Terapia genowa potencjalnie może
być użyta do:

* leczenia chorób wrodzonych, w których
brakuje produktu pojedynczego
genu lub jest on nieprawidłowy;

* w leczeniu nabytych chorób takich jak
nowotwór czy choroby zakaźne;

TERAPIA GENOWA

TERAPIA GENOWA CHORÓB GENETYCZNYCH

Idealnie

- naprawa mutacji genetycznej,

która jest odpowiedzialna za chorobę

W rzeczywistości

- dostarczenie prawidłowej

kopii zmutowanego genu

CELE TERAPII GENOWEJ

*efektywne przeniesienie genu do komórki

*zintegrowanie nowego genu z chromosomem

*długoterminowa ekspresja genu

*fizjologiczna ekspresja regulacji genu

*bezpieczeństwo

* sklonowany gen musi być przeniesiony
do komórek chorego;

* musi on ulec odpowiedniej ekspresji aby
zmniejszyć kliniczne objawy choroby;

* gen powinien być dostarczony do tkanki
w której ma miejsce jego ekspresja

W terapii genowej używa się dwóch głównych
metod aby wprowadzić sklonowany gen
do komórek:

a) metody ex vivo

b) metody in vivo

In vivo

Ex vivo

Tkanka

Wektor ze
sklonowanym genem

Usunięcie komórek
z organizmu chorego

Hodowla komórek
in vitro

Dodanie do komórek
wektora ze sklonowanym
genem

Namnożenie i selekcja
zmodyfikowanych komórek

Podanie komórek
do chorego

W metodzie ex vivo komórki są pobierane
z organizmu chorego, umieszczanie
w hodowlach, zmieniane genetycznie
in vitro a następnie dostarczane z powrotem
do organizmu chorego.

W metodzie in vivo gen jest bezpośrednio
wprowadzany do komórek chorego.

Metoda in vivo jest preferowana w terapii
genowej, ponieważ teoretycznie jest ona
bardziej wydajna i tańsza.

Niestety ta metoda jest ograniczona przez
nieskuteczność dostarczenia genów do
specyficznych tkanek i braku możliwości
kontroli do których komórek dostał się
przekazany gen.

SYSTEMY DOSTARCZANIA GENÓW

Zarówno w metodzie in vivo jak i ex vivo
terapia genowej wymaga skutecznej metody
wprowadzenia genu do komórki jak również
uzyskania odpowiedniego poziomu
ekspresji wprowadzonego genu.

Wszystkie metody wprowadzenia genu
do komórki mają swoje wady i zalety
i żadna metoda nie jest idealna.

Metody używane do wprowadzenia genu
do komórek mogą być podzielone
na dwie grupy:

a) metody chemiczne i fizyczne

b) metody biologiczne

METODY CHEMICZNE I FIZYCZNE

Korzyści

Wady

Fosforan wapnia

łatwe w użyciu

losowa integracja;

nieefektywne dostarczanie

Elektroporacja

łatwe w użyciu;

losowa integracja;

użycie z wieloma

nieefektywne dostarczanie

typami komórek

Kationowe liposomy

nie-infekcyjne; nie

niestabilne; słaba ekspresja

powodują odpowiedzi

genu; DNA episomalne

immunologicznej; mogą
być stosowane in vivo;
mogą przenosić duże
fragmenty DNA

METODY BIOLOGICZNE

BIOLOGICZNE (WIRUSOWE) WEKTORY

Korzyści

Wady

Retrowirusy

stała ekspresja;

losowa integracja;

efektywna transdukcja

zarażanie tylko dzielących się

komórek; zmienna ekspresja;
limit wielkości DNA;

Adenowirusy

zakażanie przy pomocy

przejściowa ekspresja;

receptorów; zakażanie

nie łączy się z genomowym

nie dzielących się

DNA; wywołuje odpowiedź

komórek;

immunologiczną; limit
wielkości DNA

Gdy gen lub DNA dostanie się do komórki,
mogą go spotkać różne losy.

W niektórych przypadkach część DNA ulega
degradacji w lizosomach.

DNA wtedy nigdy nie dostaje się do jądra
komórkowego i nie ulega ekspresji w komórce.

W innych przypadkach DNA może dostać
się do jądra komórkowego w formie nie
zdegradowanej, ulec rekombinacji
z chromosomami komórki i może w sposób
stały zostać zintegrowane z genomowym DNA.

Gdy zachodzi proces integracji egzogennego
DNA, przebiega to poprzez nie-homologiczną
rekombinację w której DNA jest losowo łączone
z chromosomami w różnych miejscach.

Bardzo rzadko łączy się egzogenne DNA
z chromosomami w miejscach homologicznego
genu.

Nawet jeżeli egzogenne DNA nie ulega
integracji z homologicznymi miejscami w
genomowym DNA, zostaje ono na stałe
włączone w genomowe DNA i w ten
sposób ulega stałej ekspresji i przekazaniu
do wszystkich komórek podczas mitozy.

W niektórych metodach przeniesienia
egzogennego genu do komórki nie integruje
on się z chromosomalnym DNA lecz pozostaje
poza chromosomem w jako DNA episomalne.

Ponieważ episomalne DNA nie zawiera
centromeru, nie następuje przekazanie DNA
do komórek powstałych podczas mitozy.

