Mysie modele

nowotworów jelit

• Rak jelita grubego jest jednym z najczęściej

występujących

nowotworów

złośliwych,

zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn.

• W krajach rozwiniętych, pod względem

śmiertelności, zajmuje on drugie miejsce.

• Chorobami prowadzącymi do rozwoju raka

jelita grubego są m.in.:

- rodzinna polipowatość gruczolakowata
- dziedziczna niezwiązana z polipowatością

postać raka jelita grubego

- nieswoiste zapalne choroby jelit

Rodzinna polipowatość

gruczolakowata (familiar

adenomatous polyposis, FAP)

• FAP jest chorobą autosomalną dominującą, w

której wiele polipów gruczolakowatych rozwija
się w okrężnicy, rzadziej w proksymalnej części
jelita. Choroba ta często prowadzi do rozwoju
raka jelita grubego. Badania genetyczne
wykazały, że za rozwój FAP odpowiada
inaktywacja

genu

APC

(antyonkogenu),

zlokalizowanego na chromosomie 5q21.

• Pacjenci z FAP często chorują także na inne

nowotwory, np. twardego włókniaka skóry,
rdzeniaka czy kostniaka.

• Mysie modele FAP posiadają heterozygotyczną

mutację w genie Apc.

• Modele

te

są

wartościowym

narzędziem

wykorzystywanym w badaniach nad procesem
nowotworzenia w jelitach, ponieważ większość
sporadycznych ludzkich nowotworów posiada
mutacje inaktywujące gen APC.

• Myszy Apc

+/-

, takie jak Apc

Min/+

, rozwijają

nowotwory głównie w jelicie cienkim, podczas
gdy ludzie chorują głównie na nowotwory jelita
grubego.

Myszy Min

• Pierwszym mysim modelem FAP noszącym

mutację w genie Apc, był model Min (multiple
intestinal neoplasia, gruczolakowatość jelitowa).
Myszy Apc

Min/+

są heterozygotyczne pod kątem

mutacji w genie Apc. Mutacja ta jest dziedziczona
w sposób autosomalny dominujący i prowadzi do
powstania skróconej formy białka. Podobnie jak
pacjenci z FAP, myszy Apc

Min/+

rozwijają liczne

polipy gruczolakowate. Wszystkie guzy tracą z
czasem dziki allel Apc.

• W przeciwieństwie do pacjentów z FAP, którzy

rozwijają gruczolakoraki w okrężnicy, większość
gruczolakoraków u myszy Apc

Min/+

znajduje się w

jelicie cienkim.

• Z powodu krwawienia z jelita oraz ciężkiej

anemii, myszy Min rzadko żyją dłużej niż 140
dni.

Apc

1638N

• Do genomu myszy Apc

1638N

wstawiono kasetę

ekspresyjną dla neomycyny. Myszy te wykazują
fenotyp predysponujący do nowotworzenia.
Rozwijają

się

u

nich

jelitowe

ogniska

nieprawidłowych krypt oraz kilka polipów ok. 10-
16 tygodnia życia. Ok. 25-30 tygodnia życia
rozwijają się guzy jelita cienkiego. Jelito cienkie
wykazuje znaczną hiperplazję oraz przejście od
gruczolaka do raka.

Myszy Apc

D14/+

• Nowy mysi model FAP, Apc

D14/+

, posiada

heterozygotyczną delecję eksonu 14 genu Apc,
która prowadzi do ostrej jelitowej polipowatości.
Stopień nasilenia fenotypu zależy od sposobu
hodowli myszy sugerując, że mikrośrodowisko
jest istotnym czynnikiem dla rozwoju polipów
jelitowych.

Podstawową

różnicą

pomiędzy

myszami Apc

Min/+

,a Apc

D14/+

jest to, że polipy u

myszy Apc

D14/+

znajdują się w jelicie grubym.

• Większość

mysich

mutantów

Apc

rozwija

gruczolakowate polipy w jelicie cienkim, a nie w
grubym. Jednakże dodatkowa mutacja w genie Cdx2 u
myszy Apc

Δ716

zmienia lokalizację rozwoju polipów.

