Pośrednia i bezpośrednia metoda genetycznej transformacji roślin
Genetyczna transformacja- wprowadzenie do komórki obcego materiału genetycznego (DNA), zwłaszcza niewielkiej jego porcji, obejmującej jeden do kilku genów. Zmodyfikowana w ten sposób komórka oraz - w przypadku organizmów wielokomórkowych - zregenerowany z niej organizm nosi nazwę transformanta. Gen wprowadzony na zasadzie transformacji do komórki-biorcy zwany jest ogólnie transgenem. Transformant i jego potomstwo dziedziczące transgen/transgeny nazywamy organizmami transgenicznymi albo (zgodnie z przyjętym obyczajem, choć nie całkiem zgodnie z logiką) organizmami genetycznie zmodyfikowanymi, czyli GMO. Otrzymywanie transformantów, czyli transformacja genetyczna jest istotą inżynierii genetycznej.
Zwykle terminów tych nie używa się do omawiania przeniesienia do komórki całego genomu innej komórki, albo jego dużych fragmentów (np. kilku chromosomów). Takie modyfikacje o znacznie większym zakresie są domeną inżynierii komórkowej, hodowli rekombinacyjnej i inżynierii chromosomowej. Podkreślmy jeszcze raz, że wszystkie powyższe techniki, a także parę innych (np. hodowla mutacyjna, tj. indukowana mutageneza), pozwalają na modyfikowanie genomów, ale przyjęło się nazywać organizmami genetycznie zmodyfikowanymi tylko te, które zostały otrzymane metodami inżynierii genetycznej (dużo rzadziej także te, które są efektem sztucznie wywołanego łączenia się (fuzjonowania) komórek czyli inżynierii komórkowej). Granica między inżynierią genetyczną, a inżynierią komórkową zaciera się stopniowo, w miarę jak uczymy się używać do transformacji coraz większych fragmentów DNA.
Różnice między inżynierią genetyczną, a innymi metodami modyfikowania genomów organizmów dotyczą metod i skutków. Ze względu na niewielki zakres modyfikacji, skutki transformacji genetycznej wydają się znacznie lepiej przewidywalne niż wszelkich innych modyfikacji genomów. Z drugiej strony, ze względu na fakt, że inżynieria genetyczna jest dziedziną bardzo młodą i człowiek ma w przeprowadzaniu transformacji genetycznej mniej doświadczenia niż w pozostałych metodach doskonalenia organizmów, transformacja genetyczna budzi szczególnie dużo społecznych obaw. Wątpliwości rodzą się też z faktu, że przy wykorzystaniu transformacji genetycznej można wprowadzić do organizmu-biorcy DNA dowolnego innego organizmu. Wydaje się więc, że ta technika obala istniejące od zawsze bariery genetyczne pomiędzy różnymi gatunkami, a nawet królestwami. Z drugiej strony, dane biologii molekularnej wskazują, że takie egzotyczne wędrówki genów zdarzają się jednak w naturze dość powszechnie. Uczestniczą w nich nieustannie organizmy, które po niewielkich modyfikacjach człowiek zastosował jako wektory do transformacji.
Metody transformacji dzieli się zwykle na:
wektorowe pośrednie: Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wykorzystuje się jakiś organizm pośredniczący, przenoszący transgen do komórki-biorcy
Niektóre bakterie glebowe z rodzaju Rhizobium wykazują zdolność do przenoszenia swojego DNA do komórek roślin. To rewolucyjne odkrycie stało się podstawą do opracowania metody transformowania komórek roślinnych za pomocą plazmidów występujących w komórkach bakterii Agrobacterium
Plazmid Ti z Agrobacterium tumefaciens powoduje powstawanie tumorowatych narośli, natomiast plazmid Ri z Agrobacterium rhizogenes powoduje wytwarzanie dużej ilości drobnych korzeni. Na plazmidach Ti i Ri znajdują się geny powodujące infekcję komórek roślinnych oraz zmianę ich metabolizmu, co powoduje zmiany fenotypowe.
