odporność na działanie czynników denaturujących => możliwość zastosowania środowiska organicznego,

1. enzym nie zanieczyszcza środowiska reakcji,

2. ograniczenie inhibicji enzymu zarówno przez substrat, jak i produkt, który jest usuwany w sposób ciągły,

3. unieruchomienie kilku kolejno działających enzymów umożliwia prowadzenie złożonych przemian w jednym reaktorze, co zwiększa wydajność i obniża koszty procesu,

4. obniżenie kosztów katalizy w skali przemysłowej i wzrost wydajności.

UTRUDNIENIA PODCZAS IMMOBILIZACJI ENZYMÓW I PÓŹNIEJ PODCZAS ICH STOSOWANIA

1. wysoki koszt otrzymania czystego preparatu enzymu (przed unieruchomieniem trzeba uzyskać czysty preparat) i później jego unieruchomienia => koszty początkowe procesu immobilizacji,

2. musi się czasem liczyć z tym, że w wyniku immobilizacji, częściowo tracona jest aktywność enzymu (immobilizowane enzymy w porównaniu do swoich natywnych form mogą mieć zmienione optymalne warunki przebiegu reakcji – zmiana optymalnego pH, temperatury, specyficzność substratowa – na ogół, ale nie zawsze, są to zmiany korzystne),

3. możliwość stopniowego zużycia nośnika/matrycy, na której unieruchamiamy enzym:

   • złoże rozdrobnione przez mieszanie,

   • możliwość oblepienia złoża zanieczyszczeniami => ograniczony kontakt z substratem,

   • utrudniony przepływ substratu przez złoże,

   • wylewanie substratu poza złoże.

Podstawowym parametrem technologicznym pozwalającym na ocenę efektywności metody immobilizacji jest STABILNOŚĆ OPERACYJNA ENZYMU – określa czas pracy enzymu, po którym zachodzi utrata ½ aktywności początkowej biokatalizatora.

Wszystkie utrudnienia można wyeliminować – jednak jest to bardzo praco- i czasochłonne.

NOŚNIK STOSOWANY DO UNIERUCHOMIENIA ENZYMÓW – CECHY:

1. nierozpuszczalny w środowisku, w którym prowadzona jest reakcja enzymatyczna (na ogół roztwór wodny),

2. odporność na degradację mechaniczną (ścieranie), chemiczną i mikrobiologiczną,

3. nietoksyczny, bierny chemicznie,

4. duża zdolność wiązania enzymu, która uzależniona jest od:

   • ilości i rodzaju grup funkcyjnych, zdolnych do przyłączania białka i podatności na modyfikacje prowadzące do aktywacji nośnika,

   • porowatości – liczby i powierzchni porów (na tyle duże, aby pomieścić związany substrat)

Wadą organicznych nośników jest ich niższa wytrzymałość mechaniczna w porównaniu z nieorganicznymi i słaba odporność na działanie mikroorganizmów.

Nośniki nieorganiczne są wytrzymalsze, ale mniejsza jest ich pojemność/wydajność wiązania enzymu.

METODY UNIERUCHAMIANIA ENZYMÓW

• FIZYCZNE – polegają na powstaniu między złożem a enzymem słabych oddziaływań międzycząsteczkowych (wodorowe, jonowe, siły Van der Walsa) lub polegają na zamknięciu enzymu w porach żelu lub w kapsułkach z pólprzepuszczalnych błon.

• CHEMICZNE – tworzenie wiązań kowalencyjnych między enzymem a nierozpuszczalną matrycą.

METODY FIZYCZNE

1. ADSORPCJA ENZYMU NA POWIERZCHNI NOŚNIKA

• unieruchomienie enzymu na powierzchni nośnika (porowatego ciała stałego) głównie na drodze słabych oddziaływań fizykochemicznych,

• enzym adsorbuje się głównie na powierzchni wewnętrznej porów,

• ziarna nośnika powinny być małe (5μm – ), aby powierzchnia aktywna wiązania enzymu była dostatecznie duża, jednak nie mogą być zbyt małe, aby nie zwalniać reakcji,

• najprostsza metoda immobilizacji.

1. PUŁAPKOWANIE W PORACH ŻELU – pułapkowanie (inkluzja) enzymu wewnątrz struktury naturalnych lub syntetycznych polimerów

• polega na polimeryzacji żelu (polimeryzacji monomerów i ich usieciowaniu w strukturę żelu) w obecności enzymu i zamknięciu enzymu w porach żelu,

• podczas tworzenia sieci polimerów cząsteczki enzymu zostają zamknięte,

• struktura zamknięta z założenia uniemożliwia wymywanie enzymu, natomiast mniejsze substraty i produkty mogą swobodnie dyfundować na zewnątrz żelu.

ZALETY:

• proces tani,

• niewymagany wysoki stopień oczyszczenia enzymu.

WADY:

• możliwość immobilizacji enzymów katalizujących przemiany substratów niskocząsteczkowych (możliwość dyfundowania do i z struktury żelu) => metoda nieodpowiednia np. do immobilizacji peptydaz (substratem są białka – makrocząsteczki), amylaz (skrobia),

• enzymy hydrolityczne mogą powodować degradację polimerów żelu.

