1

1

Produkcja witaminy

Produkcja witaminy

C

C

Błasiak Ewa

Błasiak Ewa

Duda Katarzyna

Duda Katarzyna

- podejście biotechnologiczne

- podejście biotechnologiczne

2

2

Witamina C = L-

Witamina C = L-

askorbinowy

askorbinowy

tzn.: "bez szkorbutu"

tzn.: "bez szkorbutu"

( "

( "

a

a

" = brak, "

" = brak, "

scorbutus

scorbutus

" = szkorbut)

" = szkorbut)

Dawniej szkorbut był chorobą popularną wśród

Dawniej szkorbut był chorobą popularną wśród

marynarzy, którym podczas długich rejsów

marynarzy, którym podczas długich rejsów

brakowało świeżych warzyw i owoców, czyli

brakowało świeżych warzyw i owoców, czyli

źródła witaminy C. To właśnie dzięki tej chorobie

źródła witaminy C. To właśnie dzięki tej chorobie

uświadomiono sobie ogromne znaczenie witamin

uświadomiono sobie ogromne znaczenie witamin

dla zdrowia, i życia człowieka.

dla zdrowia, i życia człowieka.

1932 r. Albert von Szent Gyorgyi

1932 r. Albert von Szent Gyorgyi

3

3

Witamina C …

Witamina C …



Udział w wytwarzaniu kolagenu

Udział w wytwarzaniu kolagenu



Właściwości antyoksydacyjne,

Właściwości antyoksydacyjne,



Zapewnia sprawne funkcjonowanie

Zapewnia sprawne funkcjonowanie

układu krwionośnego, a co za tym idzie

układu krwionośnego, a co za tym idzie

– serca, obniża poziom cholesterolu.

– serca, obniża poziom cholesterolu.



Wpływa na podnoszenie odporności

Wpływa na podnoszenie odporności

organizmu (być może właściwości

organizmu (być może właściwości

antywirusowe) - pobudza system

antywirusowe) - pobudza system

immunologiczny

immunologiczny

4

4

…

…

Witamina C

Witamina C



Do produkcji hormonów

Do produkcji hormonów

zwalczających stres.

zwalczających stres.



Pomaga we wchłanianiu Fe,

Pomaga we wchłanianiu Fe,

Mn, oraz zmniejsza

Mn, oraz zmniejsza

toksyczność Se, Cu, V, Co i Hg.

toksyczność Se, Cu, V, Co i Hg.



Niezbędna dla cukrzyków

Niezbędna dla cukrzyków

(wpływ na poziom glukozy we

(wpływ na poziom glukozy we

krwi)

krwi)



Kosmetyki

Kosmetyki



Chroni skórę przed działaniem

Chroni skórę przed działaniem

słońca i przed starzeniem.

słońca i przed starzeniem.



…

…

.

.

UWAGA! W niektórych

UWAGA! W niektórych

przypadkach witamina C ma

przypadkach witamina C ma

właściwości prooksydacyjne –

właściwości prooksydacyjne –

duże stężenie metali, odpow.

duże stężenie metali, odpow.

pH.

pH.

5

5

Witamina C – jako antyoksydant

Witamina C – jako antyoksydant

Właściwości antyoksydacyjne posiada

Właściwości antyoksydacyjne posiada

forma jonowa witaminy C -

forma jonowa witaminy C -

przejmuje ona elektron z wolnego

przejmuje ona elektron z wolnego

rodnika – tworzy się wolny rodnik

rodnika – tworzy się wolny rodnik

askorbowy, który jest następnie :

askorbowy, który jest następnie :

