Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy

Wydział Lekarski

Biotechnologia

Badanie właściwości

antyoksydacyjnych wybranych

flawonoidów metodą

spektroskopii optycznej.

Praca wykonana pod kierunkiem
dr hab. Stefana Kruszewskiego, prof..
UMK
Katedra Biofizyki, Zakład Fizyki
Medycznej

Toruń 2012

Karolina Jakołcewicz

nr albumu 217507

Wolne rodniki



Wolne rodniki to niestabilne cząsteczki zawierające

niesparowany elektron.

In vivo rodniki powstają w wielu reakcjach i odgrywają

ważną rolę zarówno w fizjologii jak i patofizjologii:



w organizmach ssaków uwalniane są w łańcuchu oddechowym,

podczas utleniania hemoglobiny oraz podczas wybuchów

tlenowych komórek fagocytujących



u roślin mogą powstawać w procesie fotosyntezy



Rodniki mogą pełnić rolę przekaźników sygnału w

komórkach, negatywną stroną ich działania jest udział

w patogenezie

i rozwoju ponad dwustu chorób. Wśród tych chorób

znajdują się tzw. choroby cywilizacyjne takie jak

cukrzyca, choroby układu krążenia i nowotwory.

Flawonoidy



Flawonoidy to interesująca grupa związków

naturalnych, ze względu na szeroki zakres działania

jaki posiadają.



Obecność w ich strukturze chemicznej różnych grup

i ugrupowań sprawia, że wykazują one szeroki

zakres aktywności biologicznej. Dzięki takiej

budowie mogą

w różny sposób oddziaływać na metabolizm

komórkowy.



Głównym powodem dla którego stwierdzono

pozytywny wpływ flawonoidów na organizm

człowieka jest ich aktywność antyoksydacyjna, czyli

zdolność do neutralizacji wolnych rodników.

Kwercetyna

(3,5,7,3´,4´-pentahydroksyflawon)



Kwercetyna, czyli 3,5,7,3´,4´-pentahydroksyflawon jest jednym z

najbardziej rozpowszechnionych związków flawonoidowych.



Składa się z trzech pierścieni i pięciu grup hydroksylowych.



Otrzymana z surowca roślinnego w postaci krystalicznej jest praktycznie

nierozpuszczalna w wodzie.



Ma dobrą wchłanialność z przewodu pokarmowego.

Cel pracy:

1.

Wykazanie właściwości
antyoksydacyjnych wybranego
flawonoidu – kwercetyny

2.

Pokazanie interakcji pomiędzy
kwercetyną a białkiem surowicy
ludzkiej – albuminą

3.

Przebadanie wpływu anionorodnika
ponadtlenkowego na utlenianie HSA

W Y N I K I

Absorbancja kwercetyny w różnych przedziałach czasowych.

Widma przedstawiają ewolucję czasową kwercetyny z formy

nieutlenionej do formy utlenionej. Utlenianie kwercetyny było

wywołane obecnością wolnych rodników generowanych przez

AAPH.

Natężenie fluorescencji fluoresceiny w funkcji czasu w

obecności kwercetyny o różnych stężeniach. Krzywa wzorcowa

(czerwona linia) przedstawia próbkę, która nie zawierała

kwercetyny.

∆P otrzymano poprzez obliczenie różnicy miedzy polem pod
krzywą z antyoksydantem, a polem pod krzywą wzorcową.

Fragmenty widma zależności natężenia fluoryzacji kwercetyny

od stężenia HSA. Widmo ilustrujące próbkę bez HSA (linia

czerwona) wykazuje fluoryzację bliską zeru. Każde z kolejnych

widm zawiera HSA.

Natężenie fluorescencji fluoresceiny w funkcji czasu w

zależności od stężenia HSA i kwercetyny. Przedstawione

zostały pomiary natężenia fluorescencji dla roztworów

kwercetyny i HSA oraz dla roztworów kwercetyny i HSA w

różnym stosunku stężeniowym.

Zależność wartości pola pod wykresem od pojemności

antyutleniającej kwercetyny z HSA. ∆P otrzymano poprzez

obliczenie różnicy między polem pod krzywą z antyoksydantem,

a polem pod krzywą wzorcową. Obliczenia pola były wykonane

dla stężeń kwercetyny i HSA użytych

w badaniu widm emisji fluorescencji z poprzedniego wykresu.

Natężenie fluoryzacji kwercetyny z HSA w funkcji czasu w

zależności od obecności AAPH. Zaobserwować można wyraźną

różnicę w czasie fluoryzacji kwercetyny w momencie

pojawienia się rodników

w porównaniu z czasem fluoryzacji kwercetyny przy braku

rodników.

Absorbancja HSA w różnych przedziałach czasowych w

zależności od stopnia degradacji białka. Fragmenty widma

absorbancji przedstawiają ewolucję czasową HSA wywołaną

utlenianiem białka przez rodniki generowane przez AAPH.

Podsumowanie



Badania przeprowadzone metodą ORAC-FL wykazały

zdolności antyoksydacyjne kwercetyny, a także wykazały,

że są one wprost proporcjonalne do wzrostu jej stężenia.



Pomiar natężenia fluorescencji kwercetyny z HSA wykazał

zdolność do łączenia się tych dwóch cząsteczek.



Pomiar natężenia fluorescencji kwercetyny w połączeniu z

HSA

w obecności wolnych rodników wykazał, że kwercetyna

pomimo połączenia z białkiem wykazuje aktywność

atyoksydacyjną, ale jest ona mniejsza w stosunku do

aktywności jaką wykazuje kwercetyna występująca w

roztworze bez białka.



Reakcja prowadzona metodą opracowaną przez Witko-

Sarsat wykazała szkodliwy wpływ wolnych rodników na

HSA.