Najważniejszy fragment plazmidu stanowi odcinek T - DNA (długość 23 tysiące par zasad), który po zakażaniu rośliny ulega integracji z genomem rośliny.
-Zawiera on geny syntezy opin - związków chemicznych będących źródłem węgla i azotu dla bakterii żyjących w przestrzeniach międzykomórkowych rośliny, a także geny odpowiedzialne za biosyntezę regulatorów wzrostu roślin: cytokinin i auksyn. Stymulują one podziały stransformowanych komórek, co umożliwia powstanie tumoru.
-Na końcach T - DNA znajdują sie krótkie sekwencje ( o długości 24 - 25 par zasad), które są konieczne do integracji fragmentu T do genomu gospodarza.
-W proces przeniesienia T - DNA zaangażowane są też inne geny zlokalizowane zarówno na plazmidzie Ti , jak i na chromosomie bakteryjnym, które są odpowiedzialne za katabolizm opin, koniugacyjny transfer plazmidu, jego replikację, wirulencję bakterii i zasięg zainfekowanych roślin.
Proces infekowania roślin przez Agrobacterium'Ti po usunięciu onkogenów z fragmentu T - DNA można wykorzystać jako wektor do wprowadzania transgenów do roślin. Do wprowadzenia T - DNA niezbędne są sekwencje graniczne, posiadające miejsca rozpoznawane przez enzymy wycinające ten fragment. Pomiędzy nimi można umieścić przygotowany konstrukt. W ten sposób uzyskuje się szczepy bakterii (wyprowadzone z dzikich superwirulentnych szczepów), zdolne do przeniesienia danego DNA do rośliny i zintegrowania go z genomem. Obecnie do transformacji roślin używa się wektorów pochodnych od Ti .
Dodatkowo można wspomagać transformację poprzez ranienie tkanki roślinnej bądź dodanie do pożywki octanu syryngonu, aktywującego geny wirulencji bakterii. Niestety kontakt z bakteriami i antybiotykami działa ujemnie na zdolności regeneracyjne niektórych gatunków roślin. Metoda wektorowa przy użyciu Agrobacterium jest najczęściej stosowaną, najstarszą metodą transformacji komórek roślinnych.
Przygotowana konstrukcja genowa, po namnożeniu stransformowanych komórek:
1.Inokulacja -przygotowane komórki bakteryjne w pożywce. Pocięte fragmenty liścia zalewamy tymi bakteriami. Po kilku minutach inkubacji:
2.Odpłukanie bakterii. Te co weszły na teren komórki roślinnej to te genomy zostają
3.Umieszczenie eksplantatów na pożywce stymulowanej regeneracją. Dobrze gdyby były czynniki selekcyjne np. antybiotyki, pożywka wzbogacona fitohormonami
4.Gdy wykształcone korzenie, pędy zwiększamy czynnik selekcyjny by przeżyły tylko te, które zostały stransformowane
5.Zregenerowane rośliny trzeba sprawdzić
Efektywność:
-liczba pędów zregenerowanych w warunkach selekcyjnych;
Metoda „floral dip” -metoda wektorowa;
-unika kultur in vitro;
-wykorzystuje się komórki, które w sposób naturalny są przyzwyczajone do dzielenia się. Są to komórki jajowe w woreczku zalążkowym;
-komórki generatywne muszą znajdować się w odpowiednim momencie;
-też wykorzystywany wektor, ale pomija kultury in vitro;
-normalnie wysiewany na pożywce z czynnikiem selekcyjnym;
Metody wektorowe
Zalety:
-ochrona wprowadzanego transgenu (chroniony przez białka, które sam produkuje);
-duża wydajność ( kilka % do 10%);
-wysoka częstość integracji fragmentu T-DNA;
Wady:
-mało skuteczna dla roślin 1iściennych, bo po zranieniu nie wytwarzają związków fenolowych, niezbędnych do aktywacji genu vir. W ostatnich latach udało się jednak przy użyciu tej metody dokonać transformacji ryżu i lilii.
