Badania molekularne analityka

background image

BADANIA

MOLEKULARNE

W

HEMATOONKOLOGI

I

KATEDRA I KLINIKA HEMATOONKOLOGII

I TRANSPLANTACJI SZPIKU

UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE

background image

Tabela 1

Metody genetyczne w diagnostyce i monitorowaniu chorób rozrostowych układu

krwiotwórczego

Metoda

Materiał
diagnostyc
zny

Stadium
analizowan
ych
komórek

Liczba
analizowan
ych
komórek

Czuło
ść

Specyficz
ność

Możliwoś
ć oceny
ilościowe
j

Ukierunkowani
e – zakres
informacji
genetycznej

Cytogenet
yka
klasyczna
(GTG;
GTW)

szpik

metafaza

do 100

+

++

+ w
wąskim
zakresie

szeroki – metoda
nieukierunkowan
a

FISH

szpik

metafaza

interfaza

do 1000

++

+++

+

wąski – metoda
ukierunkowana

RT-PCR

szpik

bez

znaczenia

> 1 milion

+++

+++

wąski – metoda
ukierunkowana

RQ-PCR

krew

bez

znaczenia

> 1 milion

+++

+++

+

wąski – metoda
ukierunkowana

background image

Cytogenetyka klasyczna przedstawia całościowy obraz zmian
chromosomowych w komórce. Umożliwia analizę od kilkunastu do stu komórek
metafazowych, przy czym miarodajna jest ocena co najmniej 20-25 metafaz.
Minusem metody jest konieczność prowadzenia hodowli komórkowej, która nie
zawsze jest skuteczna. Cytogenetyka klasyczna stanowi podstawową,
referencyjną metodę badań genetycznych. Znaczenie diagnostyczne i rokownicze
mają tylko aberracje klonalne, tj. monosomie chromosomów obecne w co
najmniej 3 komórkach oraz trisomie lub jednolite zmiany strukturalne
występujące w co najmniej 2 komórkach.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest metodą cytogenetyki
molekularnej, która uzupełnia cytogenetykę klasyczną. W przypadku zmian o
charakterze mikroaberracji, wielkości 1-10 Mpz, FISH funkcjonuje jako
samodzielna metoda referencyjna. Analiza FISH dotyczy zarówno komórek w
stadium metafazy, jak i interfazy i jest badaniem ukierunkowanym. W
hematoonkologii FISH służy analizie fuzji i innych rearanżacji genowych oraz
wyjaśnianiu charakteru złożonych aberracji chromosomowych.
RT-PCR (reverse-transcriptase PCR) to czuła, ukierunkowana metoda oceny
ekspresji genów na podstawie analizy ich transkryptów (mRNA). W
hematoonkologii służy głównie do oceny fuzji i innych rearanżacji lub mutacji
genowych. RT-PCR pozwala na uzyskanie dodatnich wyników już przy obecności
jednej komórki nieprawidłowej na milion prawidłowych, stąd jej rola w ocenie
choroby resztkowej (MRD; minimal residual disease).
RQ-PCR (reverse-transcriptase quantitative PCR) to ilościowa metoda RT-PCR,
która pozwala na ocenę zmian w ilości wybranego transkryptu genowego w
przebiegu choroby, co odpowiada zmianom liczby komórek nowotworowych. RQ-
PCR to czuła i miarodajna metoda oceny skuteczności leczenia.

background image

Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from

chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal

residual disease.

Report of the BIOMED-1 concerted action: Investigation of minimal

residual disease in acute leukemia.

van Dongen JJM et el. Leukemia (1999) 13, 1901-28

Standardowy protokół RT-PCR

1. Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT)

1 µg RNA (lub 0,1 µg mRNA) w 9,5 µg H

2

O

inkubacja w 70°C przez 10 min

inkubacja w lodzie i dodanie pozostałych
składników
do objętości całkowitej 20 µl:

bufor RT: 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl,

pH 8,3

MgCl

2

: 5 mM

DTT: 10 mM
heksamery: 5 µM
RNAsin: 20 U
enzym RT: 200 U/µl
dNTP: 1 mM

temperatura i czas inkubacji:

temperatura pokojowa przez 10 min
42°C przez 45 min
99°C przez 3 min
4°C do zakończenia etapu RT