Większość polipów rozwija się u tych myszy w jelicie
grubym, podobnie jak u ludzi z FAP.

• U większości mysich modeli Apc rozwijają się polipy

gruczolakowate, ale nie przechodzą one w inwazyjne
lub przerzutujące gruczolakoraki ze znaczącą
częstością. Mutacje w innych genach mogą zmienić
progresję nowotworów u myszy Apc. Mutacja w genie
Smad4 u myszy Apc

Δ716

powoduje rozwój inwazyjnego,

przerzutującego gruczolakoraka. Co ważne, polipy
jelitowe u tych myszy szybko przekształcają się w
bardzo inwazyjne gruczolakoraki.

Dziedziczna niezwiązana z

polipowatością postać raka jelita

grubego (hereditary nonpolyposis

colorectal cancer, HNPCC)

• HNPCC jest chorobą dziedziczoną w sposób

autosomalny

dominujący

z

kryterium

diagnostycznym, zwanym kryterium Amsterdamskim,
które obejmuje 3 lub więcej zaatakowanych przez
chorobę członków rodziny w 2 lub więcej
następujących po sobie pokoleniach z co najmniej 1
członkiem rodziny zdiagnozowanym przed 50 rokiem
życia.

• Do spektrum fenotypowego zalicza się wczesne

wystąpienie raka jelita grubego, z lub bez raka
endometrium, żołądka, jelita cienkiego, dróg
moczowych czy jajnika.

• Spektrum nowotworów pozwala na podział HNPCC

na zespoły chorobowe:
Lynch I – obecny tylko rak jelita grubego
Lynch II – obecne są dodatkowe nowotwory

• Chorzy z HNPCC są nosicielami heterozygotycznych

mutacji w genach naprawy MMR, jednakże, kiedy
guz się rozwija, najczęściej tracą dziki allel poprzez
somatyczne procesy i w konsekwencji są podatni na
błędy replikacji w sekwencjach powtarzających się.

• Większość mutacji odpowiedzialnych za

rozwój HNPCC dotyczy 3 genów MMR: MLH1
(50%), MSH2 (40%) oraz MSH6 (10%).

Myszy ze zmutowanymi homologami

MutS

•

Fenotyp myszy linii Msh2

-/-

jest ostrzejszy niż u myszy

Msh3

-/-

czy Msh6

-/-

. Inaktywacja genu Msh2 powoduje

gwałtowny spadek przeżywalności myszy. Podczas
gdy heterozygotyczne myszy Msh2 posiadają
normalną

długość

życia,

50%

myszy

homozygotycznych umiera w wieku 6 miesięcy,
wszystkie umierają do ok. 11-12 miesiąca życia.
Spadek przeżywalności u myszy Msh2

-/-

jest związany

z wysoką predyspozycją do rozwoju nowotworów.
Zwierzęta które dożywają 6 miesiąca rozwijają
gruczolaki oraz gruczolakoraki jelita cienkiego.
Część z tych zwierząt rozwija również raka
gruczołów łojowych.

• Myszy Msh2

GA/GA

wykazują silną predyspozycję

do rozwoju nowotworów. Rozwija się u nich
chłoniak z limfocytów T, jelitowy gruczolakorak
oraz rak płaskokomórkowy, podobnie jak u
myszy Msh2

-/-

.

• Jednakże, 50% stopień przeżycia różni się

pomiędzy tymi modelami (6 miesięcy dla Msh2

-/-

oraz 9-10 miesięcy dla Msh2

GA/GA

), wskazując na

to, że zależny od MMR szlak sygnalizujący
uszkodzenie DNA jest istotny dla supresji
wczesnych etapów nowotworzenia.

• Analiza myszy Msh6

-/-

pozwoliła na stwierdzenie,

że

gen

ten

jest

genem

podatności

odpowiedzialnym za opóźniony rozwój choroby.
Inaktywacja tego genu u myszy powodowała
silną predyspozycję do nowotworzenia, ze
spektrum nowotworów podobnym do myszy
Msh2

-/-

. Jednakże początek rozwoju nowotworów

u myszy Msh6

-/-

jest opóźniony i zwierzęta

przeżywają do 16 miesiąca życia. Fenotyp myszy
Msh6 sugeruje, ze u ludzi mutacje w genie MSH6
są związane z późniejszym rozwojem choroby.

