Hormony –metody oznaczania

Hormony –metody oznaczania

w próbce moczu

w próbce moczu

Iga Hołyńska-Iwan

Iga Hołyńska-Iwan

Magdalena Lampka

Magdalena Lampka

Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii

Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii

Klinicznej

Klinicznej

Pomiar wydalania hormonów w moczu:

Pomiar wydalania hormonów w moczu:



hCG – gonadotropina kosmówkowa

hCG – gonadotropina kosmówkowa



LH, FSH

LH, FSH



testosteron

testosteron



kortyzol

kortyzol



17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy

17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy



adrenalina, noradrenalina

adrenalina, noradrenalina



dopamina

dopamina

Pomiar wydalania hormonów w

Pomiar wydalania hormonów w

dobowej zbiórce moczu:

dobowej zbiórce moczu:



LH, FSH

LH, FSH



kortyzol

kortyzol



17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy

17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy



17-KS – 17-ketosteroidy

17-KS – 17-ketosteroidy



VMA – kwas wanilinomigdałowy

VMA – kwas wanilinomigdałowy



metanefryny

metanefryny



adrenalina, noradrenalina

adrenalina, noradrenalina



dopamina

dopamina

17-KS – 17-ketosteroidy

17-KS – 17-ketosteroidy



Związki sterydowe, które przy atomie węgla w

Związki sterydowe, które przy atomie węgla w

pozycji 17 mają grupę ketonową (C=O)

pozycji 17 mają grupę ketonową (C=O)



Obejmują androgeny i ich metabolity:

Obejmują androgeny i ich metabolity:



dehydroepiandrosteron,

dehydroepiandrosteron,



androsteron

androsteron



11-ketoandrosteron

11-ketoandrosteron



11-

11-

β

β

-hydroksyandrosteron

-hydroksyandrosteron



etiocholanolon

etiocholanolon



11-ketoetchocholanoloa

11-ketoetchocholanoloa



11-

11-

β

β

-hydroksyetiocholanolon

-hydroksyetiocholanolon

17-KS – 17-ketosteroidy c.d.

17-KS – 17-ketosteroidy c.d.



17-KS wydalane są z moczem głównie w formie

17-KS wydalane są z moczem głównie w formie

glikozydów kwasu glukuronowego i siarkowego.

glikozydów kwasu glukuronowego i siarkowego.



U mężczyzn około 66% całkowitej ilości pochodzi

U mężczyzn około 66% całkowitej ilości pochodzi

z nadnerczy, a ok. 33% z jąder.

z nadnerczy, a ok. 33% z jąder.



U kobiet śladowe ilości pochodzą z jajników.

U kobiet śladowe ilości pochodzą z jajników.



Na podstawie wydalania 17-KS nie można oceniać

Na podstawie wydalania 17-KS nie można oceniać

wydalania testosteronu, który jest najsilniejszym

wydalania testosteronu, który jest najsilniejszym

androgenem.

androgenem.



Podczas ciąży oraz pod wpływem ACTH wzrasta

Podczas ciąży oraz pod wpływem ACTH wzrasta

wydalania 17-KS

wydalania 17-KS

17-KS – 17-ketosteroidy – metody

17-KS – 17-ketosteroidy – metody

oznaczania

oznaczania



Izolowane z moczu przy użyciu kolumn

Izolowane z moczu przy użyciu kolumn

chromatograficznych.

chromatograficznych.



Po hydrolizie połączeń z kwasami glukuronowym

Po hydrolizie połączeń z kwasami glukuronowym

i siarkowym następuje reakcja barwna

i siarkowym następuje reakcja barwna

z m-dinitrobenzenem (reakcja Zimmermanna).

z m-dinitrobenzenem (reakcja Zimmermanna).



Powstały związek może być oznaczany przy

Powstały związek może być oznaczany przy

użyciu spektrofotometru przy długości fali 520nm.

użyciu spektrofotometru przy długości fali 520nm.

Etapy reakcji:

Etapy reakcji:

1.

1.

Hydroliza połączeń 17-KS z kwasem glukuronowym

Hydroliza połączeń 17-KS z kwasem glukuronowym

i siarkowym pod wpływem HCl i ogrzewania próby

i siarkowym pod wpływem HCl i ogrzewania próby

w temperaturze wrzenia.

w temperaturze wrzenia.

