Hodowla chromosomów z limfocytów krwi obwodowej

Przygotowanie płynu hodowlanego

Do sterylnej butelki nalewamy 100ml:

• Płynu Eagle’a

• Fitohemaglutyniny M – 1%

• Penicyliny krystalicznej – 100 IU/ml

• Streptomycyny – 100 μg/ml

1. Zakładanie makrohodowli

Hodowlę komórkową zakładamy w sterylnym jednorazowym naczyniu hodowlanym NUNC o pojemności 25ml w warunkach jałowych (komora laminarna)

1. do sterylnej probówki z 1 ml heparyny (50 IU/ 1ml krwi) pobieramy 10 ml krwi żylnej. Odstawiamy do sedymentacji na około 2h w temperaturze pokojowej

2. osad białych krwinek wraz z 1 ml osocza przenosimy do naczynia hodowlanego z 8ml płynu hodowlanego oraz 1ml surowicy płodowej cielęcej. Naczynie należy szczelnie zamknąć, krańcowa objętość hodowli wynosi 10ml

3. umieścić naczynie hodowlane w cieplarce o temperaturze 37°C na okres 48-72h, każdego dnia hodowlę mieszamy

4. na 2h przed zakończeniem hodowlę wyjmujemy z cieplarki, dodajemy colcemidu
   0,15 μg/ml i wstawiamy ponownie do cieplarki na 2h

1. Wykańczanie hodowli:

   1. zawartość hodowli przenosimy do wirówki – 7min, 800obr/min

   2. zlewamy płyn znad osadu, probówkę wstrząsamy, kroplami dodajemy 10ml 0,075M KCl (0,55%), na 17min w temperaturze pokojowej, wirujemy 7 min, 800obr/min

   3. zlewamy płyn znad osadu, do osadu dodajemy 10ml płynu Carnoy’a (mieszanina metanolu i kwasu octowego lodowego w stosunku 3:1). Probówkę umieszczamy na 10 min w lodówce. Wirujemy 3 razy po 7 min, 800obr/min

   4. po zlaniu płynu znad osadu osad nanosimy na oziębione szkiełka podstawowe

   5. po wysuszeniu barwimy preparat barwnikiem Giemsy

Mikrohodowla – zakładanie

Mikrohodowla jest stosowana powszechnie w rutynowej diagnostyce noworodków i małych dzieci.

• Odczynniki jak w markohodowli

• Przygotowanie płynu komórkowego – jak w markohodowli

• Zakładanie mikrohodowli:

  • Wysterylizowane buteleczki po penicylinie o pojemności 5ml lub w naczyniach plastykowych

  • Do 2ml płynu dodajemy 4 krople (0,3-0,5ml) pełnej krwi obwodowej (pobranej z pięty lub żyły ciemieniowej)

  • Hodowla 72h, z zachowaniem tych samych procedur co w makrohodowli

Hodowla chromosomów z komórek szpiku ludzkiego

Bioptat szpiku (1-2ml) należy umieścić natychmiast po pobraniu w jałowej probówce z ogrzanym do 37°C płynem hodowlanym (np. RPMI 1640) z dodatkiem 15% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotykami (penicylina, streptomycyna) w standardowych stężeniach. Dodatkowo należy dodać heparynę 250 IU/ml

Dwie drogi postępowania:

a) metoda uzyskiwania chromosomów bezpośrednio po pobraniu

Polega na inkubacji komórek szpiku przez 1-2h w pożywce z colcemidem (25μg/ml). Jest zalecanym postępowaniem w przypadkach ostrych białaczek szpikowych i limfatycznych

b)metoda krótkotrwałej hodowli

hodowlę komórek zakładamy w w/w płynie hodowlanym stosując rozcieńczenie komórek szpiku kostnego – milion/ml hodowli. Komórki hoduje się przez 24-48h w temperaturze 37°C, w atmosferze z 5% CO₂.

• Mitozy blokujemy colcemidem 5-10μg/ml na 40-60 min przed końcem hodowli

• Szok hipotoniczny – w celu odpowiedniego rozproszenia chromosomów w jądrze używamy 0,4% KCl lub mieszaniny 3g KCl, 4,8g HEPES, 0,2g EGTA w 1000ml wody o pH 7,4

Dalsze etapy utrwalania i wykańczania podobne jak w standardowych technikach cytogenetycznych.

W przypadkach białaczek, gdy komórki nowotworowe występują we krwi obwodowej stosuje się 24-48h niestymulowaną mitogenami hodowlę komórek pobranych drogą nakłucia żylnego.