• Mutacje MSH6 są często związane z atypowym

HNPCC, który charakteryzuje się rozwojem
choroby w wieku 60 lat lub późniejszym.
Ponadto, myszy Msh6

-/-

rozwijają raka macicy,

który również jest obecny u znacznej liczby
pacjentów z mutacjami w genie MSH6.

Mysie mutanty homologów MutL

• Inaktywacja genu Mlh1 u myszy prowadzi do

zredukowanej

przeżywalności

i

silnej

predyspozycji do rozwoju nowotworów, podobnie
do myszy Msh2

-/-

, ze spektrum nowotworów

zawierającym

chłoniaki

z

komórek

T,

gruczolakoraki jelita i raka skóry.

• Inaczej niż u pacjentów z HNPCC mających mutacje w

genach MSH2, MSH6 i MLH1, heterozygotyczne
myszy mające mutacje w wymienionych wyżej genach
maja opóźniony rozwój choroby. Homozygotyczne
myszy Msh2, Msh6 i Mlh1 są wysoce podatne na
rozwój guzów, ze spektrum nowotworów zawierającym
raki przewodu pokarmowego, ale w przeciwieństwie
do pacjentów z HNPCC, większość myszy umiera
przedwcześnie z powodu agresywnych chłoniaków.

Nieswoiste zapalne choroby jelit

(inflammatory bowel disease, IBD)

• Choroba Crohn’a (CD, ang. Crohn’s disease) oraz

wrzodziejące

zapalenie

okrężnicy

(UC,

ang.

ulcerative colitis) są to przewlekłe choroby zapalne
jelita, które są również nazywane nieswoistymi
zapalnymi chorobami jelit (IBD, ang. inflammatory
bowel disease). Etiologia IBD nie jest w pełni
poznana, ale uważa się, że złożone oddziaływania
pomiędzy czynnikami genetycznymi, środowiskowymi
i immunologicznymi są odpowiedzialne za inicjację i
progresję choroby.

• Wyniki badań nad IBD sugerują, że nadmierna

odpowiedź immunologiczna gospodarza przeciwko
antygenom komensali jelitowych jest głównym
powodem rozwoju IBD oraz zniszczenia śluzówki
zarówno w UC, jak i CD.

• Jednakże, pomimo, że choroby te dzielą pewne

efektorowe szlaki, CD i UC są immunologicznie i
histopatologicznie odmienne.

• Istnieją dowody wskazujące na to, że przewlekłe

zapalenie u pacjentów z UC jest związane z
odpowiedzią immunologiczną Th2, która jest
związana z dysfunkcją bariery nabłonkowej. Inaczej
jest w przypadku pacjentów z CD, u których
wykryto podwyższony poziom cytokin IFN-γ, IL-2
oraz TNF-α w jelicie, co jest charakterystyczne dla
odpowiedzi typu Th1.

• Postęp w rozumieniu odporności śluzówkowej

został osiągnięty dzięki badaniom nowych
eksperymentalnych

modeli

zwierzęcych

zapalenia jelitowego.

• Większość z tych modeli powstała poprzez

indukcję

chemiczną,

transfer

komórek

immunologicznych czy modyfikacje genetyczne.
Tylko u nielicznych modeli choroba rozwija się
bez jakichkolwiek zewnętrznych manipulacji.

• Mysie modele IBD zostały podzielone na 3 kategorie,

ze względu na rodzaj defektów w odporności
śluzówkowej odpowiedzialnych za rozwój choroby:

1. Defekty w

przepuszczalności/integralności nabłonka

• Jednowarstwowy nabłonek jelitowy jest fizyczną i

immunologiczną

barierą,

która

zapobiega

bezpośredniemu kontaktowi jelitowej śluzówki z
mikroorganizmami znajdującymi się w świetle
jelita. Niewłaściwie funkcjonująca bariera jelitowa
może odgrywać istotną rolę w rozwoju IBD,
poprzez umożliwienie wniknięcia antygenów i
mikroorganizmów znajdujących się w świetle jelita
do śluzówki i inicjację silnej odpowiedzi zapalnej.

