DIAGNOSTYKA

CHORÓB

AUTOIMMUNIZACYJNYC

H

Cechą charakterystyczną jest

występowanie auto-przeciwciał
przeciwko:

- określonym komórkom/tkankom

(autoimmunizacja narządowo-
swoista)

- różnym komórkom/tkankom

(autoimmunizacja narządowo-
nieswoista)

Do chwili obecnej wyodrębniono ponad 100 autoantygenów

w przebiegu chorób autoimmunologicznych, 30
autoantygenów ma znaczenie diagnostyczne.

Metodę bezpośrednią stosuje się do wykrywania

immunoglobulin i dopełniacza związanych in vivo w

tkankach.

Jest to metoda jednofazowa, w której

skrawki zamrożonej tkanki inkubuje się ze

znakowanym przeciwciałem zwierzęcym skierowanym

przeciw ludzkim immunoglobulinom.

Metoda pośrednia jest metodą dwufazową, 10-krotnie

bardziej czułą niż metoda bezpośrednia.

Jest stosowana rutynowo do wykrywania przeciwciał

krążących. Technika ta oparta jest na zdolności

wiązania się przeciwciał krążących z odpowiednim

antygenem obecnym w tkance użytej jako substrat

antygenowy.

W drugim etapie skrawek tkankowy ze związanym

ludzkim przeciwciałem inkubuje się z przeciwciałem

zwierzęcym znakowanym fluorochromem

(koniugatem).

W badaniu połilościowym poprzez inkubowanie

substratu tkankowego w pierwszym etapie reakcji IF

z kolejnymi rozcieńczeniami badanej surowicy

określa się poziom (miano) przeciwciał.

Immunofluorescencja

bezpośrednia

Ag

F

F

F

Ag

F

F

F

UV

Emisja
światła

Antygen
tkankowy

Przeciwciało
Sprzężone z
fluorochromem

Immunofluorescencja

pośrednia

Ag

Antygen tkankowy
(Hep-2, neutrofile)

Przeciwciała w
badanej
surowicy

Ag

+

F

F

F

Ag

F

F

F

UV

Skoniugowane z fluorochromem przeciwciała

METODY STOSOWANE

W DIAGOSTYCE

AUTOIMMUNOLOGICZNEJ

1. Metody immunofluorescencji (IF)
-

metoda bezpośrednia (DIF)

-

metoda pośrednia (IIF) - „złoty standard”
w diagnostyce ch.
autoimmunologicznych

Źródłem natywnych antygenów są substraty

tkankowe. Znakowane fluorochromem p-ciało
sprawia, że w miejscu związania
ze swoistym antygenem w tkance
obserwuje się charakterystyczną żółto
-zieloną fluorescencję.

W jaki sposób oznaczamy obecność

W jaki sposób oznaczamy obecność

przeciwciał przeciwjądrowych?

przeciwciał przeciwjądrowych?

- Pobranie krwi
- Wyizolowanie surowicy
- Nałożenie surowicy na komórki Hep-2

-Dodanie przeciwciał znakowanych fluoronchromem

-Odczytanie reakcji pod mikroskopem fluorescencyjnym

Podstawowe typy

fluorescencji jądrowej to:

- homogenny przeciwko kompleksowi: DNA-

histon

- obwodowy przeciwciała przeciwko

dwuniciowemu DNA,

- drobnoziarnisty
- gruboziarnisty
- jąderkowy
- antycentromerowy

TYP ŚWIECENIA - HOMOGENNY

TYP ŚWIECENIA -

GRUBOZIARNISTY

TYP SWIECENIA –

DROBNOZIARNISTY

TYP ŚWIECENIA -

ANTYCENTROMEROWY

TYP ŚWIECENIA -

CYTOPLAZMATYCZNY

Fluorescencja cytoplazmatyczna:

Zalety IIF:

• jeden substrat – skryning 100 różnych

antygenów

• pełne spectrum antygenów (jądro

komórkowe, cytoplazma)

• „złoty standard”, najwyższa czułość i

specyficzność

• wynik negatywny = wyklucza obecność

wszystkich typów p-ciał

Biochip

2. ELISA

- wykrywamy składniki dopełniacza, stężenie p-ciał
- wysoka czułość i specyficzność
- zawiera wysokooczyszczone biochemicznie antygeny
- ocena ilościowa i półilościowa
- szybki i łatwy do wykonania

Reakcja
Zmiana koloru

Brak reakcji

a. EUROASSAY

- mikroblot, płytka z

membraną, na którą

naniesiono antygeny w

postaci linii
-ocena wzrokowa
- badanie jakościowe w

surowicy krwi
-- wykrywamy p-ciała ANA

b. EUROLINE

- plastikowe paseczki z
membranami, które pokryto
poszczególnymi antygenami

-ocena wzrokowa lub za pomocą
programu komputerowego

-- badanie jakościowe w surowicy
krwi

-- wykrywamy p-ciała ANA

3. Metody w oparciu o

dot-blot

5. Western blot - dot
blot

- pasek zawiera elektroforetycznie rozdzielony ekstrakt komórek Hep-
2, kompletne spektrum antygenów

- można badać antygeny niedostępne z technice ELISA (Ku, Mi-2, PI-
7, PI-12)

-- metoda jakościowa w surowicy krwi

6.