Zasady barwienia takie same jak chromosomów z innych tkanek.

Hodowla chromosomów z tkanek pochodzących z guzów nowotworowych

Transport guza:

• Jałowe naczynie

• Płyn Hawksa lub Eagle’a ewentualnie 0,9% NaCl z dodatkiem antybiotyków: penicyliny krystalicznej (100 IU/ml), streptomycyny (100μg/ml)

Przygotowanie tkanek guza:

• 1-3cm³ guza przenosimy na szalkę Petriego

• Rozdrabniamy tkankę nożyczkami

• Dodajemy 2ml płynu Hawksa z antybiotykami i dalej rozdrabniamy

Skład płynu hodowlanego (100ml)

• Płyn RPM z penicyliną (100 IU/ml) i streptomycyną (100μg/ml)

• 10-15% surowica płodowa cielęca

• 1ml L-glutaminy

Przenoszenie tkanek guza do naczynia hodowlanego NUNC, w którym znajduje się 5ml płynu hodowlanego, 1ml kolagenazy o stężeniu 150-200 IU/ml. Całość trzymamy w cieplarce (37°C, 24h, 5%CO₂)

• Po 24h rozpipetowujemy do probówki wirowniczej

• Dodajemy 10ml płynu RPM z antybiotykami

• Wirujemy 10min 1000obr/min

• Po odwirowaniu dodajemy 1,5ml płynu RPM

Zakładanie hodowli: naczynie szklane- 8,5ml płynu hodowlanego, 1,5ml zawiesiny kom guza: naczynie plastykowe: 4,5ml +0,5ml

Hodowla w temperaturze 37°C, z przepływem 5%CO₂. Codziennie oglądamy w mikroskopie odwróconym wzrost kolonii. UWAGA!: co 2-3 dni zmiana płynu hodowlanego

Zakończenie hodowli

• Przy widocznych mitoza (po kilku, kilkunastu dniach i więcej), 30min – 2h przed zakończeniem hodowli colcemid 5-10μg/ml

• Komórki z hodowli zdrapujemy „drapaczką”

• Całość zalewamy do probówki wirowniczej, wirujemy 10 min 1100obr/min

Przeprowadzenie szoku hipotonicznego:

Skład płynu hipotonicznego: KCl 1,5g; HEPES 2,4g; EGTA 0,1g; H2O dezjon. 500ml; pH 7,4 Szok hipotoniczny przeprowadzamy w temperaturze 37°C przez 45min. Następnie wirujemy 10min 1100obr/min

Utrwalanie materiału komórkowego

• Metanol : lodowy kwas octowy 3:1, powtarzamy 3x po 20 min

• Wirowanie 10min 1100obr/min

• Nanosimy na zimne (wyjęte z wody z lodem) szkiełka podstawowe

Łańcuchowa reakcja polimerazy

PCR- enzymatyczna amplifikacja in vitro fragmentu genomowego DNA o długości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad.

Startery – jednoniciowe oligonukleotydy (ok. 20 zasad), syntetyzowane chemicznie Sekwencja nukleotydów jest komplementarna do końców 3’ obu nici wybranej sekwencji matrycowego fragmentu DNA, które ma być powielona w zwielokrotnionej kopii.

Amplifikacja DNA w reakcji PCR odbywa się przy udziale termostabilnej polimerazy DNA wyizolowanej z termofilnych bakterii np. polimeraza Taq z Thermas aquaticus jest aktywna w mieszaninie reakcyjnej o temp. 95 st.

Reakcja PCR prowadzona jest w cyklach powtarzających się 20 – 40 razy. W każdym cyklu następuje etap denaturacji cząsteczki DNA, przyłączanie starterów i syntezy nowej nici DNA. Każdy etap zachodzi w innej temperaturze i trwa ok. 15- 60 sek.

Reakcja zachodzi w próbówce umieszczonej w bloku grzejnym (termocykler), który umożliwia szybka i precyzyjna zmianę temperatury, właściwa dla poszczególnych etapów procesu PCR.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

• Matrycowy DNA (lub RNA) nie może być zanieczyszczony, zdegradowany

• 2 Startery komplementarne do matrycy i ograniczające długość syntetyzowanego łańcucha

• Tri fosforany czterech deoksyrybonukleotydów (dNTP)

• Termostabilna polimeraza Taq

• Odpowiedni bufor

• Jony Mg²⁺ - ko faktor aktywności enzymatycznej polimerazy

Objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20-100ul

Etapy reakcji PCR:

• Denaturacja matrycowego DNA w temperaturze 94C (wstępna ->1x na początku całej reakcji, w jej trakcie rozplata się cały genomowy DNA; cykliczna-> 94C ok1min)

• Przyłączanie starterów do jednoniciowych matryc DNA w temperaturze 40-68C (im więcej par GC tym wyższa temperatura przyłączania), jeśli za niska temp mogą przyłączać się w nieodpowiednich mcach)

• Synteza DNA – wydłużanie starterów przy udziale polimerazy Taq w temperaturze 72C z wykorzystaniem dNTP – elongacja Kolejny cykl zapoczątkowuje wzrost temp do 94C. Podniesienie temperatury 72C po zakończeniu elongacji do temperatury denaturacji DNA rozpoczyna kolejny cykl, proces ten może być powtarzany 25-40x. Po każdym cyklu następuje podwojenie amplifikowanego materiału. Nowo powstające produkty PCR są również matrycą do syntezy następnych. Końcową ilość namnożonych kopii fragmentu DNA można obliczyć ze wzoru: Wydajność maleje z kolejnym cyklem.

I=I₀x2ⁿ ,gdzie: I, I₀ – końcowa i początkowa ilość kopii powielanego odcinka DNA, n – ilość cykli

zalety:

• Szybka do przeprowadzenia: 2,5-4h materiał nie musi być żywy

• Klonowanie pojedynczych genów

• b. duża czułość i specyficzność metody

wady:

• b. duża czułość i specyficzność (przy zanieczyszczonej próbce, może to prowadzić do błędnych wyników)

zastosowania PCR:

• wykrywanie patogenów infekcyjnych: bakterii, wirusów, pasożytów

• wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych

• preimplantacja i prenatalna diagnostyka chorób genetycznych

• wykrywanie uszkodzeń DNA spowodowanych czynnikami środowiskowymi

• wykrywanie predyspozycji do chorób nowotworowych, monitorowanie i wykrywanie nowotworów

• wykrywanie polimorfizmu sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej, ustalanie ojcostwa, identyfikacja sprawców przestępstw

• badania głównego systemu zgodności tkankowej w celu prawidłowego doboru dawców i biorców

Warianty reakcji PCR:

rt-PCR:

proces PCR jest poprzedzany przepisaniem sekwencji mRNA na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Jest to technika amplifikacji genów, w której materiałem wyjściowym jest mRNA lub całkowity RNA komórki Służy do analizy ekspresji genów

Multiplex PCR

Wielomiejscowa reakcja PCR, umożliwia jednoczasową amplifikację kilku fragmentów DNA w mieszaninie reakcyjnej. Istnieje w niej kilka par starterów, mogą to być różne geny lub różne fragmenty tego samego genu; muszą mieć podobną temperaturę hybrydyzacji. Produkty muszą się różnić długością aby w rozdziale elektroforetycznym miały inny prążek.

Nested PCR

Wewnętrzna reakcja PCR: prowadzi się dwie rundy reakcji, do każdej stosuje się dwie pary primerów: zewnętrznych i wewnętrznych, tak że druga para jest umieszczona wewnętrznie w stosunku do pierwszej. Pierwsza runda to standardowe PCR prowadzona przez 15-20 cykli. Mała porcja tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej jest rozcieńczana i poddawana drugiej rundzie amplifikacji przez 15-20 cykli. Poprawia się dzięki temu specyficzność i czułość reakcji PCR

Real time PCR

Tzw „w czasie rzeczywistym”, po każdej replikacji (powieleniu) informuje ile jest kopii DNA. Umożliwia analizę ilości prod PCR w każdym cyklu. Barwniki, sondy reakcyjne emitują fluorescencję łącząc się z prod reakcji PCR. Analiza-> nałożenie prod na żel agarozowy elektroforetyczny. Prod jest prążkiem, jeśli występuje wiecej niż jeden znaczy że powstał prod niespecyficzny (startery przyłączały się w niewłaściwych miejscach).

RAPD PCR

Losowa amplifikacja polimorficznego DNA

Met polega na uzyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Łączenie starterów przeprowadzane w niskiej temp- obniżenie specyficzności. Powst wiele prążków char dla danego np. drobnoustroju.

ASA PCR

Umożliwia rozróżnienie alleli badanego fragmentu. Startery są specyficzne dla DNA typu dzikiego lub zmutowanego, pozwala to na wybiórczą ampilifikację określonego allelu.