Zapalenie okrężnicy wywołane DSS

• Podawanie myszom przez kilka dni polimerów DSS

w wodzie pitnej indukuje wysoce powtarzalne ostre
zapalenie okrężnicy charakteryzujące się krwawą
biegunką, owrzodzeniem oraz infiltracją przez
granulocyty. Uważa się, że DSS jest bezpośrednio
toksyczny

dla

komórek

nabłonkowych

podstawowych krypt jelita i w ten sposób wpływa na
integralność bariery śluzówkowej.

• Model ostrego zapalenia okrężnicy wywołanego DSS

jest użyteczny w badaniach wpływu mechanizmów
odporności

wrodzonej

na

rozwój

zapalenia

okrężnicy. Ponadto, model DSS okazał się użyteczny
do badania mechanizmów naprawy nabłonkowej.

• U

podatnych

szczepów,

podawanie

DSS

w

kilkukrotnych cyklach (np. 7 dni DSS, 14 dni woda)
powodowało rozwój przewlekłego zapalenia okrężnicy
i gdy podawano DSS z pojedynczą wstępną dawką
genotoksycznego kancerogenu jelita grubego AOM
(azoksymetan), prowadziło to do rozwoju związanego z
zapaleniem raka jelita grubego.

• Ponieważ zapalenie jelita grubego prawdopodobnie

odgrywa istotną rolę w rozwoju raka jelita grubego
związanego z IBD, model AOM/DSS jest niezwykle
użytecznym narzędziem poznawczym dla badania
mechanizmów łączących zapalenie z procesem
nowotworzenia w jelicie grubym.

Zapalenie okrężnicy wywołane

TNBS/oksazolonem

•

Zapalenie okrężnicy może być indukowane w
podatnych szczepach myszy poprzez doodbytnicze
wkroplenie

TNBS/DNBS

lub

oksazolonu

rozpuszczonych w etanolu. Etanol jest niezbędny do
przełamania bariery śluzówkowej, podczas gdy
TNBS/oksazolon prawdopodobnie wiąże się jako hapten
z autologicznymi jelitowymi lub drobnoustrojowymi
białkami powodując, że są one immunogenne dla
systemu immunologicznego gospodarza.

•

Wykazano, że komórki T CD4+ odgrywają kluczową
rolę w przewlekłym zapaleniu okrężnicy indukowanym
TNBS. Model ten jest więc użyteczny w badaniach nad
odpowiedzią immunologiczną śluzówki zależną od
komórek Th.

•

Model zapalenia okrężnicy TNBS jest użyteczny w
badaniach wielu istotnych aspektów zapalenia jelita,
wliczając tu wzór sekrecyjny chemokin, mechanizmy
ustnej tolerancji, adhezję komórek czy immunoterapię.

•

Zapalenie okrężnicy wywołane oksazolonem jest
jednym z niewielu modeli odpowiednich do badania
wpływu odpowiedzi immunologicznej Th2-zależnej na
zapalenie jelitowe. Tak jak w modelu TNBS, zapalenie
okrężnicy wywołane oksazolonem jest zależne od
rodzaju szczepu myszy i wymaga indywidualnej
optymalizacji.

•

Jest to potwierdzone przez fakt, że małe dawki
oksazolonu mogą indukować zapalenie okrężnicy
Th1/Th2-zależne.

Myszy transgeniczne DN N-kadheryna

• Interesującym modelem dostarczającym bezpośrednich

dowodów na to, że nienaruszona bariera nabłonkowa jest
istotna

dla

homeostazy

śluzówkowej,

są

myszy

transgeniczne/chimeryczne, u których występuje ekspresja
zmutowanego białka adhezyjnego komórek – N-kadheryny –
w komórkach nabłonkowych jelita wzdłuż osi kosmka krypty
jelitowej.