Rozmiary porów żelu zależą od stężenia monomerów akrylamidu i czynnika sieciującego bis-akrylamidu oraz od proporcji akrylamidu do bis-akrylamidu.

Np. pułapkowanie α-amylazy w nośniku poliakrylamidowym.

1. IMMOBILIZACJA Z WYKORZYSTANIEM PÓŁPRZEPUSZCZALNYCH MEMBRAN

1. kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie – zamykanie enzymów we wnętrzu półprzepuszczalnej kapsułki, która imituje naturalne błony biologiczne,

2. enzymatyczne reaktory membranowe – zamykanie enzymów w przestrzeni pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami lub w wężach (np. silikonowych, nylonowych).

W obu przypadkach membrana stanowi przegrodę uniemożliwiającą przenikanie enzymu, ale pozwalającą na przepływ substratów i produktów reakcji enzymatycznej.

Często reakcje enzymatyczne wymusza się przez ciśnieniowy przepływ substratu przez membrany i odbiór produktów po jej przeciwnej stronie.

Membrany powinny być hydrofilowe dla łatwej wymiany substratów i produktów oraz mechanicznie wytrzymałe i dobrze znoszące różnice ciśnień.

Najczęściej nylonowe, silikonowe, liposomowe – polimery tworzone najczęściej podczas polimeryzacji lub polikondensacji monomerów na granicy fazy organicznej i wodnej zawierającej enzym (złożone z chlorku poliwinylu, polipropylenu).

Wielkość kapsułek 10-100 μm

Wielkość porów membran 1-100 nm

KAPSUŁKOWANIE I MIKROKAPSUŁKOWANIE – ETAPY:

• enzym miesza się z hydrofilowym monomerem w wodzie i dodaje się niemieszający się z wodą rozpuszczalnik => powstaje EMULSJA,

• do emulsji dodaje się rozpuszczalnik z hydrofobowym monomerem, miesza się,

• na granicy (w interfazie) fazy organicznej i wodnej te dwa monomery polimeryzują (membrana powstaje na granicy faz) => membrana zamyka się, tworząc kapsułkę,

• zamknięcie enzymu w wodnym roztworze w kapsule.

ZASTOSOWANIE – farmacja, kontrola jakości żywności, metoda wymaga wypełniaczy utrzymujących kształt kapsułki (żelatyny, albuminy).

METODY CHEMICZNE

1. IMMOBILIZACJA PRZEZ TWORZENIE WIĄZAŃ KOWALENCYJNYCH

• najczęściej stosowana w przemyśle spożywczym => najtrwalsze unieruchomienie enzymów,

• wiązanie enzymu z nośnikiem dzięki tworzeniu wiązań kowalencyjnych: peptydowych, estrowych, C-C, N-C, O-C i innych pomiędzy grupami czynnymi nośników a grupami funkcyjnymi enzymów (-NH₂, -COOH, -SH, -OH).

Wiązanie enzymu z nośnikiem może być wynikiem bezpośredniego wiązania (grupy –OH chityny, celulozy, chitozan również –NH₂ wykorzystywane do tworzenia wiązań kowalencyjnych z enzymem) lub poprzez łączenie z nośnikiem najpierw ligandu (grupy funkcyjne, które mogą tworzyć wiązania kowalencyjne z enzymem) i dopiero do ligandu przyłącza się enzym.

Immobilizację tą metodą należy dobrać w taki sposób, aby łączenie enzymu z nośnikiem nie występowało w miejscu aktywnym enzymu.

Dlatego też immobilizację często przeprowadza się w obecności analogów substratów lub inhibitorów – ochrona miejsca aktywnego (grup aktywnych centrum aktywnego) przed wiązaniem z nośnikiem.

NOŚNIKI: karboksymetyloceluloza (CM-celuloza)

szkło porowate

silikażel

LIGANDY: dwufunkcyjne (co najmniej 2 grupy reaktywne – z jednej przyłączają się do nośnika, z drugiej przyłączają enzym) związki, najczęściej aldehyd glutarowy karbodiimid, kwasy dikarboksylowe, bromocyjan, izomocznik, diaminy.

1. UNIERUCHAMIANIE BEZ MAKROSKOPOWEGO NOŚNIKA MECHANICZNEGO

1. sieciowanie przestrzenne związkami wielofunkcyjnymi

2. sieciowanie kryształów i agregatów białek enzymatycznych

Enzym pełni rolę matrycy i biokatalizatora!!!

Ad a) Sieciowanie związkami wielofunkcyjnymi

Polega na łączeniu cząsteczek enzymu za pośrednictwem czynników sieciujących, jakimi są związki wielofunkcyjne, tj. aldehyd glutarowy, diazobenzydyna, diizocjaniany, diimidoetery, diaminy, bromocyjany, izomocznik.

Sieciowanie enzymu przy użyciu aldehydu glutarowego

Czynniki sieciujące oddziałują głównie z grupami aminowymi na powierzchni enzymu.

W tej metodzie cząsteczki substratu mają łatwy dostęp do enzymu.

Proces łatwy, tani, zapewnia dużą stabilność enzymu, jednak podstawową wadą jest niska stabilność mechaniczna – dlatego sieciowanie jest raczej stosowane jako proces wspomagający inne rodzaje immobilizacji – jako pojedyncza metoda stosowana bardzo rzadko.

