Metody MIX, psychologia, Genetyka


METODA SANGERA-Reakcja sekwencjonowania DNA

Polega na enzymatycznej replikacji materiału DNA w obecności deoksyrybonukleotydów(dd NTP)

Matryca Dna jest jednoniciowa

-fragm. unikalnego genomowego DNA

-homogenny produkt PCR

-Pojedynczy klon DNA

Etapy:

1.synteza drugiej nici DNA

do 4 probówek oznaczonych A,C,G,T wprowadzamy:

-matrycę

-jeden starter

-mieszaninę 4 dd NTP

-odpowiedni bufor

-polimerazę DNA

-jeden z dd NTP (A,G,C,T)

Polimerazy DNA są wybiórcze wobec dd NTP;

Jego stężenie musi być odpowiednio wysokie

Wbudowanie dd NTP do nowopowstałego łańcucha DNA kończy replikację

2.denaturacja produktów syntezy

3.Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym na kliszy RTG

Do reakcji 1 wprowadza się jeden nukleotyd d NTP lub starter wyznakowany radioizotopem 32P lub 21S.Po autoradiografii na kliszy RTG uwidocznione są prążki .

METODA SAUTHERNA

DNA tnie się przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych na fragmenty, które następnie rozdziela się pod względem wielkości poprzez elektroforezę w żelu. Fragmenty te przenosi się następnie na filtr wiążący DNA , a fragmenty komplementarne identyfikuje się za pomocą autoradiografii, stosując wyznakowane, radioaktywne sondy.

Za pomocą analizy Sautherna możemy wykazać mutacje odcinkowe

-o delecji będzie świadczyć zmniejszenie się rozmiarów lub brak prążków

-o amplifikacji -powstanie prążków o zmniejszonych rozmiarach.

PCR (polymerase chain reaction)

Umożliwia powielanie wybranego fragmentu DNA w milionach kopii, bez użycia wektorów i bakterii. Polega na ok.30 powtarzających się cyklicznych etapach.

Etapy:

-denaturacja dna w temp 90-95 C

-wiązanie starterów temp.50-65 C

- wydłużanie starterów temp 68-72 C

(synteza powielanego fragm.DNA)

Każdy cykl ma ok.3 min, a powstające amplikony służą jako matryce w następnych cyklach reakcji

Prowadząc do logarytmicznego przyrostu ilości produktów. Reakcja PCR zachodzi w termoblokach zdolnych do szybkich zmian temp. La poszczególnych etapów reakcji(4C\sek.)

Mieszanina reakcji PCR;

1.matryca DNA lub cDNA

2. Dwa startery -fragm. Jednoniciowych DNA o dł. kilkunastu nukleotydów komplementarnych do matrycy i ograniczające długości powielanego odcinka DNA.

3.dNTP-miesznina dATP,dCTP,dGTP,dTTP,

4.Termostabilna polimeraza DNA(np. polimeraza Taq)

5. kationy magnezu

6.odpowiedni bufor

Cel:

-Wykrywanie mutacji genowych.

-wykrywanie chorób genetycznych

-wykrywanie nowotworów

-wykrywanie polimorficznych sekwencji(identyfikacja osobnicza)

-monitorowanie chorób(białaczki)

-monitorowanie translokacji.

ANALIZA NORTHERN BLOT

(dotyczy RNA)

Etapy;

-elektroforeza preparatów RNA

-transfer na filtr nylonowy

-związanie RNA z filtrem

-hybrydyzacja

-płukanie filtru

-autoradiografia

METODA SAUTHERNA

DNA tnie się przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych na fragmenty, które następnie rozdziela się pod względem wielkości poprzez elektroforezę w żelu. Fragmenty te przenosi się następnie na filtr wiążący DNA , a fragmenty komplementarne identyfikuje się za pomocą autoradiografii, stosując wyznakowane, radioaktywne sondy. Za pomocą analizy Sautherna możemy wykazać mutacje odcinkowe

-o delecji będzie świadczyć zmniejszenie się rozmiarów lub brak prążków

-o amplifikacji -powstanie prążków o zmniejszonych rozmiarach.

PCR (polymerase chain reaction)

Umożliwia powielanie wybranego fragmentu DNA w milionach kopii, bez użycia wektorów i bakterii. Polega na ok.30 powtarzajacych się cyklicznych etapach.