Enzymy restrykcyjne-są to endonukleazy tnące DNA w specyficznych miejscach, niezależnie od jego pochodzenia. Stały się one 1-szym narzędziem stosowanym do pocięcia całego genomu na charakterystyczne fragmenty DNA (tzw. Fragmenty restrykcyjne).W ten sposób geny lub zespoły genow stają się jednostkami fizycznie możliwymi do wyizolowania , a nie tylko informacja rozsianą w olbrzymiej ciągłości genomu. W warunkach naturalnych enzymy te występują w komórkach bakterii i sinic i pełnia tam rolę systemu obronnego. Ich zadaniem jest niszczenie obcego DNA najcześciej wirusowgo. Własny DNA nie jest niszczony gdyż nie ma w nim specyficznych rozpoznawanych przez restryktazy sekwencji zasad albo Są one zmetylowane i w ten sposób staja się niedostępne dla enzymu. Obecnie znanych jest ok. 3000 enzymów restrykcyjnych natomiast niewiele z nich ma zastosowanie .Zasady nazewnictwa np. Eco R I - 1- sza litera – rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, 2 następne litery-gatunek bakterii, z której wyizolowano enzym, R –szczep, cyfra rzymska-przedstawia klejnosc odkrycia enzymu u tego samego gatunku bakterii. Charakterystyczna cechą enzymów restrykcyjnych jest rozpoznawanie swoistych dla danego enzymu sekwencji zasad w Dna (4-8 pz).Charakterystyczna cechą rozpoznawanych sekwencji jest polindromiczność-co oznacza, że kolejność zasad w jednej nici Dna odczytywana w kierunku 5` 3` jest taka sama jak kolejność zasad w drugiej nici w kierunku 5`3`.Endonukleazy rozpoznawszy sekwencje tną Dna albo w obrębie tej sekwencji albo w pewnej odległości od niej. Ze względu na miejsce cięcia, ale tez ze względu na kofaktory i ilość podjednostek można dokonać podziału enzymów restrykcyjnych na 3 klasy.

Klasa I- najliczniejsza i najbardziej skomplikowana,3 podjednostki, aktywność metylazy. Działanie zależy od kofaktorów ATP, jony magnezu i s-adenozynometionina. Enzymy rozpoznają sekwencję łączą się z nią, ale tną w pewnej odległości –nawet 1000 pz od miejsca rozpoznawanego.

Klasa III-2 typy podjednostek. Wymagają ATP, jonów magnezu ,s-adenozynometionia nie jest niezbędna. Przecinają Dna w pewnej odległości od rozpoznanej sekwencji- ok. 25 nukleotydów.

Klasa II-najprostszy system , 1 typ podjednostki . Aktywowane jonami magnezu,nie maja aktywności metylazy. Przecinają Dna w miejscu rozpoznawanej sekwencji.

Do badań genetycznych wykorzystywana jest tylko klasa II.

Typy cięć-enzymy restrykcyjne mogą przecinać podwójną nić Dna na 2 różne sposoby:

-przecinają obie nici Dna na tej samej wysokości(naprzeciw siebie) tak że powstają zakończenia Dna z tępymi końcami, na których nie ma wolnych niesparowanych zasad. fragmenty o tępych końcach mogą się połączyć tylko za pomocą enzymu ligazy polinukleotydowej T4.

-przecinają każdą nić Dna nie naprzeciwko siebie, ale cięcia na 2 niciach przesunięte są jedno względem drugiego o kilka zasad. Powstają w ten sposób lepkie końce, na których znajdują się niesparowane zasady. Końce te mogą tworzyć wiązania wodorowe zgodnie z zasadą komplementarności z lepkimi końcami każdego innego fragmentu Dna powstałego powstałego wyniku działania tej samej endonukleazy.

Zastosowanie-inżynieria genetyczna umożliwiły postęp w mapowaniu genomu,nieodzowne w analizie RFLP, wykrywanie mutacji, ustalanie stopnia pokrewieństwa , ustalanie ojcostwa, kryminalistyka, klonowanie

RFLP- polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Jest to polimorfizm fragmentów Dna powstających wyniku działania enzymów restrykcyjnych na nic Dna. Polimorfizm ten może być wynikiem tranzycji, transwersji , delecji, inercji co prowadzi do powstania lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne. Mutacje zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych zmieniają długość fragmentów restrykcyjnych, które można wykrc np. metodą Southerna. Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych jest dość powszechny , szczególnie w niekodujących regionach Dna. Wykrywa się różnice pomiędzy rozmiarami fragm DNA pociętych restryktazami. Różnice dług fragm DNA powstają w wyniku mutacji, kt tworza lub eliminuja mca rozpoznawane przez te enzymy. Pozwala na wykazanie powiązań rodzinnych poprzez porównanie char wzorow polimorficznych.