2. PCR lub pierwsze runda nested PCR

objętość całkowita 50 µl

2-3 µl cDNA (i.e. 10-15% mieszaniny RT)

startery: stężenie końcowe 400 nM

dNTP: stężenie końcowe 200 µM

bufor PCR: 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH
8,3

MgCl

2

: 2,5 mM

enzym Taq: 1 U/50 µl objętości

3. Temperatura i czas trwania etapów

PCR

denaturacja wstępna: 95°C przez 30 s

etapy PCR:

94°C przez 30 s (denaturacja)
65°C przez 60 s (przyłączanie

starterów)

72°C przez 60 s (synteza DNA)

liczba cykli: 35

4. Druga runda nested PCR

1 µl mieszaniny z pierwszej rundy PCR

taka sama objętość, odczynniki i warunki
reakcji jak w pierwszej rundzie PCR, z
użyciem starterów wewnętrznych

background image

Przewlekłe choroby mieloproliferacyjne –

MPD

HSC

Mieloidalna
komórka
prekursorowa

Komórka

tuczna
Erytrocyt

y
Trombocyt

y
Eozynofil

e

Neutrofile

Monocyty

Mastocytoza

uogólniona (SM)

Czerwienica

prawdziwa (PV)

Nadpłytkowość

samoistna (ET)

Przewlekła

białaczka

eozynofilowa (CEL)

Przewlekła

białaczka szpikowa

(CML)

Przewlekła białaczka

mielomonocytowa

(CMML)

Samoistne zwłóknienie

szpiku (PMF)

MPD

Mutacja

KITD816V

FIP1L1-

PDGFRA

JAK2V617F

JAK2 Exon 12

JAK2V617F

MPLW515L/K

FIP1L1-
PDGFRA
BCR-ABL

JAK2V617F

MPLW515L/K

TEL-PDGFRB

BCR-PDGFRA

TEL-JAK2

Klasyfikacja i patogeneza MPD. W identyfikacji alleli, które przyczyniają się do

rozwoju danej choroby, wykorzystano różnorodne metody i stwierdzono, że
we wszystkich przypadkach allele te powodują zmianę aktywności kinazy
tyrozynowej (aktywacja konstytutywna).

background image

Kinaza tyrozynowa

Pierwszym zidentyfikowanym allelem, charakterystycznym dla

MPD, jest

onkogen fuzyjny BCR-ABL

, który powstaje w wyniku

wzajemnej translokacji pomiędzy chromosomami 9 i 22, a jego
pojawienie się prowadzi do rozwoju

CML

.

Dalsze badania pozwoliły na identyfikację kolejnych genów fuzyjnych, w

tym

PDGFRB

(ang. platelet derived growth factor receptor-β),

charakterystycznego m.in. dla

CMML

. Dzięki obserwacji, że w

komórkach tucznych ma miejsce zwiększona ekspresja KIT,
zidentyfikowano alell

KITD816V

w

SM

. Z kolei na podstawie odpowiedzi

chorych na

CEL

i

SM

na leczenie imatinibem zidentyfikowano delecję,

która prowadzi do powstania genu fuzyjnego

FIP1L1-PDGFRA

.

Najnowsze badania pozwoliły stwierdzić, że u podstaw rozwoju PV,

ET

i PMF leży mutacja w obrębie genu kodującego Janus kinazę

2 (

JAK2

).

Wysoka aktywność kinazy tyrozynowej

powoduje utratę kontroli

nad podziałem komórki i prowadzi do rozwoju
nowotworu/choroby.

background image

Przewlekła białaczka szpikowa – CML

W zależności od punktu złamania w obrębie genu

BCR

, gen

fuzyjny

BCR

/

ABL

może mieć różną długość

chromosom 9

BC

R

BCR

/

ABL

ABL

background image

Przewlekła białaczka szpikowa – CML

Krótsze białko fuzyjne BCR/ABL jest związane z bardziej agresywnym

przebiegiem białaczki. Więcej białka BCR w białku fuzyjnym

BCR/ABL oznacza mniej agresywny przebieg choroby.