Immunodyfuzja

- metoda pomocnicza przy wykrywaniu

przeciwciał precypitujących,
skierowanych przeciw grupie
rozpuszczalnych antygenów jądrowych
(ENA - extractable nuclear
antigen).

Należą do nich nRNP, Sm, Ro, La, Scl-70.

Źródłem antygenów w tej metodzie jest

specjalnie przygotowany wyciąg grasicy
cielęcej lub innej tkanki bogatej w
materiał jądrowy.

Metoda odznacza się wysoką swoistością, a

jej dużą zaletą jest użycie natywnych,
niezdenaturowanych antygenów.

Immunodyfuzja- wykrywanie

ENA

Zgodność
antygenów

Częściowa
zgodność
antygenów

Brak zgodności

7. Inne metody

- koagulometryczne – do oznaczania

antykoagulantu toczniowego

- nefelometryczne – do oznaczania

czynnika reumatoidalnego

- chemiluminescencja – używane w

automatach immunodiagnostycznych

Diagnostyka chorób

narządowo nieswoistych

• Oznaczanie przeciwciał

przeciwjądrowych

• Oznaczanie przeciwciał przeciw

cytoplazmie neutrofilów

• Biopsja

PRZECIWCIAŁA

PRZECIWJĄDROWE

(ANA)

Przeciwciała przeciwjądrowe (

ANA - Anti

Nuclear Antibodies)

– to heterogenna grupa przeciwciał skierowanych

przeciw rożnym antygenom zarówno jądrowym, jak i

cytoplazmatycznym.

Przeciwciała wykrywane w

chorobach tkanki łącznej

Podstawowe przeciwciała

przeciwjądrowe:

dsDNA

ciężkie postać tocznia trzewnego (SLE)

Histonowe

RZS, oraz SLE indukowanym lekami,

U1-nRNP

mieszana choroba tkanki łącznej (MCTD) oraz
łagodny SLE

Ro (SS-A)/La(SS-B)

różne postacie tocznia, zespół Sjogrena, twardzina
układowa

Sm

ciężka postać tocznia, zespół Sjogrena, twardzina
układowa

Scl-70

twardzina układowa

ACA (przeciwciała
antycentromerowe)

łagodna postać twardziny, zespół CREST

Jo-1

zapalenie wielomięśniowe (polymyosistis)

U3-nRNP (fibrylarynowe)

twardzina układowa

RNA-polimeraza I

twardzina układowa

PCNA (cyklinowe)

toczeń układowy trzewny

Ku

toczeń układowy, twardzina, zespół nakładania

Mi-1 i Mi-2

zapalenie skórno-mięśniowe (dermatomyosistis)

antyrybosomalne

toczeń trzewny z zaburzeniami psychicznymi

ANA - METODY

WYKRYWANIA

Immunofluorescencja pośrednia (IIF)

(kom. Hep-2010, Hep-2000,Hep-2, skrawki wątroby szczura lub

małpy)

Określamy miano p-ciał i ew. typ świecenia

Westrenblot

(określamy rodzaj p-ciał)

Testy

immunoenzymatyczne

(ELISA)

(określamy stężenie p-ciała oraz

jego rodzaj)

+

+

PRZECIWCIAŁA PRZECIW

CYTOPLAZMIE NEUTROFILÓW

(ANCA)

cANCA

pANCA

Przeciwciała wykrywane w

zapaleniach naczyń

świecenie

cytoplazmatyczne

świecenie

perinuklearne

Schorzenia przebiegające z

pANCA

• zapalenia naczyń: zespół Churga

Straussa, mikroskopowe zapalenie
naczyń,

• kolagenozy: zespół Sjorgena, syndrom

Felty

• przewlekłe zapalne schorzenia jelit:

choroba Crohna

• choroby wątroby
• choroby nerek: kłębuszkowe zapalenie

nerek

• ziarniniak Wegenera 80-90%
• mikroskopowe zapalenie naczyń

10-15%

Schorzenia przebiegające z

cANCA

Przeciw proteinazie 3

80-90% pacjentów z
ziarniniakiem Wegenera
ale też:
mikroskopowe zapalenie
naczyń-40%
Z Churga Strausa 10%