Np. trypsyna zaadsorbowana na krzemionce, a następnie utrwalona poprzez międzycząsteczkowe usieciowanie przy użyciu aldehydu glutarowego.

KLASYCZNE TYPY REAKTORÓW CHEMICZNYCH

- urządzenia/zbiorniki, w których zachodzi reakcja, wykorzystywane do procesu unieruchamiania.

1. Reaktor zbiornikowy z ciągłym mieszaniem

Do zbiornika wprowadza się nośnik z unieruchomionym enzymem. Następnie wprowadza się substrat, zachodzi reakcja, po czym usuwa się produkty reakcji.

Szybkość reakcji zależy od szybkości mieszania, ale trzeba uważać, bo mieszanie może uszkodzić nośnik.

Tryb pracy:

• okresowy tryb pracy (o trybie pracy zamkniętym) – substrat wprowadza się przed reakcją, produkt usuwa się po zakończeniu reakcji; reakcję prowadzi się do czasu uzyskania satysfakcjonującego poziomu produktu,

• ciągły tryb pracy (o trybie pracy przepływowym) – substraty w sposób ciągły dostarczane do układu, a produkty w sposób ciągły usuwane z układu.

1. Reaktor ze złożem fluidalnym

Substrat przepływa przez złoże z unieruchomionym enzymem w górę reaktora z szybkością dostateczną do powiększenia objętości złoża i fluidyzacji cząsteczek (mieszanina cząsteczek nośnika z enzymem zachowuje się jak ciecz – substrat recyrkuluje z cząsteczkami ciała stałego nośnika i enzymu kilkakrotnie).

1. Reaktor typu kolumny przepływowej z upakowanym złożem

Wyższa sprawność od reaktorów zbiornikowych, najczęściej stosowany.

Substrat przepływa przez upakowane złoże z góry w dół tylko jeden raz – regulując szybkość przepływu substratu przez złoże, regulujemy ilość powstającego produktu.

PRZEMYSŁOWE ZASTOSOWANIE UNIERUCHOMIONYCH ENZYMÓW

Pomimo prób zastosowania unieruchomionych enzymów proteolitycznych i amylolitycznych (wyjątek glukoamylaza) w gałęziach przemysłu spożywczego, nie udało się ich stosować na skalę przemysłową.

GLUKOAMYLAZA – hydroliza wiązań glikozydowych maltodekstryn, skrobi, głównie wiązania β-1,6-glikozydowe (rozgałęzienia skrobi) i α-1,4-glikozydowe.

LIPAZY – hydroliza oleju (produkcja tłuszczów jadalnych), przeprowadzają częściową hydrolizę tłuszczów właściwych.

W przemyśle przetwórczym wykorzystuje się kwasy tłuszczowe (szczególnie krótkołańcuchowe) uwalniane podczas hydrolizy => charakterystyczny smak i zapach.

Mleczarstwo – szybsze dojrzewanie serów

Cukiernictwo – lipolityczne właściwości (poprawa czekolady, cukierki).

TERMOLIZYNA - hydrolza

• termostabilna metaloendoproteina (endoproteinaza) (Zn, Ca) z Bacillus thermoproteolyticus,

• preferuje hydrolizę wiązań peptydowych Aa/Leu, Aa,Phe,

• katalizuje też syntezę wiązań peptydowych na drodze kondensacji hydrolitycznej,

• w większości przypadków reakcje katalizowane przez enzym są ODWRACALNE (synteza wiązań peptydowych)

PEKTYNAZY – hydrolazy

• hydrolizują wiązania glikozydowi w pektynach,

• ułatwiają uwalnianie soków z miazgi, klarowanie soków (usuwanie zmętnień pektynowych),

• pektyny są heteropolisacharydami, składają się głównie z połączonych ze sobą wiązaniami α–1,4– glikozydowymi jednostek kwasu D–galakturonowego, w znacznej części zestryfikowanych gr. metylowymi,

• kwas galakturonowy – powstaje na skutek utleniania α–D–galaktozy, posiada grupę aldehydową przy C1 i karboksylową przy C6.

Diacetyl + NADH + H⁺ ↔ NAD + Acetoina

Diacetyl (produkcja piwa)

• diketon o nazwie systematycznej 2,3-butandion, zapachu maślanym,

• znajduje się w piwie jako produkt uboczny fermentacji przez drożdże, przy odpowiednim stężeniu wykazuje korzystne właściwości – pozwala dłużej odczuwać w ustach smak piwa,

• w stężeniu większym niż 0,2 mg/l nadaje piwu niekorzystny „maślany posmak”,

• powstaje w wyniku przetwarzania cukrów przez drożdże, czasami bakterie w procesie fermentacji,

• w czasie leżakowania piwa te same drożdże redukują diacetyl do obojętnych smakowo produktów (acetoina, butandiol).