BCR

/

AB

L

p19

0

p21

0

p23

0

background image

BCR (22q11)

ABL (9q34)

1 aternative 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11-15 16 17 18 19 20 21-23
exons b2 b3 c3 c4

← cen M- bcr µ-bcr
~2.9 kb

→ tel

1b 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11
a2 a3

← cen breakpoint
region
~200 kb

→ tel

a

b

type

b3-a2


b2-a2


b3-a3


b2-a3

11

12

13

14

11

11

11

12

12

12

13

13

13

14

2

2

frequency

~55%

~40%

rare

rare

3

3

3

3

4

4

4

4

(a) Schematic diagram of the exon/intron structure of the BCR and ABL genes, involved in t(9;22)
(q34;q11) with focus on the major
breakpoint cluster region (M-bcr). The centromere (cen) and telomere (tel) orientation, exon numbering,
and relevant breakpoint
regions are indicated, including the micro breakpoint cluster region (µ-bcr). (b) Schematic diagram of the
BCR-ABL p210 transcripts.
The number under the fusion gene transcripts refer to the first (5’) nucleotide of the involved exon,
except when the last (3’) nucleotide of the upstream gene is indicated. The b3-a2 and b2-a2 transcripts
are found most frequently, but sporadic cases with b3-a3 and b2-a3 transcripts have been reported.

background image

Przewlekła białaczka szpikowa – CML

background image

Przewlekła białaczka szpikowa – CML

RQ-PCR

PCR w czasie rzeczywistym

(ang. real time PCR)

przebiega wg następujących etapów:

• izolacja RNA,
• reakcja odwrotnej transkrypcji (RT),
• amplifikacja cDNA (PCR),
• interpretacja wyniku.

GAPDH

BCR/ABL

background image
background image
background image

Sekwencjonowanie DNA

background image

Przewlekła białaczka szpikowa – CML

Mutacje kinazy tyrozynowej BCR/ABL

upośledzają efekt inhibitorowy imatynibu
i innych kinaz tyrozynowych.

Wrażliwość poszczególnych form

mutacyjnych na określone inhibitory
cechuje się wysoką zmiennością, ale
inhibitory drugiej linii, tj. dasatynib,
nilotynib, bosutynib, są z reguły bardziej
skuteczne niż imatynib.

Wykrycie mutacji T315I kwalifikuje

pacjenta do alotransplantacji szpiku albo
włączenia do badań klinicznych nad
inhibitorami T315I.

background image

Samoistna nadpłytkowość – ET

Analizę nabytej, somatycznej mutacji punktowej (Val617Phe) w

genie JAK2 (substytucja G → T) można prowadzić przy
zastosowaniu jednej z poniższych metod:

sekwencjonowanie genomowego DNA;

ASO-PCR

(ang. allele-specific oligonucleotide PCR)

;

PCR-RFLP

(ang. PCR followed by restriction fragment length

polymorphism)

;

RQ-PCR

(ang. quantitative real-time PCR)

;

ARMS-PCR / elektroforeza kapilarna

(ang. amplification

refractory mutation system PCR)

;

dHPLC

(ang. denaturing high-performance liquid chromatography)

.

background image

Samoistna nadpłytkowość – ET

JAK2F-C AAC TAT TTA TGG ACA ACA GTC AAA CAA C
JAK2R-C GAA TAG TCC TAC AGT GTT TTC AGT TTC A
JAK2F-V GCA TTT GGT TTT AAA TTA TGG AGT ATA TG
JAK2R-F GTT TTA CTT ACT CTC GTC TCC ACA AAA

ASO-PCR

PCR-RFLP

JAK2-R CTG AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT
JAK2-F1 AGC ATT TGG TTT TAA ATT ATG GAG TAT
JAK2-F2 ATC TAT AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA

enzym restrykcyjny: BsaXI

background image

Mutacja Val617Phe w genie JAK2

Obecność nabytej mutacji V617F w genie JAK2 stwierdza się u
prawie wszystkich chorych na czerwienicę prawdziwą (PV; 80%), a
także u istotnego odsetka pacjentów z nadpłytkowością samoistną
(ET; 40%) i samoistnym zwłóknieniem szpiku (PMF; 40%).

JAK2V617F jest kinazą tyrozynową o aktywności konstytutywnej,
która aktywuje przekaźniki sygnału komórkowego i aktywator
transkrypcji (Stat), aktywowaną mitogenem kinazę białkową
(MAPK) oraz kinazę fosfatydyloinozytolu 3 (PI3K), co prowadzi do
transformacji hematopoetycznych komórek prekursorowych.

Identyfikacja JAK2V617F pozwoliła na opracowanie swoistych
inhibitorów JAK2, które znajdują zastosowanie w leczeniu PV, ET i
PMF.