2.

2.

Adsorpcja 17-KS na kolumnie chromatograficznej.

Adsorpcja 17-KS na kolumnie chromatograficznej.

3.

3.

Elucja 17-KS z kolumny przy użyciu metanolu.

Elucja 17-KS z kolumny przy użyciu metanolu.

4.

4.

Reakcja barwna z m-dinitrobenzenem.

Reakcja barwna z m-dinitrobenzenem.

5.

5.

Ekstrakcja barwnego produktu przy użyciu eteru.

Ekstrakcja barwnego produktu przy użyciu eteru.

6.

6.

Pomiar spektrofotometryczny intensywności

Pomiar spektrofotometryczny intensywności

zabarwienia przy

zabarwienia przy

λ

λ

= 520 nm, natężenie jest

= 520 nm, natężenie jest

proporcjonalne do stężenia 17-KS.

proporcjonalne do stężenia 17-KS.

17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy

17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy



Związki sterydowe, które przy atomie węgla w

Związki sterydowe, które przy atomie węgla w

pozycji 17 mają grupę hydroksylową (-OH)

pozycji 17 mają grupę hydroksylową (-OH)



Obejmują glikokortykosteroidy i ich metabolity:

Obejmują glikokortykosteroidy i ich metabolity:



kortyzol

kortyzol



kortyzon

kortyzon



11-dezoksykortyzol

11-dezoksykortyzol



zredukowane pochodne kortyzolu i kortyzonu

zredukowane pochodne kortyzolu i kortyzonu

(tetrahydroksykortyzole, tetrahydroksykortyzony)

(tetrahydroksykortyzole, tetrahydroksykortyzony)



Wydalane z moczem w formie glikozydów kwasu

Wydalane z moczem w formie glikozydów kwasu

glukuronowego i siarkowego.

glukuronowego i siarkowego.



Pod wpływem ACTH wzrasta wydalanie 17-OHKS.

Pod wpływem ACTH wzrasta wydalanie 17-OHKS.



Zmienione może być w przebiegu niewydolności

Zmienione może być w przebiegu niewydolności

nerek

nerek

i w otyłości.

i w otyłości.

17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy

17-OHKS – 17-hydroksyketosteroidy

– metody oznaczania

– metody oznaczania



Metoda Portera-Silberta – wykorzystuje reakcje

Metoda Portera-Silberta – wykorzystuje reakcje

barwną grupy dihydroksyacetonu z

barwną grupy dihydroksyacetonu z

fenylohydrazyną i kwasem siarkowym.

fenylohydrazyną i kwasem siarkowym.



Metoda chromatograficzna z wykorzystaniem

Metoda chromatograficzna z wykorzystaniem

reakcji Zimmermanna

reakcji Zimmermanna

1. Po redukcji obecnych w moczu 17-KS do alkoholi

1. Po redukcji obecnych w moczu 17-KS do alkoholi

za pomocą NaBH

za pomocą NaBH

4

4

, która zachodzi w środowisku

, która zachodzi w środowisku

zasadowym, przeprowadza się

zasadowym, przeprowadza się

utlenianie 17-OHKS

utlenianie 17-OHKS

do 17-KS

do 17-KS

, za pomocą NaIO

, za pomocą NaIO

4

4

.

.

2. Tak uzyskane 17-KS izolowane są z moczu przy

2. Tak uzyskane 17-KS izolowane są z moczu przy

użyciu kolumn chromatograficznych i oznaczane

użyciu kolumn chromatograficznych i oznaczane

w reakcji z m-dinitrobenzenem.

w reakcji z m-dinitrobenzenem.

Metabolizm amin katecholowych

Metabolizm amin katecholowych

Metanefryny

Metanefryny



Metabolity amin katecholowych

Metabolity amin katecholowych

metanefryna – adrenaliny

metanefryna – adrenaliny

normetanefryna - noradrenaliny

normetanefryna - noradrenaliny



Stanowią około 10% metabolitów amin

Stanowią około 10% metabolitów amin

katecholowych wydalanych z moczem

katecholowych wydalanych z moczem



Wystepują z postaci glikozydów kwasu

Wystepują z postaci glikozydów kwasu

glukuronowego

glukuronowego

i siarkowego.

i siarkowego.