Zastosowanie immobilizowanych komórek mikroorganizmów głównie drożdży:

(nauczyć się 4):

• do zwiększenia wydajności fermentacji alkoholowej trudnych do zhydrolizowania substratów np.: immobilizacja Schizosaccharomyces pombe wraz z izomerazą ksylozy, umożliwiło otrzymanie etanolu z ksylozy,

• immobilizowane w żelu alginianowym komórki Kluyveromyces fragilis zastosowano do hydrolizy laktozy w mleku i przygotowania mleka przeznaczonego dla osób nietolerujących cukier mlekowy,

• do biodegradacji cholesterolu w mleku zastosowano komórki Rhodococcus egni,

• immobilizowane komórki Streptococcus albus i olivaceus – w biosyntezie izomerazy glukozowej,

• immobilizowane Erwinia rhapontici lub Protaminobater rubrum zawierający syntezę izomaltulozy, do produkcji izomaltulozy – cukru znajdującego się w miodzie,

• bakterie z rodzaju Acetobacter zaadsorbowane na powierzchni porowatego nośnika, którym najczęściej są wióry bukowe do produkcji kwasu octowego poprzez utlenianie alkoholu etylowego – pierwsza technologia, w której zastosowano biokatalizator unieruchomiony.

Stosowanie całych komórek eliminuje procesy wyodrębniania i oczyszczania enzymów → obniżenie kosztów produkcji.

Stabilność enzymów w komórce jest wyższa niż enzymów wyizolowanych.

PEPTYDAZY (enzymy proteolityczne, proteazy)

• katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach (podstawowe zadanie),

• należą do klasy 3 – hydrolaz,

• niektóre z nich katalizują ponadto hydrolizę wiązań estrowych i amidowych oraz reakcję transpeptydacji i transamidacji,

• w odpowiednich warunkach niektóre peptydazy mogą ponadto syntetyzować wiązanie peptydowe.

W roztworach wodnych stan równowagi tej reakcji przesunięty jest w stronę hydrolizy. Zmniejszając stężenie wody, np. poprzez dodanie rozpuszczalnika organicznego, równowaga zostaje przesunięta w stronę syntezy wiązań peptydowych na drodze kondensacji hydrolitycznej.

W środowisku wodnym mogą zachodzić reakcje resyntezy wiązań, ale muszą być spełnione odpowiednie warunki (pH, stężenie substratu).

Peptydazy – niska specyficzność substratowa, jednakże charakteryzują się wybiórczością w stosunku do położenia rozkładanego wiązania w łańcuchu polipeptydowym oraz swoistością w stosunku do hydrolizy wiązań pomiędzy określonymi aminokwasami.

Klasyfikacja:

Egzopeptydazy - EC 3.4.11-19 (odcinają 1 lub 2 aminokwasy od końca N lub C)

• aminopeptydazy EC 3.4.11:

odcinające pojedyncze aminokwasy od końca aminowego,

• karboksypeptydazy EC 3.4.16-18:

odcinające pojedyncze aa od końca karboksylowego,

• dipeptydazy EC 3.4.14:

hydrolizują wiązania peptydowe w dwupetydach,

• dwupeptydylo-peptydazy lub tripeptydylo-peptydazy

odszczepiają jednostki dwupetydowe lub tripeptydowe od końca N (EC 3.4.14) lub końca C (EC 3.4.15),

• omega peptydazy EC 3.4.19:

odcinające różnie podstawione reszty aminokwasowe.

Endopeptydazy (proteinazy) – EC 3.4.21-24, EC 3.4.99 (hydrolizują wiązania wewnątrz łańcucha polipeptydowego)

Na podstawie budowy centrum, wrażliwości na inhibitory oraz mechanizm katalizy wyróżniono:

• serynowe EC 3.4.21

seryna oraz histydyna w centrum aktywnym, są hamowane przez DFP

• cysteinowe EC 3.4.22

cysteina i histydyna w centrum aktywnym, wrażliwość na czynniki utleniające, hamowane przez PCMB

• aspartylowe EC 3.4.23

dwie reszty asparaginianu w centrum aktywnym, aktywność przy niskim pH 1.5-5

• metaloproteinazy EC 3.4.24

inhibicja przez EDTA

Endopeptydazy o znaczeniu przemysłowym

szeroka specyficzność w stosunku do aminokwasów hydrolizowanego wiązania peptydowego

# specyficzność podobna do pepsyny

x preferencyjna hydroliza:

Aminokwas – wiązanie od grupy karbonylowej (aminokwas dostarczający grupę karbonylową

Aminokwas – Aminokwas wiązanie między dwoma konkretnymi aminokwasami

Egzopeptydazy ważne dla przemysłu spożywczego:

Aminopeptydazy i karboksypeptydazy

• Lactococcus lactis

• Aspergillus sp.

• Rhizopus oryzae

Zastosowanie: usuwanie gorzkiego smaku z hydrolizatów białkowych, także przy produkcji sera.

Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz roślinnych

Papaina, bromelina, ficyna - wewnątrzkomórkowe proteazy cysteinowe, optimum pH 5-7

Preparat enzymatyczny papainy otrzymywany jest na miejscu (w tropikach) ze względu na wysoką niestabilność – ale jego produkcja jest nieskomplikowana, niedroga – później transport do innych krajów).

Suszenie rozpyłowe polega na rozprowadzeniu cieczy w postaci mgiełki drobnych kropli i poddaniu odparowaniu stosując bardzo wysoką temperaturę (200-250°C). Preparaty w postaci stałej są bardziej stabilne niż preparaty ciekłe.

Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz zwierzęcych

Zewnątrzkomórkowe enzymy trawienne:

Otrzymywanie peptydaz z mikroorganizmów

Neutralne proteinazy Bacillus subtilis; proteinazy serynowe, metaloproteinazy.