Zastosowanie-identyfikacja mutacji w chorobach genetycznych –tą metoda badamy mutacje znane. Badanie dziedzicznych uwarunkowań do powstania danych chorób genetycznych. Mapowanie genów.

SSCP- polimorfizm konformacji pojedynczych łańcuchów DNA

Wykrywanie mutacji nieokreślonych.

metoda ta wykorzystuje unikalną właściwość kwasów nukleinowych polegającą na tworzeniu przez pojedyncze nici Dna tzw. konformerów, których kształt jest zależny od sekwencji Dna np. mutacje punktowe zmieniają konformacje pojedynczej nici Dna co jest wykrywane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym

Przebieg procesu- amplifikacja badanego fragmentu Dna met PCR ze znakowaniem fosforemprodukt PCR wyznakowały radioizotopemdenaturacjajednoniciowe fragmenty Dna wykazujące polimorfizm tzw. konformeryelektroforeza w niedenaturującym żelu poliakrylamidowaym i autoradiografia

Zastosowanie-metoda wykorzystana do badań mutacji nieznanych

Hybrydyzacja metodą Southern

Zadaniem tego typu hybrydyzacji jest identyfikacja poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

Etapy:

1) Genomowy DNA trawiony przez wybrane enzymy restrykcyjne

2) Fragmenty DNA otrzymane po trawieniu rozdziela się przez elektroforezę w żelu agarozowym

3) Zestaw fragmentów restrykcyjnych przenosi się z żelu agarozowego na błonę nylonową( filtr nitrocelulozy)

4) Badany fragment wykrywa się przez hybrydyzacje z sondą

Metoda Southerna stosowana jest powszechnie do badań polimorfizmu DNA.

Zastosowanie-analiza RFLP

Metoda Nothern

Przebiega analogicznie do Southern ale służy do detekcji RNA.

W przeciwieństwie do met Southern tym co rozdzielamy jest RNA natomiast sondą możę być DNA. Etapy: 1 rozdział RNA na zelu, 2) przeniesienie RNA na mambrane, utrwalenie 3) inkubacja z sonda 4) opłukiwanie niezwiazanej sondy i detekcja. Najtrudniejsza w tej metodzie jest sama izolacja RNA gdyż jest ono niestabilne i łatwo ulega trawieniu przez endonukleazy.

Metoda Western

Technika służąca do detekcji białek. 1) rozdział białek na zelu poliakrylamidowym, 2) transfer na mambranę, 3) inkubacja z p/ciałami 4) detekcja p/ciał

P/ciała pierwotne-wyznakowane znacznikiem fluorescencyjnym. Określana masa cząst fragm.

P/ciała wtórne- p/pciałom pierwotnym, do wyznakowanego p/ciała pierwotego przyłączony jest znacznik a do niego przyłącza się kilka p/ciał wtórnych

Hybrydyzacja in situ

Jest to technika cytochemiczna służąca do wykrywania pojedynczego genu lub jego fragmentu bezpośrednio w preparacie cytogenetycznym i cytologicznym(tkankowym)

In situ oznacza :w miejscu naturalnego występowania. Metodą tą można badać swoistą ekspresję genu w komórce lub tkance.

Materiał: skrawki tkanek, pojedyncze komórki, struktury subkomórkowe tj. chromosomy

Prowadzona jest bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym bez przenoszenia na nośnik;w zawiesinach komórek lub próbkach tkanek pobranych w czasie biopsji. Aby zastosować hybrydyzacje In situ DNA w chromosomie musi być w formie 1-niciowej. Podstawowe warunki hybrydyzacji In situ to czułość i rozdzielczość.

Fluorescencyjna hybrydyzacja In situ-FISH

Technika ta wykorzystuje fluorescencyjne metody detekcji sondy (fluorescencja zanika po 10min). Po hybrydyzacji preparat ocenia się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ze względu na duża rozdzielczość rozdzielczość łatwość użycia FISH wyparł radioaktywną hybrydyzacje in situ.

Wykorzystuje się 3 rodzaje sond:

-centromerowe- detekcja aneuploidii chrom lub okreslenie pochodzenia chrom markerowych

-malujące- heterogenna mieszanina sekwencjispecyficznych dla ramion krótkich lub i długich chrom.