Zwiększone wydalanie metanefryn z moczem

Zwiększone wydalanie metanefryn z moczem

w przebiegu guza chromochłonnego nadnerczy

w przebiegu guza chromochłonnego nadnerczy

(pheochromocytoma)

(pheochromocytoma)

Metanefryny - oznaczanie

Metanefryny - oznaczanie



Analiza metanefryn poprzedzona jest kwaśną

Analiza metanefryn poprzedzona jest kwaśną

hydrolizą, która prowadzi do rozerwania połączeń z

hydrolizą, która prowadzi do rozerwania połączeń z

kwasami glukuronowym i siarkowym.

kwasami glukuronowym i siarkowym.



Następnie zachodzi adsorpcja na kolumnie

Następnie zachodzi adsorpcja na kolumnie

chromatograficznej.

chromatograficznej.



Po zastosowaniu wodorotlenku amonowego

Po zastosowaniu wodorotlenku amonowego

następuje wymywanie z kolumny i po utlenieniu do

następuje wymywanie z kolumny i po utlenieniu do

waniliny oznaczenie spektrofotometryczne, przy

waniliny oznaczenie spektrofotometryczne, przy

λ

λ

=

=

360 lub 380 nm.

360 lub 380 nm.

VMA – kwas wanilinomigdałowy

VMA – kwas wanilinomigdałowy



Główny produkt metabolizmu amin katecholowych.

Główny produkt metabolizmu amin katecholowych.



Stanowi 75% metabolitów amin katecholowych

Stanowi 75% metabolitów amin katecholowych

pochodzących z nadnerczy i wydalanych z moczem.

pochodzących z nadnerczy i wydalanych z moczem.



Zwiększone wydalanie może wiązać się z:

Zwiększone wydalanie może wiązać się z:



guzem chromochłonnym nadnerczy

guzem chromochłonnym nadnerczy

(pheochromocytoma),

(pheochromocytoma),



zwojakiem współczulnym (neuroblastoma).

zwojakiem współczulnym (neuroblastoma).



Na trzy dni przed badaniem pacjenci nie powinni

Na trzy dni przed badaniem pacjenci nie powinni

spożywać: bananów, cytrusów, czekolady, kakao,

spożywać: bananów, cytrusów, czekolady, kakao,

kawy oraz przyjmować salicylanów.

kawy oraz przyjmować salicylanów.

VMA – kwas wanilinomigdałowy –

VMA – kwas wanilinomigdałowy –

oznaczanie

oznaczanie

1.

1.

Próbkę moczu o pH 1,5 - 3,5, zneutralizować i nanieść

Próbkę moczu o pH 1,5 - 3,5, zneutralizować i nanieść

na kolumnę z jonowymieniaczem anionowym.

na kolumnę z jonowymieniaczem anionowym.

2.

2.

Przemyć kolumnę buforem.

Przemyć kolumnę buforem.

3.

3.

Doprowadzić pH eluenta buforem węglanowym do

Doprowadzić pH eluenta buforem węglanowym do

wartości 11.

wartości 11.

4.

4.

Dodać nadjodan sodowy w celu utlenienia waniliny.

Dodać nadjodan sodowy w celu utlenienia waniliny.

5.

5.

Oczytać absorbancję przy

Oczytać absorbancję przy

λ

λ

= 360 – 380 nm.

= 360 – 380 nm.

Wyniki fałszywie ujemne mogą obejmować do 20%

Wyniki fałszywie ujemne mogą obejmować do 20%

przypadków, wtedy zalecane jest przeprowadzenie

przypadków, wtedy zalecane jest przeprowadzenie

oznaczenia w moczu oddanym po napadzie ciśnienia.

oznaczenia w moczu oddanym po napadzie ciśnienia.

Katecholaminy

Katecholaminy

1.

1.

Z kolumny chromatograficznej wymywane są

Z kolumny chromatograficznej wymywane są

kwaśnym roztworem (kwas borny)

kwaśnym roztworem (kwas borny)

2.

2.

Utleniane żelazicjankiem potasowym do

Utleniane żelazicjankiem potasowym do

adrenochromów.

adrenochromów.

3.

3.

Stabilizowane roztworem kwasu askorbinowego.

Stabilizowane roztworem kwasu askorbinowego.

4.

4.

Odczyt absorbancji na fluorymetrze.

Odczyt absorbancji na fluorymetrze.