Podpuszczka – handlowa nazwa zalecana dla preparatów z żołądków przeżuwaczy zawierająca głównie chymozyną i w niewielkim stopniu pepsynę (Międzynarodowa Federacja Mleczarska).

Peptydazy pochodzenia mikrobiologicznego zdolne do koagulacji białek mleka zaleca się nazywać koagulantami białek mleka.

Produkcja hydrolizatów białkowych odbywa się w wyniku enzymatycznej lub kwasowej/zasadowej hydrolizy białek)

Enzymatyczne modyfikacja składu i właściwości białek - hydrolizaty białkowe

Enzymatyczna hydroliza białek nie powoduje rozkładu aminokwasów, jest bardziej specyficzna od hydrolizy kwasowej i alkalicznej białek.

W wyniku częściowej proteolizy

• Zmieniają się reologiczne, fizyczne, chemiczne właściwości białek,

• Powstają charakterystyczne cechy smakowe i zapachowe produktów.

Np. hydrofobowe aa schowane wewnątrz cząsteczki białka zostają odsłonięte, najczęściej powstaje gorzki smak, zwiększa się rozpuszczalność, obniża napięcie powierzchniowe, zwiększa się zdolność do emulgowania tłuszczów (tworzenia emulsji) i tworzenia piany, wzrasta strawność i przyswajalność produktu.

Gdy jednak zbyt długo prowadzi się hydrolizę to właściwości emulgujące i tworzenia piany mogą spadać.

Hydrolizaty białek na skalę przemysłową otrzymuje się z:

• białek mleka (kazeiny, albuminy, białka serwatkowe),

• białek mięsa, soi, glutenu pszenicy, fibrynogenu lub kolagenu.

Hydrolizaty białkowe – zastosowanie

1. Jako koncentraty spożywcze i przyprawowe, np. zupy instant, sosy sojowe, przyprawy do pieczenia mięsa, buliony mięsne w proszku,

2. Dodatki do żywności wytwarzające i stabilizujące pianę, emulgujące tłuszcze, modyfikujące smak, poprawiające teksturę i ułatwiające krojenie, np. do parówek,

3. Do otrzymywania żywności przeznaczenia specjalnego:

• odżywki dla niemowląt,

• preparaty odchudzające,

• odżywki białkowe dla sportowców,

• odżywki o obniżonej alergenności dla dzieci „atopowych” oraz z zaburzeniami wchłaniania i trawienia o podłożu immunologicznym, niealergizującym,

1. Wzbogacanie produktów w białko, np. chleba i żywności specjalnej.

Laktoalbumina zawarta w białku serwatkowym mleka krowy oraz albumina jaja zostały uznane za białka o najwyższej wartości odżywczej przez FAO/WHO (nie tylko zawartość egzogennych aminokwasów, ale i proporcje aminokwasów egzogennych do endogennych) => ale RYZYKO REAKCJI ALERGICZNYCH!!!

Odżywki dla dzieci otrzymuje się z białek serwatkowych, kazeiny, białka soi.

Reakcje alergiczne wywołują sekwencje aminokwasowe występujące w białku nazwane EPITOPAMI, przeciw którym organizm produkuje przeciwciała.

W jednym białku może znaleźć się kilka epitopów. Poprzez hydrolizę wiązań peptydowych zmniejszamy rozmiary peptydów => zmniejsza się liczba cząsteczek zawierających 2 lub więcej epitopów lub bezpośrednio rozbijane są sekwencje aminokwasowe epitopu => obniżenie lub pozbawienie właściwości alergizujących.

Proces plasteinowania, jako przykład polepszania jakości białek

• Enzymatyczna reakcja resyntezy wiązań peptydowych (w konkretnych warunkach),

• Enzymatyczne przeprowadzanie hydrolizatów białkowych w peptydy wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne w 10% TCA o konsystencji żelu nazwanego „plasteiną”.

Proces dwuetapowy:

ETAP 1: polega na częściowej hydrolizie wiązań peptydowych białek przy użyciu proteinaz, takich jak pepsyna, papaina, α-chymotrypsyna.

ETAP 2: otrzymany uprzednio hydrolizat białkowy (mieszanina peptydów), po zatężeniu, poddaje się reakcji plasteinowania katalizowanej przez enzymy, takie same bądź inne niż stosowane w procesie hydrolizy, lecz przy pH innym niż w procesie hydrolizy w wyniku, czego otrzymuje się plasteinę charakteryzującą się, w porównaniu z białkiem wyjściowym, lepszym składem jakościowym oraz obniżoną zawartością substancji antyżywieniowych.

Schemat technologiczny otrzymywania plastein

/

KIERUNKI WYKORZYSTYWANIA REAKCJI PLASTEINOWANIA

1. wbudowywanie aminokwasów egzogennych w białka, np. gluten (białko zapasowe zbóż) w lizynę, zeinę w lizynę, tryptofan,

2. usuwanie niepożądanych aminokwasów w przypadku szczególnych diet, np. w fenyloketonurii konieczne jest wyeliminowanie z produktów fenyloalaniny (do produkcji hydrolizatów wykorzystywane są rybny koncentrat białkowy i białko sojowe),

3. usuwanie gorzkiego smaku hydrolizatów białkowych – usunięcie aminokwasów hydrofobowych lub ich ukrycie wewnątrz długich łańcuchów plastein,

4. usuwanie właściwości alergennych białek – usunięcie części epitopów (z końca N lub C) , rozbicie epitopów lub ich ukrycie wewnątrz łańcuchów plastein => konieczność poznania sekwencji aminokwasowych uczulających.

