W2

Klonowanie

Enzymy wykorzystywane

w obróbce DNA in vitro

• Nukleazy
• Ligazy
• Fosfatazy
• Kinazy
• Glikozylazy
• Metylotransferazy
• Polimerazy

Łączenie fragmentów

DNA

Fragmenty DNA mogą być połączone przy pomocy

ligazy, jeżeli ich końce mają odpowiadające sobie

sekwencje i właściwe grupy funkcyjne 3’ i 5’

Plazmidy

•

Plazmid – pozachromosomowa, kolista cząsteczka
DNA zawierająca niezależny początek replikacji

•

Wektory plazmidowe są plazmidami sztucznie
zmodyfikowanymi, dzięki czemu lepiej nadają się
do obróbki w probówce

•

Typowe modyfikacje

:

–

Stałe miejsce do klonowania zawierające szereg
unikalnych miejsc restrykcyjnych (polilinker)

–

Obecność

co

najmniej

jednego

markera

selekcyjnego (np. oporności na antybiotyki)

–

Obniżona ilość DNA

Polilinker zawiera szereg pojedynczych miejsc restrykcyjnych

Schemat budowy wektora plazmidowego

Inne wektory

Bakteriofagi:

lambda i jego pochodne (dwuniciowe)
M13 i jego pochodne (jednoniciowe)

Sztuczne chromosomy bakteryjne
Sztuczne chromosomy drożdżowe
Wektory drożdżowe
Wektory bakulowirusowe (z wirusów owadzich)
Pochodne wirusów roślinnych
Pochodne plazmidów bakterii zakażających rośliny
Pochodne wirusów zakażających komórki ludzkie

Antybiotyki

i geny

oporności

powszechnie

wykorzystywa

ne w biologii

molekularnej

Wektory ekspresyjne

Klonowanie

Główne etapy

klonowania

1)

Trawienie próbki DNA

enzymem restrykcyjnym.

2)

Trawienie DNA wektora

enzymem restrykcyjnym.

3)

Ligacja próbki DNA

z wektorem.

4)

Transformacja bakterii

(E. coli) produktem ligacji.

5)

Wzrost bakterii na płytkach

agarowych

z antybiotykiem

selekcyjnym.

6)

Detekcja

interesujących nas klonów.

Łączenie różnych fragmentów

DNA

• Wektor-konkretna wstawka
• Biblioteka genomowa

Trawienie badanego DNA

Trawienie wektora tym samym enzymem restrykcyjnym

Ligacja plazmidu i

wstawki

Recyrkularyzacja (religacja)

plazmidu

T4 ligaza

Zapobieganie religacji

plazmidu

• Wykorzystanie alkalicznej fosfatazy
• Klonowanie ukierunkowane
• Adaptory

Wykorzystanie alkalicznej fosfatazy

do zapobieżenia ponownej ligacji

wektora

Zdefosforylowany wektor
(posiadający grupy OH
przy końcu 3’ i 5’) nie jest
odpowiednim substratem
dla ligazy DNA. Jest nim
natomiast

kombinacja

zdefosforylowanego
plazmidu

i

ufosforylowanego

(przy

końcu 5’) DNA wstawki.
Jako produkt końcowy
otrzymuje się wektor ze
wstawką
i

z

pojedynczym

nacięciem
w każdej z nici.

Klonowanie

ukierunkowane

Trawienie dwoma
różnymi
enzymami
restrykcyjnymi
umożliwia
włączenie
żądanego
fragmentu tylko w
jednej

orientacji

i

zabezpiecza

przed

religacją

wektora.

Adaptory i łączniki

Łączenie tępych końców

DNA

1.

Ligowanie

cząsteczek

wektora
i

wstawki,

przy

dużym

stężeniu DNA oraz ligazy z
faga T4

2. Zamykanie pierścienia po
rozcieńczeniu

DNA,

transformacja

i

selekcja

bakterii

Najczęściej używane metody
transformacji bakterii to:

Metoda chemiczna:

wykorzystująca

CaCl

2

(również mieszaniny innych soli i chlorek
sześcioaminokobaltowy) oraz szok
termiczny.

Elektroporacja:

oparta na krótkim

pulsowym zadziałaniu prądu
elektrycznego.

Biolistyka:

bombardowanie komórek

mikrocząstkami opłaszczonymi DNA.

Transformacja E. coli K-

12

produktem ligacji

Transformacja chemiczna

Elektroporacja

Biolistyka (gene-

gun)

Wysiewanie bakterii na

szalki

Identyfikacja

poszukiwanych

rekombinantów

A Identyfikacja

zrekombinowanych

plazmidów:

1. System

oparty

na

aktywności

-

galaktozydazy
(-komplementacja)

2. Analiza wielkości plazmidu

B Identyfikacja konkretnego klonu:

1. Przeszukiwanie kolonii przy użyciu metod

hybrydyzacyjnych (duża ilość kolonii)

2. Przeszukiwanie kolonii przy pomocy PCR

(niewielka ilość kolonii)

System ekspresyjny indukowany IPTG

Funkcja

enzymatyczna

beta-

galaktozydazy może zostać odtworzona z
dwóch fragmentów polipeptydowych, z
których

żaden

oddzielnie

nie jest aktywny.
Fragment genu kodujący koniec aminowy
(tzw. fragment alfa) jest obecny na
plazmidzie,

podczas

gdy

C-końcowy

(fragment

omega)

występuje

w

chromosomie bakteryjnym gospodarza,
lub na plazmidzie pomocniczym.

Wykorzystanie genu beta

galaktozydazy (lac Z) E.coli do

systemu detekcji

stransformowanych kolonii

Bacterial DNA

X-gal =
5-bromo-4-chloro-
3-indolilo--D-

galaktozyd

Niebieskie

kolonie

reprezentują

bakterie

oporne

na

ampicylinę, które zawierają wektor i produkują funkcjonalny
fragment

alfa

z nieuszkodzonej sekwencji kodującej LacZ alfa (brak insertu).
Białe kolonie reprezentują bakterie oporne na ampicylinę,
które zawierają wektor z insertem i nie produkują aktywnego
fragmentu alfa LacZ.

Elektroforeza trawionego

plazmidu

Identyfikacja rekombinantów

przez hybrydyzację

Przeszukiwanie kolonii przy

pomocy PCR

Startery specyficzne dla poszukiwanej wstawki

pozwalają na identyfikację poszukiwanej

sekwencji.

Wykorzystanie starterów

flankujących wstawkę pozwala

na wykrycie wszystkich

rekombinantów