Przeciw
metyloproteinazie

w zespole Churga Straussa
mikroskopowe zapalenie naczyń
kłębuszkowe zapelenia nerek
reakcje autoimmunologiczne
polekowe

c-ANCA

p-ANCA

Diagnostyka

chorób narządowo
swoistych

• Oznaczanie przeciwciał swoistych
• Oznaczanie przeciwciał

przeciwjądrowych

• Oznaczanie przeciwciał przeciw

cytoplazmie neutrofilów

• Biopsja

-

przeciwciała przeciw mitochondrialne

(AMA)

- przeciwciała przeciwko kanalikom
żółciowym

- przeciwciała przeciwko mięśniom
gładkim (ASMA)

Wykrywane w pierwotnej i przewlekłej żółciowej

marskości wątroby (AMA -90-95%, ANA i SMA (20-30%))

oraz w przewlekłym stwardniającym zapaleniu dróg

żółciowych (p-ANCA 30-80% , też ANA i SMA).

• p-ciała przeciwko plemnikom w surowicy
• p-ciała przeciwplemnikowe w nasieniu
• p-ciała przeciw antygenom jajnika
• p-ciała przeciw komórkom Leydiga jąder
• p-ciała przeciw antygenom łożyska

Przeciwciała związane z

autoimmunologicznymi przyczynami
niepłodności.

• p-ciała przeciw receptorom acetylocholiny

(anty-AChR)

• p-ciała przeciw mięśniom poprzecznie

prążkowanym (ASMA)

Przeciwciała związane z diagnostyką miastenii.

REUMATOIDALNE

ZAPALENIE STAWÓW

(RZS)

Metody oznaczania:
1. Metody półilościowe:
a) odczyn Waalera-Rosego- hemaglutynacja
b) odczyn lateksowy- aglutynacja – wykrywamy czynnik

reumatoidalny (RF) w klasie IgG, IgM, IgA w surowicy

krwi
test wysokoczuły, ale mało swoisty

2. Metody ilościowe
a) nefelometria
b) ELISA:
- można oznaczać RF w różnych klasach
- p-ciała przeciwko białku zawierającej cykliczną cytrulinę

(anty-CCP)

test wysokoczuły, wysokoswoisty, nie koreluje z aktywnością

choroby

- p-ciała skierowane przeciwko cytrulinowanym komórkom

wimentyny w łuszczce reumatoidalnej (anty-Sa)
koreluje z aktywnością choroby, nowy marker prognostyczny

2. p-ciała dla kolagenu typu II w surowicy krwi

CZYNNIK REUMATOIDALNY (RF)

 

Termin Czynnik Reumatoidalny (RF) powstał dzięki obserwacjom

Waaler’a i Rose’go, którzy odnotowali. że surowica dużego odsetka

pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów aglutynuje

erytrocyty owcze uczulone specyficznym przeciwciałem króliczym.

Obecnie

czynnik

reumatoidalny

jest

to

grupa

blisko

spokrewnionych

specyficznych

przeciwciał

skierowanych

przeciwko determinantom antygenowym fragmentów Fc ludzkich

immunoglobulin G.

Czynnik ten może należeć do klasy przeciwciał IgM (85%), IgG, IgA.

W błonie maziowej stawów pod wpływem nieznanego czynnika

powstają nacieki z komórek limfatycznych – tzw. ziarnina

reumatoidalna. W ziarninie wytwarzane są przeciwciała przeciwko

immunoglobulinie

G

(IgG),

noszące

nazwę

czynnika

reumatoidalnego (ang. rheumatoid factor – RF). Kompleksy

czynnika reumatoidalnego z IgG mogą być w stawie fagocytowane,

co przyczynia się do rozwoju choroby, której patogeneza jest

bardzo złożona. Uczestniczy w niej wiele komórek i substancji

humoralnych, m.in. cytokin, prostaglandyn, enzymów.

Na

podstawie

obecności

lub

nieobecności

czynnika

reumatoidalnego w surowicy wyodrębnia się postać

serologicznie dodatnią i serologicznie

ujemną. 

Czynnik reumatoidalny

Można go oznaczać w:

Można go oznaczać w:
•

surowicy, płynie stawowym,

surowicy, płynie stawowym,

•

płynie z jamy osierdzia, opłucnej

płynie z jamy osierdzia, opłucnej

OZNACZANIE RF –test

lateksowy

Zasada metody:

Odczynnik lateksowy jest zawiesiną jednakowej

wielkości cząsteczek polistyrenowego lateksu

opłaszczonych ludzką gammmaglobuliną.
Cząsteczki lateksu pozwalają na wizualne

zaobserwowanie reakcji antygen-przeciwciało.

jeżeli w surowicy występuje czynnik

reumatoidalny (RF) i zachodzi reakcja antygen-

przeciwciało, to zawiesina lateksu zmienia swój

wygląd i pojawia się ewidentna aglutynacja.

Zmiana ta jest spowodowana tym, że obecny w

surowicy RF reaguje z IgG opłaszczającą

cząsteczki lateksu, zapoczątkowując tworzenie

między nimi połączeń.