ZASTOSOWANIE PEPTYDAZ

1. PIEKARNICTWO

• rozluźnienie zbyt mocnego białka glutenowego mąki, co prowadzi do skrócenia czasu wyrabiania ciasta, polepsza jego pulchność i konsystencję (peptydazy grzybowe i bakteryjne),

1. BROWARNICTWO

• podczas przerobu zbożowych surowców niesłodowanych w celu zapewnienia odpowiednich właściwości organoleptycznych (zapachu, pienistości, klarowności) => stabilizacja piwa (szczególne znaczenie przy schładzaniu piwa),

• przy słodowaniu jęczmienia i w początkowej fazie zacierania słodu => odpowiedni stopień rozkładu substancji białkowych,

1. PRZEMYSŁ MIĘSNY

• przyspieszenie procesu dojrzewania mięsa, głównie wołowego, poprzez częściowy rozkład ... białka włókna mięśniowego uzyskuje się poprawę konsystencji (delikatność, kruchość), poprawę wartości odżywczej i cech organoleptycznych => 2-3 x skrócony czas dojrzewania => zwiększona strawność,

• oddzielenie resztek mięsa od kości – zwiększenie odzysku białka,

• zmiękczanie, odwłasianie skór,

• zwiększenie wydajności ekstrakcji tłuszczu,

1. PRZEMYSŁ RYBNY

• dojrzewanie solonych, marynowanych śledzi (pleśnie Aspergillus),

1. MLECZARSTWO

• koagulacja białek mleka w produkcji sera,

• produkcja hydrolizatów kazeiny,

• produkcja mleka sojowego, mleka w proszku,

• w procesie dojrzewania sera – proces złożony, proteoliza niezbędna do uzyskania prawidłowej struktury, głębokiego smaku, dostarczenia aminokwasów niezbędnych do wytworzenia charakterystycznego smaku i zapachu.

Koagulanty wykorzystywane w produkcji i dojrzewaniu serów stosowane są szeroko ze względu na niespecyficzność substratową tych preparatów.

W przypadku podpuszczki niespecyficzna proteoliza nie rozluźnia skrzepu i nie powoduje przechodzenia produktów degradacji kazeiny do serwatki.

Natomiast inne koagulanty białek mleka (trypsyna, chymotrypsyna, papaina) oraz bakteryjne proteinazy hydrolizują niespecyficznie białka mleka – w długim czasie prowadzi to do rozluźnienia skrzepu, strat tłuszczu, strat niskocząsteczkowych związków.

PREPARATY PODPUSZCZKOZASTĘPCZE – cechy:

• duża aktywność ścinająca białka mleka (koagulacja)

• niska niespecyficzna aktywność proteolityczna

Jedynym producentem enzymatycznych preparatów amylolitycznych, pektynolitycznych i proteolitycznych w Polsce są Zakłady Przemysłu Ococowo-Warzywnego PEKTOWIN w Jaśle.

WD-9 29.04.2009

Reakcje katalizowane przez transglutaminazę- sieciowanie łańcuchów polipeptydowych.

Transglutaminaza

-występuje w krwi ssaków, uczestniczy w wytwarzaniu skrzepów

-produkowana także przez drobnoustroje

-jako acylotransferaza, katalizuje reakcje łączenia reszty acylowej glutaminy wbudowywanej w białko lub w peptyd z pierwszorzędową grupą aminową aminokwasu wolnego lub wbudowanego w białko lub peptyd (lizyna).

O O

|| ||

białko₁-(CH₂)₂-C-NH₂ + H₂N-(CH₂)₄-białko₂ białko₁-(CH₂)₂-C-N-(CH₂)₄-białko₂ + NH₃

|

H

O O

|| ||

białko-(CH₂)₂-C-NH₂ + H₂NR białko-(CH₂)₂-C-N-R + NH₃

wolny |

aminokwas H

Wiązanie izopeptydowe- powstaje pomiędzy grupami nie leżącymi w pozycji α- może:

• łączyć dwa białka,

• łączyć (sieciować) jedno białko,

• może także wiązać aminokwas- lizynę.

Reakcja ma zastosowanie w:

-wzbogaceniu diet w lizynę

-wspomaganiu żelowania białek w farszach węd linowych i galaretkach rybnych, do wiązania kawałków mięsa i ryby

-produkcja zamienników tłuszczu

-pozwala łączyć odpadowe surowce białkowe

Jedynym producentem enzymatycznych preparatów amylolitycznych, pektynolitycznych i proteolitycznych w Polsce są Zakłady Przemysłu Ococowo-Warzywnego PEKTOWIN w Jaśle.

1. PROTEOPOL BP-S jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu bakterii Bacillus subtilis. Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie zbliżonym do obojętnego.

ZASTOSOWANIE

• Produkcja pieczywa cukierniczego - częściowa biodegradacja glutenu mąki przy wyrobie kruchych ciast cukierniczych (krakersy, wafle). Preparat umożliwia otrzymanie jednorodnej, kruchej, lekko łamliwej konsystencji wypieku.