Źródło: Levine R.L. et al. 2007 Nature Rev Cancer

background image

Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from

chromosome aberrations in acute leukemia for detection of

minimal residual disease.

Report of the BIOMED-1 concerted action:

Investigation of minimal residual disease in acute leukemia.

van Dongen JJM et

el. Leukemia (1999) 13, 1901-28

Table 4 RT-PCR analysis of fusion gene transcripts in acute leukemia

Chromosome

aberration

RT-PCR

target

Responsible

laboratory

Collaborating

laboratory

t(1;19)

(q23;p13)

E2A-PBX1

A Rambaldi et
al
.

A Biondi et al.

t(4;11)

(q21;q23)

MLL-AF4

F Griesinger et
al
.

A Biondi et al. and EA
Macintyre et al.

t(9;21)

(q22;q22)

AML1-ETO

EA Macintyre et
al
.

F Griesinger et al. and JA
Gabert et al.

t(9;22)

(q34;q11)

BCR-ABL

p190

G Saglio et al.

A Rambaldi et al.

t(9;22)

(q34;q11)

BCR-ABL

p210

JA Gabert et al.

M Gonzales et al.

t(12;21)

(p13;q22)

TEL-AML1

JA Gabert et al.

G Saglio et al. and A Biondi et
al
.

t(15;17)

(q22;q21)

PML-RARA

A Biondi et al.

P Gameiro et al.

inv(16)

(p13;q22)

CBFB-

MYH11

EA Macintyre et
al
.

JA Gabert et al.

del(1)(p32;p32) SIL-TAL1

EA Macintyre et
al
.

JJM van Dongen et al.

background image

U około 40-45% chorych na AML nie wykrywa się żadnych zmian w kariotypie,

ale w przypadkach tych można stwierdzić występowanie zmian submikroskopowych.

Najistotniejsze są zmiany typu rearanżacji, mutacji i hiperekspresji w obrębie genów.

Gen

Locus

Typ zmiany

Częstość
nawrotów

Całkowity
czas przeżycia

Zmiany o rokowaniu niekorzystnym

WT1
MLL
FLT3
c-KIT
BCL2
TP53
MDR1
EVI1

11p13
11q23
13q12
4q11-q12
18q21
17p13
7q21.1
3q26

hiperekspresja
częściowa tandemowa
duplikacja PTD
wewnętrzna tandemowa
duplikacja ITD
mutacja
hiperekspresja
mutacja
hiperekspresja
hiperekspresja

wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka

bez znaczenia

wysoka
wysoka

krótki

bez znaczenia

krótki
krótki
krótki
krótki
krótki
krótki

Zmiany o rokowaniu korzystnym

NPM1

CEBPA

5q35

19q13.1

hiperekspresja

hiperekspresja
mutacja

niska przy braku

mutacji FLT3

niska

długi przy braku

mutacji FLT3

długi

Tabela 5

Nowe, molekularne markery o znaczeniu rokowniczym w ostrych białaczkach szpikowych

background image

BADANIA

MOLEKULARNE

W

HEMATOONKOLOGI

I

KATEDRA I KLINIKA HEMATOONKOLOGII

I TRANSPLANTACJI SZPIKU

UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE


Document Outline


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
WYKŁADY GENETYKA W.Badanie molekularne 10.10.09r....
badanie srodoperacyjne, Analityka Medyczna UMB, III, Patomorfologia, Wykłady
Badania molekularne serotypów wirusa pryszczycy
Badanie natężenia czynników szkodliwych na stanowisku pracy-hałas, ANALITYCZNE METODY INSTRUMENTALNE
Paski Analityczne do badania moczu, testy ogólno dostępne w aptece 1
Metody badania kwasów nukleinowych - lekcja IV, egzamin biologia molekularna i parazytologia
badania analit
cwiczenie-5-Badanie-ogolne-moczu-2, Nauka, Analityka
Epidemiologia analityczna(metoda porównawcza) doraźne badania epidemio ppt
Badania analityczne
Badanie ogólne kału, Studia - materiały, Analityka ogólna i techniki pobierania materiału
Badanie ogólne moczu, Analityka
Badania kliniczne, serologiczne, molekularne
Paski Analityczne do badania moczu, testy ogólno dostępne w aptece 1
1 podejście indukcyjne jest metodą badania analitycznego
3 ćwiczenia BADANIE asfaltów
BADANIEepipelne
BADANIA 3

więcej podobnych podstron