• Myszy

te

rozwijają

w

obszarach

nabłonka

chimerycznego/przepuszczającego przewlekłe IBD, a w
późniejszym czasie również nowotwory jelita. Obserwacja, że
zapalenie pojawia się tylko w sąsiedztwie nieszczelnych
komórek nabłonkowych jest bezpośrednim dowodem na to, że
wniknięcie antygenów prawidłowej mikroflory śluzówkowej
jest wystarczające do indukcji odpowiedzi prowadzących do
zapalenia okrężnicy.

Myszy SAMP1/YitFc (Samp)

•

Model

ten

jest

znakomitym

eksperymentalnym

narzędziem do badania mechanizmów choroby Crohn’a,
ponieważ zapalenie pojawia się spontanicznie i jest to
jeden z nielicznych modeli z ostrym zapaleniem w
terminalnej części jelita krętego, pierwotnej lokalizacji
zmian patologicznych CD.

•

Te

zmiany

patologiczne

charakteryzują

się

pełnościennym zapaleniem, ziarniniakami i zmianami w
morfologii nabłonka.

• W przeciwieństwie do innych modeli myszy

SAMP przetrzymywane w warunkach wolnych
od mikroorganizmów rozwijają zapalenie
jelita, aczkolwiek w mniejszym wymiarze.

• Zwiększona

przepuszczalność

nabłonka

poprzedza początek zapalenia i uważa się, że
dysfunkcja komórek nabłonkowych może być
główną

przyczyną

progresji

choroby.

Jednakże,

należy

określić

czy

defekty

przepuszczalności nabłonka obserwowane u
tych myszy są przyczyną czy konsekwencją
zapalenia jelita krętego.

2. Defekty komórek odporności

wrodzonej

• Badania na modelach zwierzęcych przyczyniły się

do

znacznego

wzrostu

ilości

dowodów

potwierdzających przypuszczenie, że nadmierna
aktywacja

komórek

odpornościowych

lub

niewłaściwa

odpowiedź

dalszych

szlaków

regulatorowych są w dużym stopniu zaangażowane
w indukcję zapalenia śluzówkowego.

Niedobór STAT3 w komórkach szpiku

• Myszy ze specyficzną modyfikacją w genie STAT3

makrofagów i neutrofili rozwijają spontaniczne
zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy. Choroba z
pełnościennymi

patologicznymi zmianami i

wysoką częstością gruczolakoraka jelita grubego
rozwija się u myszy, które są w wieku kilku
miesięcy. Zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy u
tych myszy jest zależne od obecności komórek
odporności adaptacyjnej oraz obecności IL-12.

Myszy z niedoborem A20

• A20 jest indukcyjnym i ulegającym wysokiej

ekspresji białkiem cytoplazmatycznym, które jest
inhibitorem aktywności NFκB indukowanego
przez TNF. Myszy z niedoborem A20 rozwijają
spontaniczne

zapalenie,

kacheksję

i

przedwcześnie

umierają,

po

części

przez

niezdolność komórek z niedoborem A20 do
terminacji odpowiedzi NFκB.

3. Defekty w komórkach odporności

nabytej

Myszy transgeniczne STAT4

• STAT4

jest

regulatorowym

czynnikiem

transkrypcyjnym,

szczególnie

związanym

z

sygnalingiem receptora dla IL-12/IL-23. Myszy z
nadekspresją

STAT4

pod

kontrolą

promotora

cytomegalowirusowego

rozwijają

ciężką

postać

pełnościennego zapalenia okrężnicy. Przenikające
płytkę własną komórki T CD4+ tych myszy produkują
po stymulacji αCD3/αCD28 in vivo i in vitro przede
wszystkim TNF-α oraz IFN-γ, ale nie IL-4, zgodnie z
odpowiedzią komórkową typu Th1. To wskazuje, że
niewłaściwa aktywacja szlaku efektorowego Th1 może
być wystarczająca do zniszczenia śluzówkowej
równowagi immunologicznej.

Myszy TCRα

−/−

• Myszy

z

deficytem

łańcucha

TCR-α

spontanicznie rozwijają śluzówkowe zapalenie
w

wieku

12-16

tygodni,

z

pewnymi

charakterystycznymi cechami podobnymi do
UC u ludzi. Przeważa patologiczna odpowiedź
immunologiczna typu Th2 w przewodzie
żołądkowo-jelitowym tych myszy.