-markerowe- komplementarne do genów lub loci genowych; rozpoznawanie mikrodelecji i określenie punktów złamań chromosomów

Etapy:

-przygotowanie preparatu chromosomowego

-denaturacja DNA chromosomowegopowstają 1-niciowe łańcuchy

- jednocześnie przygotowujemy sondę (denaturacja z wytworzeniem fragmentow jednoniciowych , znakowanie)

-hybrydyzacja In situ –nakrapiamy sondę na preparat chromosomowy

-odstawienie i tworzenie się hybryd

-po hybrydyzacji odpukanie niespecyficznie związanej sondy

-detekcja związanej sondy(metoda bezpośrednia-od razu preparat oglądany pod mikroskopem fluorescencyjnym albo jeśli znacznikiem była biotyna dodać avidynę i fluorofor-metoda pośrednia)

Zastosowanie

-wykrywanie mRNA np. dla danego hormonu, badanie ekspresji onkogenów na poziomie RNA

-wykrywanie wirusowego DNA i RNA

-identyfikacja genów

-wykrywanie mutacji

-wykrywanie liczbowych i strukturalnych aberracji chromosomowych w chrom metafazowych w jądrach interfazowych

-wykrywanie aberracji chromosomowych-liczbowych i strukturalnych

-wykrywanie mikrodelecji

-identyfikacja złożonych translokacji

-diagnostyka komórek nowotworowych

-diagnostyka prenatalna

-wykrywanie płci

-identyfikacja chromosomów markerowych

Sekwencjonowanie DNA

1 - Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gillberta)

• Izolacja DNA- wiele kopii z met PCR

• Denaturacja – 1 nić

• Znakowanie (np. izotopami radioaktywnymi) na końcu 5’

• W wyniku różnych reakcji chemicznych dochodzi do modyfikacji odpowiednich zasad DNA

  • dodanie siarczku dimetylu powoduje metyzację guaniny

  • Kwas mrówkowy – adenina lub guanina

  • Hydrazyna – tymina i cytozyna

  • Hydrazyna i stężona sól - cytozyna

• Dodajemy piperydyny –przerywa łańcuch DNA

• W efekcie otrzymujemy różnej długości łańcuchy pociętego DNA

• Które następnie poddajemy elektroforezie na żelu poliakrylamidowym- dokładniejsze

2. - Metoda terminacji łańcucha – metoda Sangera, metoda dideoksy 3at C!

• Starter, polimeraza DNA, deoksyrybonukleotydy

• W każdej próbówce znajduje się też pewna ilość dideoksyrybonukleotydów (w każdej po 1 specyficznym)

• Polimeraza DNA nie ma zdolności rozróżnienia czy wbudowywany nukleotyd to dideoksy, czy prawidłowy

• Po wbudowaniu w łańcuch dideoksyrybonukloeotydu następuje koniec elongacji łańcucha

• Ponieważ w każdej probówce znajduje się określony dideoksyrybonukleotyd, wiemy jaka zasada została wbudowana ostatnia

• W wyniku elektroforezy możemy odczytać sekwencję DNA

Mikromacierze DNA

• Pozwalają na badanie całej grupy genów

• Hybrydyzacja jednoczasowa w kilku grupach genów

• Opiera się na metodzie Southern lub Northern

Płytka szklana lub platykowa z naniesionymi w regularnych pozycjach mikroskopowej wielkości polami zawierającymi różniące się od siebie sekwencje fragm DNA (sondy). Służą do badania ekspresji genów. Sonda unieruchomiona a my nanosimy materiał. Rodzaje sond: 1) krótkie 18-25 nukleotydowych sekwencji 2) długie 50-70 3) cDNA- kilkaset do kilku tysiecy pz, zazwyczaj odpowiadajace pelnym sekwencjom mRNA

Etapy:

-zebranie próbki i izolacja RNA

-synteza cDNA na matrycy wyizolowanego RNA

-synteza wyznakowanego cRNA na podst cDNA (lub wyznakowanie cDNA)

-hybrydyzacja wyznakowanego kw nukleinowego z mikromacierza

-odpłukanie niespecyficznie zwiazanych subst

-skanowanie obrazu mikromacierzy

-przekształcenie obrazu w zbiór danych wartości ekspresją dla każdej sondy

Zastosowanie:

-Porownanie genow osob zdrowych i chorych

-Badanie ekspresji genow na poziomie transkryptoru

-Detekcja mutacji i polimorfizmów

-Genotypowanie

-Badanie alternatywnego skladania transkryptow