bezwektorowe (transformacji bezpośredniej protoplastów) stosuje się różne sposoby ułatwienia transgenom pokonywania bariery błonowej komórki-biorcy:
środki chemiczne zwiększające przepuszczalność błony, stosowane w roztworze wraz z DNA (glikol polietylenowy do roślinnych izolowanych protoplastów, chlorek rubidu, chlorek wapnia do chemicznej transformacji bakterii)
DNA zamknięte w liposomach -lipidowych pęcherzykach (metoda lipofekcji; głównie do transformowania komórek zwierzęcych
do roztworu DNA dodawana zawiesina ostrokrawędzistych, mikroskopijnych kryształków węglika krzemu; energiczne wytrząsanie w takiej zawiesinie komórek lub protoplastów roślinnych ułatwia przenikanie DNA do ich wnętrza (stosowana sporadycznie, opracowana niedawno)
przenikanie DNA wspomagane impulsem elektrycznym (elektroporacja - do transformowania komórek bakterii, zwierząt, lub protoplastów roślin i grzybów)
-wysokie napięcie (2-10 kV/cm - 5-200 μs) i małe stężenie soli;
-małe napięcie (0,2-0,8 kV/cm - 1-50 ms) i duże stężenie soli;
-zastosowanie PEG-u;
Zalety:
-możliwość uzyskania dużej liczby protoplastów;
-otrzymuje się klony;
-mniejsza chimeralność w regenerowanych roślinach);
Wady:
-złożone procedury i problemy z regeneracją roślin;
wstrzeliwanie cząsteczek DNA przy pomocy armatki genowej (metoda biolistyczna - do transformowania komórek zwierząt, grzybów i roślin (zarówno dwu- jak i jednoliściennych; najczęściej wykorzystywana metoda bezpośredniej transformacji roślin)
wstrzykiwanie DNA do komórki biorcy, albo nawet bezpośrednio do jej jądra (mikroiniekcja - głównie do transformowania zwierząt
wstrzykiwanie DNA w okolice komórek o dużej aktywności podziałowej i stosunkowo przepuszczalnych ścianach (głównie do pąków; metoda makroiniekcji - oczywiście do trasformowania roślin
Metodyka transformacji:
-przygotowanie mikronośników;
-przygotowanie tkanki roślinnej;
-strzał (prędkość pocisku kilkaset m/s);
-selekcja i regeneracja;
Jeden strzał to:
-500 μg pocisków;
-1 μg DNA;
-jeden pocisk: 0,01-0,1 pg;
Efektywność mikrowstrzeliwania zależy od:
-rodzaju aparatu;
-ciśnienia gazu napędzającego mikronośniki;
-wielkości i rodzaju mikronośników;
-dystansu jaki muszą pokonać;
-podciśnienia w komorze podczas strzału;
-formy plazmidu;
-rodzaju transformowanej tkanki;
Mikrowstrzeliwanie:
Zalety:
-można transformować praktycznie wszystkie tkanki;
Wady:
-wymaga wielu udoskonaleń technicznych (rodzaj nośnika, sposób opłaszczania, parametry strzału);
-wysokie koszty;
elektrotransformacja - w odróżnieniu od elektroporacji, stosowanie nie krótkotrwałego impulsu wysokiego napięcia, ale prądu stałego o niewielkim napięciu (np. 50V), działającego przez kilkanaście minut (w tej metodzie DNA wprowadzane jest więc do komórek na zasadzie elektroforezy; stosowana sporadycznie do transformowania roślin).
Regułą jest, że nawet jeśli zabiegowi transformacji poddaje się cały organizm, organ, czy inną dużą grupę komórek, transgen dociera tylko do niektórych z nich (nie dotyczy to jedynie mikroiniekcji). Dlatego po przeniesieniu transgenu, zwykle połączonego z różnymi sekwencjami pomocniczymi i tworzącego z nimi tzw. konstrukt trzeba hodować modyfikowany obiekt w obecności czynników selekcyjnych, tak by wyszukać nieliczne zwykle transformanty.