Etapy:

-denaturacja dna w temp 90-95 C

-wiązanie starterów temp.50-65 C

- wydłużanie starterów temp 68-72 C

(synteza powielanego fragm.DNA)

Każdy cykl ma ok.3 min, a powstające amplikony służą jako matryce w następnych cyklach reakcji

Prowadząc do logarytmicznego przyrostu ilości produktów. Reakcja PCR zachodzi w termoblokach zdolnych do szybkich zmian temp. La poszcególnych etapów reakcji(4C\sek.)

Mieszanina reakcji PCR;

1.matryca DNA lub cDNA

2. Dwa startery -fragm. Jednoniciowych DNA o dł. kilkunastu nukleotydów komplementarnych do matrycy i ograniczajace długości powielanego odcinka DNA. 3.dNTP-miesznina dATP,dCTP,dGTP,dTTP,

4.Termostabilna polimeraza DNA(np. polimeraza Taq)

5. kationy magnezu

6.odpowiedni bufor

Cel:

-Wkrywanie mutacji genowych.

-wykrywanie chorób genetycznych

-wykrywanie nowotworów

-wykrywanie polimorficznych sekwencji(identyfikacja osobnicza)

-monitorowanie chorób(białaczki)

-monitorowanie translokacji.

ANALIZA NORTHERN BLOT

(dotyczy RNA)

Etapy;

-elektroforeza preparatów RNA

-transfer na filtr nylonowy

-związanie RNA z filtrem

-hybrydyzacja

-płukanie filtru

-autoradiografia

Typy sąd molekularnych w FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja insitu)

  1. Sondy specyficzne dla unikalnych sekwencji DNA stosowane w identyfikacji mikrodelecji i innych submikroskopowych aberacji

Sondy specyficzne dla powtórzonych sekwencji tzw. DNA satelitarnego; sondy centromerowe, telomerowe, komplementarne do

  1. rejonów hetrochromatyny krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych.

Służą w diagnozowaniu aneuploidii, chromosomów markerowych, komórek mozajkowych

  1. Sondy złożone specyficzne dla dużych fragmentów lub całych chromosomów; identyfikacj aberacji chromosomowych, złożonych lub ukrytych translokacji, addycji niewiadomego pochodzenia

Zakres stosowania FISH w genetyce

Wykonanie : preparat + sonda (znakowana fluorochromami -> wyznakowanie sondy -> denaturacja preparatu (DNA) i sondy -> hybrydyzacja z wyznakowaną sondą -> detekcja związanej sądy - > analiza obrazu mikroskopowego

SONDA

Fragment DNA którego sekwencje nukleotydowe są komplementarne czyli mają określoną specyficzność względem badanego rejonu chromosomowego.

Sonda może być specyficzna wzgl. Badanego genu lub dla sekwencji otaczającej ten gen.

Sądą mogą być:

-syntetyczne lub naturalne geny lub ich fragmenty

-syntetyczne oligonukleotydy

-cDNA

-fragmenty chromosomów lub całe genomy bakteryjne

-fragmenty DNA genomowego

Metody znakowania sond:

izotopowe -> sprawdzane są nukleotydy wyznaczone pierwiastkami

  1. promieniotwórczymi; jest to metoda autoradiograficzna

  2. nieizotopowe -> znacznikiem jest nukleotyd zawierający cząsteczkę znacznikową np. biotyna lub digoksygenina lub fluorochromy emitujące światło przy różnej długości fali [nm]

Systemy detekcji sprzężonych z sondą znaczników



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Metody diagnozy psychologicznej
METODA SANGERA, psychologia, Genetyka
MIX, Materiały =), Genetyka
Podstawowe metody badań w psychologii, Pedagogika
PODSTAWOWE METODY BADAWCZE W PSYCHOLOGII, psychologia i pedagogika
Przykladowe pytania, WSFiZ- Psychologia, Genetyka zachowania
metodyka sciaga, psychologia kliniczna, Metodyka pracy opiekuńczo wychowawczej
Wykład 1 Metody?dań stosowane w psychologii; wywiad i obserwacja jako metody poznania pacjentax
METODA SAUTHERNA1, psychologia, Genetyka
Przedmiot i metody badan w psychologii
Psych - metody badawcze, psychologia pedagogika socjologia
SKORNY Z Metody?dań i diagnostyka psychologiczna
Metody badań w psychologii, SZKOŁA
Podstawowe metody badawcze w psychologii
Podstawowe metody badawcze w psychologii(prezentacja pełna)
Metody badawcze w psychologii
nowotwory dla studentów, psychologia, Genetyka
metody projekcyjne, Psychologia materiały do obrony UJ
SLOWNIK NEURO dodatkowo, WSFiZ- Psychologia, Genetyka zachowania

więcej podobnych podstron