Informacja genetyczna ulega ekspresji tylko
przejściowo, ponieważ episomalne DNA jest
tracone po kilku podziałach mitotycznych
komórki.

WEKTORY NIEWIRUSOWE

Dostarczenie DNA do komórki jest możliwe
poprzez elementy nazwane wektorami, które
pomagają dostarczyć gen do komórki.

Elementy chemiczne i fizyczne używane do
dostarczenia genów do komórki nazywane są
wektorami nie-wirusowymi.

Metody takie jak precypitacja z fosforanem
wapnia czy elektroporacja są używane raczej
w metodach in vitro terapii genowej.

PRECYPITACJA FOSFORANEM WAPNIA

Po zmieszaniu z fosforanem wapnia DNA
precypituje na powierzchni komórki
a następnie poprzez fagocytozę jest pobierane
do komórki i dostarczane do lizosomów.

Gdy DNA ulegnie uwolnieniu z lizosomów
przechodzi do jądra komórkowego.

DNA może pozostać episomalnym ulegając
tylko przejściowej ekspresji lub może ulec
losowej integracji z chromosomalnym DNA
i w ten sposób podlegać stałej ekspresji.

ELEKTROPORACJA

Komórki są eksponowane do pola elektrycznego
w obecności DNA.

Powoduje to tworzenie się pór w błonie
komórkowej, które umożliwiają pobranie DNA
do endosomów.

Gdy DNA opuszcza endosomy przechodzi przez
cytoplazmę i wchodzi do jądra komórkowego,
gdzie losowo łączy się z chromosomalnym DNA
i ulega ekspresji.

WEKTORY RETROWIRALNE

Najbardziej powszechnymi wektorami
biologicznymi obecnie używanymi w protokołach
terapii genowej są wektory pochodzenia
wirusowego.

Są one uszkodzone w taki sposób, że mają jeszcze
zdolność wejścia do komórki i ekspresji genów,
lecz nie mają zdolności replikacyjnej i infekcyjnej.

Zarówno wirusy zawierające RNA jak i DNA są
używane do tworzenia wektorów do terapii genowej.

Najczęściej używanymi i obecnie najlepiej
rozwiniętymi wektorami wirusowymi do terapii
genowej są wektory retrowirusowe.

Retrowirusy zawierają jako materiał kodujący
RNA i potrafią w sposób wydajny infekować
wiele typów rosnących komórek i losowo
wprowadzać kopię swojego genomu do
chromosomów gospodarza, produkując komórki
z stabilnie zintegrowanym wirusowym genomem.

Wirus infekuje rosnące komórki poprzez łączenie
się ze specyficznym receptorem na powierzchni
komórek.

Wirus ulega endocytozie do endosomów.

Po uwolnieniu z endosomów genomowe RNA
jest odwrotnie przepisane do DNA przez odwrotną
transkryptazę, tworząc dwuniciowe DNA, które
wchodzi do jądra komórkowego i łączy się
losowo z chromosomami komórki.

Wejście do jądra komórkowego wymaga
rozerwania błony jądra komórkowego.

Proces ten

ma miejsce jedynie podczas mitozy, ograniczając
infekcje przez retrowirusy do komórek
podlegających podziałowi i aktywnemu wzrostowi.

Gdy DNA wirusa złączy się z chromosomalnym
DNA, pozostaje stałe i jest transkrybowane
do RNA, które zawiera całą wirusową sekwencję
genową i jest pakowane do nowych cząstek
wirusowych.

Obecność wirusowego DNA w chromosomach
komórek nie wpływa na wzrost i metabolizm
komórki, co umożliwia komórkom przeżycie i
rozmnażanie.

ZALETY WEKTORÓW RETROWIRUSOWYCH

Mają zdolność integrowania swojego genomu

z chromosomami gospodarza. Nawet mimo tego,
że integracja jest losowa, powstaje komórka która
stale utrzymuje przeniesiony gen umożliwiając
długoterminową ekspresję genu.

Wirus może zarażać wiele dzielących się

komórek.

WADY WEKTORÓW RETROWIRUSOWYCH

Retrowirusy mogą wywołać raka.

Możliwość przeniesienia tylko małych

genów do 8-9 kb

Retrowirusy infekują tylko aktywnie dzielące

się komórki.

Losowa integracja wirusowego DNA

z chromosomem gospodarza może
spowodować uszkodzenie ważnego genu
(gen supresorowy nowotworów)

ADENOWIRUSY

Adenowirusy są wirusami zawierającymi DNA.

Powodują one infekcję układu oddechowego.

Adenowirusy zarażają zarówno dzielące się jak
i nie dzielące się komórki.

Negatywną stroną użycia adenowirusów jest to,
że DNA nie łączy się z chromosomem gospodarza
lecz pozostaje episomalnym.

Stała ekspresja przeniesionych genów jest
poważnym problemem. Powodują wytworzenie
stanu zapalnego i produkcję przeciwciał
przeciwko białkom wirusowym.

Reakcja immunologiczna ogranicza ponowne
użycie wirusa, co z drugiej strony jest konieczne,
ponieważ brakuje stałej ekspresji genu z powodu
episomalnego adenowirusowego DNA.