ANTYGENY ZGODNOŚCI

ANTYGENY ZGODNOŚCI

TKANKOWEJ

TKANKOWEJ

mgr Aleksandra Żurek

Wprowadzenie

Wprowadzenie

Antygeny zgodności tkankowej-

glikoproteiny

powierzchniowe obecne w błonach komórkowych,

występują u kręgowców, są odpowiedzialne za

odrzucanie przeszczepów allogenicznych.

•MHC

–

M

ajor

H

istocompatibility

C

omplex – zespół

genów kodujących antygeny zgodności tkankowej,

położonych u człowieka na chromosomie 6.

•HLA – H

uman

L

eukocyte

A

ntigens – antygeny

zgodności tkankowej występujące u człowieka. Długość

przeżycia

przeszczepów

narządowych

jest

uwarunkowana stopniem zgodności HLA między dawcą

a biorcą przeszczepu (antygeny transplantacyjne).

Klasy MHC

Klasy MHC

 MHC klasy pierwszej:

• występują na powierzchni wszystkich komórek

jądrzastych (nieliczne na erytrocytach)

• są kodowane przez polimorficzne geny okupujące

trzy loci:

- HLA-A
- HLA-B
- HLA-C

• w obrebie każdego locus opisano od kilkunastu

do kilkudziesięciu swoistości antygenowych

• u człowieka ze względu na diploidalny komplet

chromosomów i dziedziczenie MHC jako cechy

kodominującej zwykle wykrywa się po dwa

antygeny z każdego locus

 MHC klasy drugiej:

• Wystepują na powierzchni limfocytów B, makrofagów,

komórek dendrytycznych i nabłonkowych grasicy

• Są kodowane w regionie D, który składa się z kilkunastu

blisko położonych loci, zgrupowanych w subregiony:

- HLA-DP
- HLA-DQ
- HLA-DR

• Wykryto kilkaset swoistości antygenowych kodowanych

przez te geny

 MHC klasy trzeciej:

• Składowe dopełniacza:

- C4
- C2
- B

• Występują w plazmie krwi i odgrywają niewielką rolę w

odrzucaniu przeszczepów

MHC klasy I

– wszystkie

komórki jądrzaste. Łańcuch
ciężki (1, 2, 3) 45kDa,

lekki (2 mikroglobulina)

12kDa. Prezentacja
antygenów (8-10 aa)
patogenów
wewnątrzkomórkowych.

MHC klasy II

– limfocyty B,

makrofagi, komórki
dendrytyczne, komórki
nabłonka grasicy . Łańcuchy
33kDa i  (29 kDa).

Prezentacja antygenów (do 20
aa) patogenów
zewnątrzkomórkowych.

MHC III

– składniki

dopełniacza C4, C2, B,
przetwarzanie antygenu

MHC klasy I

prezentują antygeny

lmfocytom Tc, doprowadzając tym
samym do lizy komórki zainfekowanej
np.

wirusami

lub

bakteriami

wewnątrzkomórkowymi

(Listeria

monocytogenes,

Mycobacterium

tuberculosis)

MHC klasy II

prezentują antygen

limfocytom Th, doprowadzając do
aktywacji układu immunologicznego
poprzez

wpływ

na

odpowiedz

humoralną (Th2 - IL-4, IL-5 IL-6) jak i
komórkową (Th1 – IL-2, IFN-, TNF-

TNF-)

Budowa MHC klasy I i

Budowa MHC klasy I i

II

II

Domeny zmienne, tworzą
rowek kotwiczący dany
rodzaj antygenu i
prezentujący go limfocytom
T

Funkcje MHC

Funkcje MHC

• Główna funkcja MHC to wiązanie i

prezentacja antygenu limfocytom T

!!! Heterozygoty wykazują lepszą możliwość

prezentacji większej ilości antygenów, a

polimorfizm

MHC

zwiększa

przeżycie

niektórych osobników w populacji podczas

epidemii śmiertelnych chorób !!!