Transformacja bezpośrednia (bezwektorowa) komórek eukariotycznych bywa czasem nazywana transfekcją.
Metody tradycyjne - liczba pędów zregenerowanych w warunkach selekcyjnych po potwierdzonej integracji transgenu (metodami molekularnymi) w stosunku do liczby inokulowanych eksplantatów, z których zregenerowano co najmniej jedną roślinę (średnio kilka - kilkanaście roślin ze 100 eksplantatów);
Transformacja protoplastów - liczba kolonii komórkowych rozwijających się na podłożach selekcyjnych z potwierdzoną integracją transgenu w stosunku do wyjściowej liczby protoplastów (kilka - kilkadziesiąt koloni transgenicznych z 106 protoplastów);
Wykorzystanie roślin transgenicznych.
-Odporność roślin na herbicydy
-Otrzymanie roślin odpornych na choroby (wirusowe, grzybowe, bakteryjne) i szkodniki
-Zwiększenie produkcji ziaren przez zboża.
-Tolerancja roślin na stres abiotyczny.
-Podniesienie zawartości odżywczych i smakowych roślin.
-Polepszenie innych właściwości użytkowych roślin.
-Powiększenie spektrum barw roślin ozdobnych.
-Bioreaktory.- do produkcji antybiotyków, enzymów czy hormonów (np. tytoń produkujący somatotropinę).
Zagrożenia.
Rośliny transgeniczne wywołują wiele obaw o bezpieczeństwo ludzi i środowiska. Raz wprowadzone do środowiska są praktycznie niemożliwe do usunięcia z niego, przez co są określane przez GREENPEACE jako "genetic pollution" - "genetyczne zanieczyszczenie". Istnieją obawy, że transgeniczne rośliny będą krzyżowały się ze swoimi dzikimi krewniakami, co spowoduje spadek bioróżnorodności.
Problemem natury ekonomicznej jest też fakt, iż w przypadku upraw roślin transgenicznych, nie można zachować nasion do wysiania w następnym roku, tylko trzeba co roku sprowadzać je z firm nasiennych.
Rośliny transgeniczne budzą także inne obawy, że transgeny mogą stać się źródłem alergenów i toksyn. Należy jednak zauważyć, że ryzyko wystąpienia alergii jest niewielkie, ze względu na fakt, iż rośliny transgeniczne są bardzo dokładnie badane pod tym kątem zanim trafią na rynek.
Obawy budzi także użycie genów oporności na antybiotyki jako markerów selekcyjnych. Rozprzestrzenienie tych genów w organizmach roślinnych może spowodować oporność na antybiotyki wśród patogenów, np. na nadal stosowaną w leczeniu wielu chorób człowieka kanamycynę.
Pierwsze rośliny transgeniczne uzyskano w 1983 roku - były to tytoń i petunia. Obecnie transformacji genetycznej poddano wiele gatunków roślin użytkowych: zbóż (pszenica, jęczmień, ryż), roślin oleistych (rzepak, słonecznik), motylkowych (soja, groch, lucerna), warzyw (ziemniak, brokuł, kalafior, kapusta, marchew, ogórek, papryka, pomidor, sałata, seler, szparagi, rzodkiewka), owoców (banan, grusza, jabłoń, kiwi, malina, morela, śliwa, truskawka, winorośl) oraz innych o dużym znaczeniu gospodarczym, takich jak bawełna, len, burak cukrowy. Transgeny wprowadzono także do roślin ozdobnych (chryzantema, goździk, lilia, petunia, róża, tulipan) oraz roślin modelowych ( Arabidopsis , Tradescantia ) celem prowadzenia badań naukowych nad mechanizmami tego procesu.
Strona | 1