- utleniany przez oksydazę

- utleniany przez oksydazę

askorbinową do

askorbinową do

dehydroksyaskorbinianu (DHA),

dehydroksyaskorbinianu (DHA),

które reduktaza

które reduktaza

dehydroksyaskorbinowa redukuje

dehydroksyaskorbinowa redukuje

do formy jonowej witaminy,

do formy jonowej witaminy,

- redukowany przez reduktazę

- redukowany przez reduktazę

semidehydroaskorbinianowej do

semidehydroaskorbinianowej do

formy jonowej witaminy

formy jonowej witaminy

6

6

Synteza witaminy C

Synteza witaminy C



ROŚLINY – każda komórka roślina ma zdolność do jej

ROŚLINY – każda komórka roślina ma zdolność do jej

syntezy, aczkolwiek większe jej ilości są znajdowane

syntezy, aczkolwiek większe jej ilości są znajdowane

w tkankach merystematycznych, znajduje się w

w tkankach merystematycznych, znajduje się w

obrębie całej komórki – najwięcej jest jej w

obrębie całej komórki – najwięcej jest jej w

chloroplastach

chloroplastach

C

C

wit C

wit C

=

=

1

1

-

-

5

5

mM

mM

w liściach , 25mM w chloroplastach

w liściach , 25mM w chloroplastach



ZWIERZĘTA – zachodzi w wątrobie i/lub w nerkach,

ZWIERZĘTA – zachodzi w wątrobie i/lub w nerkach,

nie wszystkie potrafią ją syntetyzować, nie robią

nie wszystkie potrafią ją syntetyzować, nie robią

tego: naczelne - w tym człowiek, świnka gwinea,

tego: naczelne - w tym człowiek, świnka gwinea,

niektóre ryby i ptaki – u nich gen kodujący L –

niektóre ryby i ptaki – u nich gen kodujący L –

glukonolaktono oksydazę jest zmutowany – nie

glukonolaktono oksydazę jest zmutowany – nie

prowadzi do syntezy prawidłowego enzymu

prowadzi do syntezy prawidłowego enzymu

7

7

zwierzęta

zwierzęta

kontra

kontra

rośliny

rośliny

Biosynteza L-AA

Biosynteza L-AA

8

8

Gdzie ją znaleźć?

Gdzie ją znaleźć?

W Polsce:

W Polsce:

1)

1)

Owoce dzikiej róży - jedna z odmian zawiera w 100 g, ok.

Owoce dzikiej róży - jedna z odmian zawiera w 100 g, ok.

2400mg wit. C (minimalna dzienna dawka to ok. 60 mg)

2400mg wit. C (minimalna dzienna dawka to ok. 60 mg)

2)

2)

Natka pietruszki.

Natka pietruszki.

3)

3)

Inne produkty bogate w witaminę C to: truskawki, czarne

Inne produkty bogate w witaminę C to: truskawki, czarne

porzeczki, cytryny, pomarańcze, kiwi, grejpfruty, chrzan,

porzeczki, cytryny, pomarańcze, kiwi, grejpfruty, chrzan,

papryka, rzeżucha, koperek zielony.

papryka, rzeżucha, koperek zielony.

Znaczące ilości są w warzywach

Znaczące ilości są w warzywach

i owocach. Zboża, mleko i mięso

i owocach. Zboża, mleko i mięso

zawierają tylko śladowe

zawierają tylko śladowe

ilości albo nie zawierają jej wcale.

ilości albo nie zawierają jej wcale.

9

9

Czy nie za mało?

Czy nie za mało?



75 mg/

75 mg/

dzień

dzień

dla kobiet

dla kobiet



90 mg/

90 mg/

dzień

dzień

dla mężczyzn

dla mężczyzn



100 mg/

100 mg/

dzień

dzień

dla polaczy

dla polaczy

10

10

Produkcja

Produkcja



80 000 ton rocznie = koszt $600 mln

80 000 ton rocznie = koszt $600 mln

(produkcja wzrasta 3-4% rocznie) – 50%

(produkcja wzrasta 3-4% rocznie) – 50%

farmakologia, 25% - żywność, 15% przemysł

farmakologia, 25% - żywność, 15% przemysł

kosmetyczny, 10% - przemysł rolniczy;

kosmetyczny, 10% - przemysł rolniczy;



Obecnie standardową jest proces Reichsteina

Obecnie standardową jest proces Reichsteina

obejmujący 7 etapów

obejmujący 7 etapów

Witaminy C nie otrzymujemy z roślin ponieważ:

Witaminy C nie otrzymujemy z roślin ponieważ:

- za droga metoda (HPLC),

- za droga metoda (HPLC),

- za małe ilości witaminy się otrzymuje,

- za małe ilości witaminy się otrzymuje,

- Nie ma sensu ponieważ lepiej zjeść warzywko!

- Nie ma sensu ponieważ lepiej zjeść warzywko!

11

11

Proces Reichsteina

Proces Reichsteina

 Wynalezienie procesu ok. 60
lat temu
 Wydajność 50% (od D-
glukozy do kwasu L-
askorbinowego),
 Proces wieloetapowy
wymagający różnych
odczynników organicznych i
nieorganicznych oraz różnych
temperatur dla poszczególnych
reakcji,

WNIOSEK: Proces trudny do
przeprowadzenia i kosztowny!

12

12

Biosynteza L-AA w roślinach

Biosynteza L-AA w roślinach



Główny szlak biosyntezy

wymaga

L-galaktozy



Prekursorem jest

L-

galaktono-1,4-lakton

.



Droga przebiega przez

GDP-D-mannozę

i

GDP-L-

galaktozę

(pathway 1 in

figure).



Alternatywny szlak

biosyntezy zawiera

kwas

D-galakturonowy

jako

prekursor

L-galaktono-1,4-

laktonu

.

Główne enzymy tego szlaku

poznano dopiero w 1998 r.

13

13

GLOaza – L- glukonolaktono

GLOaza – L- glukonolaktono

oksydaza

oksydaza



GLOaza – utlenia L- gulonolakton

GLOaza – utlenia L- gulonolakton

do kwasu askorbinowego u zwierząt (2000)

do kwasu askorbinowego u zwierząt (2000)

14

14



Lactuca sativa

Nicotina tabacum

Zwiększona ilość produkcji witaminy C w
roślinach przyczyniła się do: wzrostu ich
odżywczych właściwości oraz do zapobiegania
ich brązowieniu.