Różnorodność cząsteczek MHC jest wynikiem

przystosowania się układu immunologicznego do

walki z mikroorganizmami

Metody identyfikacji

Metody identyfikacji

HLA

HLA

• Typowanie serologiczne oparte na przeciwciałach anty-

HLA, najczęściej monoklonalnych (np. test Terasaki)

• Typowanie genetyczne okreslające polimorfizm na

poziomie DNA

• Analiza fragmentów restrykcyjnych produktu PCR

(PCR-RFLP) i porównanie z okreslonymi wzorcami

Typowanie HLA jest istotne w:

-transplantologii

-diagnostyce chorób powiązanych z HLA (np. korelacja między
ekspresją HLA-B27 a zesztywniającym zapaleniem kręgosłupa)

-ustalaniu ojcowstwa

-medycynie sądowej

Typowanie HLA jest istotne w:

-transplantologii

-diagnostyce chorób powiązanych z HLA (np. korelacja między
ekspresją HLA-B27 a zesztywniającym zapaleniem kręgosłupa)

-ustalaniu ojcowstwa

-medycynie sądowej

Test mikrolimfocytotoksyczny wg.

Test mikrolimfocytotoksyczny wg.

Terasaki (wykrywanie HLA kl. I)

Terasaki (wykrywanie HLA kl. I)

Wykonanie – izolacja limfocytów:

1.

Odwłóknioną przez wytrząsanie z perełkami szkalnymi krew

rozcieńczono PBS w stosunku 1:1

2.

Otrzymaną zawiesinę nawarstwiono na Lymphoprep w proporcji

2:1 (np. 6ml krwi i 3ml Lymphoprepu) i wirowano przez 15 min

(400xg)

3.

Zebrano limfocyty z interfazy (pierścień znajdujący się między

Lymphoprepem a osoczem) i płukano je 2-3x PBSem oraz

rozcieńczono PBS do gęstości 2x10

6

kom/ml

4.

Limfocyty kontrolne, przechowywane w ciekłym azocie

odmrożono przez zanurzenie ampułki w wodzie o temp. 37°C,

następnie płukano PBS i przygotowano zawiesinę o gęstości 2x10

6

kom/ml

Wykonanie – test Terasaki:

1.72-dołkowe płytki Terasaki na których przeprowadza się test należy

odpowiednio oznakować i wszystkie zagłębienia wypełnić do 2/3 objętości olejem

parafinowym

(uwaga! na dnie zagłębień nie może być pęcherzyków powietrza)

2.Do każdego zagłębienia, pod parafinę, wkrapla się przy pomocy mikrostrzykawki

Hamiltona o pojemności 50 µl po 1 µl surowicy wzorcowej anty-HLA

(uwaga! Przy

każdej zmianie surowicy styrzykawkę trzeba dokładnie przepłukać w PBS (10x),

aby uniknąć przeniesienia surowicy z jednego dołka do drugiego)

3.Zagłębienie oznaczone

1A

przeznaczone jest na kontrolę żywotności limfocytów,

więc zamiast surowicy wzorcowej dodajemy tu

1 µl PBS

(kontrola negatywna)

natomiast do dołka

1B

dodajemy

wzorcowe limfocyty i wybraną wzorcową

surowicę

(kontrola pozytywna)

4.Do wszystkich dołków

(z wyjątkiem 1B)

dodajemy po 1 µl zawiesiny badanych

limfocytów o gęstości 2x10

3

kom/1 µl PBS

5.Płytki inkubujemy z wytrząsaniem przez

30 min

w 200-24°C

6.Następnie do każdego dołka dodajemy po 5 µl króliczego dopełniacza i

inkubujemy próbki z wytrząsaniem przez

60 min

w 200-24°C

7.Po inkubacji do każdego dołka dodajemy po 5 µl 5% roztworu eozyny żółtawej, a

po

3 min

po 5 µl 38% roztw. formaldehydu

Dopełniacz łączy się z komórkami opłaszczonymi przeciwciałami i powoduje ich
lizę. W dołkach, w których limfocyty uległy zniszczeniu zaszła reakcja pomiędzy
antygenem HLA a skierowanym przeciw niemu przeciwciałem- wynik dodatni.

Dopełniacz łączy się z komórkami opłaszczonymi przeciwciałami i powoduje ich
lizę. W dołkach, w których limfocyty uległy zniszczeniu zaszła reakcja pomiędzy
antygenem HLA a skierowanym przeciw niemu przeciwciałem- wynik dodatni.