• Produkcja piwa - uzupełnienie enzymów proteolitycznych słodu lub ich częściowe zastąpienie przy przerobie zbożowych surowców niesłodowanych.

DOZOWANIE

• W procesie produkcji krakersów, herbatników i wafli preparat dodaje się w fazie zarobu ciasta. Zaleca się dawkę 0,4 - 0,6 kg PROTEOPOLU BP-S-100 na tonę gotowego wyrobu. Maksymalna dopuszczalna dawka - 2,0 kg.

• Przy produkcji piwa preparat stosowany jest w procesie przygotowania brzeczki. Maksymalna dawka PROTEOPOLU BP-S-100 wynosi 0,1% w stosunku do surowca niesłodowanego.

1. PROTEOPOL BP-T jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu bakterii Bacillus subtilis.
   Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie zbliżonym do obojętnego.

ZASTOSOWANIE

• Przemysł skórzany - depilacja i uszlachetnianie skór świńskich.

• Przemysł fotochemiczny - rozkład żelatyny w procesach odzyskiwania srebra z odpadów materiałów fotograficznych.

1. PROTEOPOL FP-T jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu Aspergillus niger. 
   Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie kwaśnym. Preparat zawiera enzymy towarzyszące działające na substancje organiczne. 

ZASTOSOWANIE

• Preparat stosowany jest głównie w przemyśle futrzarskim w technologii wytrawiania skór.

• Poprawa jakości skóry poprzez zwiększenie jej pulchności i ciągliwości. Skrócenie czasu trwania procesu.

AMYLAZY

-rodzina enzymów hydrolizująca wiązania glikozydowe skrobi

-używanie do hydrolizy nierozpuszczalnej w zimnej wodzie skrobi na rozpuszczalne dekstryny i cukry prostsze.

Skrobia- roślinna substancja zapasowa zbudowana z :

-amylozy- nierozgałęziony polimer reszt α-D-glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi

-amylopektyny- rozgałęziony polimer reszt α-D-glukozy, w którym większość reszt glukozy połączona jest wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, ale co 25-30 reszt występują wiązania α-1,6-glikozydowe, tworząc punkt rozgałęzień.

Mechanizm działania poszczególnych amylaz na fragment cząsteczki skrobi.

Do grupy amylaz należą:

-α-amylaza

-β-amylaza

-glukoamylaza

-pullulanaza

-izoamylaza

-α-D-glukozydaza

-transferaza glukozowa cyklodekstryn

α-amylaza, β-amylaza, glukoamylaza wraz z pullulanazą i izoamylazą mają największe znaczenie przemysłowe.

Enzymatyczna hydroliza skrobi- etapy

• Przygotowanie skrobi natywnej do hydrolizy poprzez kleikowanie (105°C, 5 min)

Kleikowanie- przygotowanie natywnej, nierozpuszczalnej skrobi do hydrolizy enzymatycznej, najczęściej w skutek ogrzewania. Skrobia pęcznieje, wchłania wodę, traci strukturę ziarnistą- tworzy się lepki roztwór koloidalny.

• Etapy produkcji hydrolizatów skrobiowch:

1. Faza dekstrynowania, upłynniania- ma miejsce degradacja skrobi do krótszych łańcuchów- prowadząc do powstania wysoko- (10-13 reszt glukozy) i nisko- (6-7 reszt glukozy) cząsteczkowych dekstryn. Następuje szybki spadek lepkości roztworu. Najwydajniej zachodzi w temperaturze 60-70°C lub wyższej, jeśli pozwala na to termo stabilność enzymów.

2. Faza scukrzania- dekstryny rozkładane do cukrów prostych: maltoza, maltotrioza, glukoza. Optymalna temperatura tego procesu to 45-50°C.

Z technologicznego punktu widzenia rozróżniamy

1. amylazy upłynniające- α-amylazy, izoamylazy, pullulanazy (głównie termo stabilna α-amylaza z Bacillus licheniformis oraz Bacillus amyloliquefaciens- które mogą przeprowadzać reakcję w temperaturze 90-100°C.

2. amylazy scukrzające- niektóre α-amylazy, β-amylazy, glukoamylazy (głównie glukoamylaza i α-amylazy grzybowe)

Klasyfikacja hydrolizatów skrobiowych

Enzymatyczne hydrolizaty skrobiowe (produkty enzymatycznego rozkładu skrobi) o różnym stopniu depolaryzacji skrobi.

Najczęściej stosowany miernik przeprowadzanej hydrolizy jest równoważnik glukozowy DE.

Równoważnik glukozowy DE (dextrose equivalent)- określa procentową zawartość cukrów redukujących, wyrażonych jako glukoza, w przeliczeniu na suchą masę hydrolizatu.

Schemat działania α-amylaz na cząsteczkę skrobi

skrobia dekstryny, oligosacharydy, maltoza, glukoza

α-amylaza

-endoamylaza, enzym upłynniający skrobię

-enzym rozkładający w sposób przypadkowy wiązania α-1,4-glikozydowe wewnątrz cząsteczki skrobi (omija wiązania α-1,6-glikozydowe)

-produktami długotrwałej hydrolizy skrobi mogą być w zależności od pochodzenia enzymu: maltotrioza, maltoza, glukoza oraz tzw. dekstryna graniczna składająca się z kilku reszt glukozy

-procesowi hydrolizy towarzyszy bardzo powolny wzrost redukcyjności roztworu, ponieważ spada lepkość roztworu bo powstaje początkowo wysokocząsteczkowe dekstryny następnie niskocząsteczkowe dekstryny i w końcu cukry proste.