15

15

Chlorella pyrenoidosa

Chlorella pyrenoidosa

Chlorella pyrenoidosa próbowano
wykorzystać jako źródło witaminy C
ponieważ:
 łatwo dostępna,
 prosta do hodowli,
 zawiera stosunkowo dużo witaminy
C (tzn. więcej aniżeli owoce czy
warzywa).

Produkcję przeprowadzano w
bioreaktorze uzyskując początkowo
40mg/l L-AA, po przypadkowej
mutagenezie i optymalizacji
warunków udało się otrzymywać 2g/l
(na początkowo dodanej 80g/l
glukozy => wydajność procesu 2,5%)

(1996 patent na otrzymywanie
wit. C z zielenicy)

16

16

Drożdże & D-EAA

Drożdże & D-EAA





D-Ara DH, D-arabinose dehydrogenase

D-AL Ox, D-arabinono-1,4-lactone oxidase;

L-Gal DH, L-galactose dehydrogenase;

GDPME, GDP-D-mannose-3,5-epimerase;

GDPM PPase, GDP-D-mannose
pyrophosphorylase

L-GL DH, L-galactono-1,4-lactone
dehydrogenase

HK, hexokinase

PGI, phosphoglucose isomerase

PMI, phosphomannose isomerase

PMM, phosphomannose mutase

D-EAA (Kwas D-erytroaskorbinowy) ma podobnie do L-AA
właściwości antyoksydacyjne, ale nie pełni pozostałych funkcji,
które normalnie spełnia witamina C w organiźmie (jka np.
stymulacja syntezy kolagenu).

17

17

Co się stanie gdy.....?

Co się stanie gdy.....?

Do hodowli

Do hodowli

S.cerevisiae

S.cerevisiae

dodano

dodano

prekursory witaminy C.

prekursory witaminy C.

18

18

Wnioski

Wnioski



D –arabinozo dehhydrogenaza i D –arabinozo

D –arabinozo dehhydrogenaza i D –arabinozo

oksydaza nie są bardzo specyficzne, ich substratem

oksydaza nie są bardzo specyficzne, ich substratem

mogą być zarówno prekursor L-AA i D-EAA

mogą być zarówno prekursor L-AA i D-EAA

(identyczna wydajność procesu) – współzawodnictwo

(identyczna wydajność procesu) – współzawodnictwo

pomiędzy nimi o miejsce aktywne enzymu

pomiędzy nimi o miejsce aktywne enzymu

Doświadczenie wskazuje na nową, alternatywną

Doświadczenie wskazuje na nową, alternatywną

metodę produkcji witaminy C. Na tym etapie nie jest

metodę produkcji witaminy C. Na tym etapie nie jest

ona opłacalna bo L- galaktoza jest bardzo rzadkim i

ona opłacalna bo L- galaktoza jest bardzo rzadkim i

drogim cukrem.

drogim cukrem.

Obecnie pracuje się nad utworzeniem nowego szczepu drożdży,

Obecnie pracuje się nad utworzeniem nowego szczepu drożdży,

które posiadałyby enzymy mogące przekształcać D- glukozę w

które posiadałyby enzymy mogące przekształcać D- glukozę w

L-galaktozę (projekt wspierany przez firmę Roche).

L-galaktozę (projekt wspierany przez firmę Roche).

19

19

Bakterie

Bakterie



Stosowane głównie do otrzymywania intemediantów procesu

Stosowane głównie do otrzymywania intemediantów procesu

Reichsteina, co pozwoli skrócić i usprawnić proces

Reichsteina, co pozwoli skrócić i usprawnić proces

Otrzymywanie 2 – keto L- glukonu
poprzez:

- Oksydacja l-glukozy do 2-KLG przez
Pantoea citrea (120g/l w czasie 120h),

- Oksydację D-sorbitolu / D-sorbozy di
2-KLG przez Gluconobacter oxydans

Zastosowanie
ukladu z NADP /
NADPH

20

20

Podsumowanie

Podsumowanie





Obecnie są trzy kierunki w

Obecnie są trzy kierunki w

biotechnologii, które mają na

biotechnologii, które mają na

ulepszenie produkcji witaminy C:

ulepszenie produkcji witaminy C:



Otrzymanie większej ilości L –AA za

Otrzymanie większej ilości L –AA za

pomocą manipulacji biosyntezą L- AA,

pomocą manipulacji biosyntezą L- AA,



Produkcja witaminy C przez drożdże,

Produkcja witaminy C przez drożdże,



Produkcja intermediatów (2- KLG)

Produkcja intermediatów (2- KLG)

procesu Reichsteina przez bakterie

procesu Reichsteina przez bakterie

21

21

THE END

THE END

THE

END