Źródła α-amylaz

Słód jęczmienny

-głównie dla przemysłu piwowarskiego

Zawartość amylaz w suchych i kiełkujących ziarnach jęczmienia

α-amylazy pochodzenia mikrobiologicznego

Bakterie: Bacillus Licheniformis, Bacillus amyloliquefeciens, Bacillus subtilis

Grzyby strzępkowe: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger

Właściwości wybranych α-amylaz

- α-amylaza głównie wykorzystywana do upłynniania skrobi, powoduje bardzo szybkie upłynnianie skrobi, ale też bardzo powolne scukrzanie, gdyż wykazuje niskie powinowactwo do kilku cukrów

-Niska termo stabilność grzybowych α-amylaz wykorzystywana jest w piekarnictwie.

-α-amylazy bakteryjne charakteryzują się wyższym optimum pH i temperatury oraz wyższą termo stabilnością w porównaniu z grzybowymi słodowymi.

-Do przemysłowego upłynniania skrobi stosuje się termo stabilną α-amylazę Bacillus licheniformis oraz Bacillus amyloliquafaciens (może przeprowadzać reakcję w temperaturze 90-105°C. Maksymalne DE 30, średnio 8-12).

Produkty hydrolizy skrobi- zależne od pochodzenia enzymu i parametrów hydrolizy

skrobia dekstryna graniczna i maltoza

β-amylaza

-egozamylaza, amylaza scukrzająca

-rozkłada co drugie wiązanie α-1,4-glikozydowe od końca nieredukującego łańcucha skrobiowego, odrywając jednostki β-maltozy

-produktami są: wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna i β-maltoza

-nie jest w stanie ominąć wiązań α-1,6-glikozydowych jak α-amylaza

-w wyniku hydrolizy skrobi β-amylazy następuje przyrost redukcyjności roztworu- bo powstaje maltoza- cukier redukujący, nie towarzyszy temu spadek lepkości roztworu.

Źródła β-amylaz

Głównym źródłem tego enzymu są dojrzałe lub kiełkujące ziarna jęczmienia, przenicy, soji. Znane są jednak także bakteryjne źródła β-amylazy.

Właściwości wybranych β-amylaz

β-amylaza z bulw bataty, topinamburu aktywna w 60-80°C, stąd bulwy niektórych gatunków tej rośliny po ugotowaniu mają słodki smak.

Schemat działania glukoamylaz na cząsteczkę skrobi

skrobiadekstryna i glukoza

glukoamylaza

-egzoamylaza, główny enzym scukrzający w przetwórstwie

-hydrolizuje wiązania α-1,4-glikozydowe od końca nieredukującego łańcucha skrobi, odszczepiając cząsteczki β-glukozy

-może też hydrolizować wiązania α-1,6-glikozydowe ale z 20-30 x mniejszą wydajnością

-powoduje bardzo powolny spadek lepkości roztworu, szybki przyrost redukcyjności

Źródła glukoamylaz

Glukoamylaza występuje w słodzie, ale w małych ilościach, dla celów przemysłowych źródłem są grzyby niższe głównie z rodzaju Aspergillus, Rhizopus, Endomyces, Endomycopsis

Glukoamylaza charakteryzuje się dużą odpornością na zmiany pH (stabilność w zakresie 1,8-8,8 dla enzymów z Aspergillus Niger oraz 1,8-10,5 z Aspergillus awamori)

Pullulanoza i izoamylaza

-są to endoamylazy

-enzymy znoszące rozgałęzienia, gdyż hydrolizują one wiązania α-1,6-glikozydowe

-pullulanaza działa na oligosacharydy zawierające jedynie dwie jednostki glukozy z każdej strony wiązania α-1,6-glikozydowego

-izoamylaza wymaga obecności co najmniej trzech jednostek glukozy z każdej strony wiązania α-1,6-glikozydowego do swego działania

-izoamylazę otrzymuje się z bakterii Cytophaga, Bacillus, Escherichia i drożdży Lipomyces

-Pullulanazę otrzymuje się z bakterii Klebsiella, Escherichia, Bacillus, Streptococus. Chociaż enzym ten zidentyfikowano w takich roślinach jak: bawełna, ryż i szpinak to jednak w celach przemysłowych izoluje się go głównie ze szczepów bakterii.

Gorzelnictwo i browarnictwo

-w browarach w procesie zacierania słodu (hydrolizy brzeczki piwnej), czyli przygotowania go do fermentacji przez drożdże upłynnianie i scukrzanie skrobi, zwiększa zawartość cukrów fermentowanych przez drożdże produkcja piwa

-w gorzelnictwie do upłynniania skrobi przy produkcji spirytusu z surowców niesłodowych, ale zawierających duże ilości skrobi: kukurydza, pszenica, ziemniaki, maniok

-do klarowania piwa-rozpad skrobi ułatwia klarowanie