METODA SANGERA-Reakcja sekwencjonowania DNA
Polega na enzymatycznej replikacji materiału DNA w obecności deoksyrybonukleotydów(dd NTP)
Matryca Dna jest jednoniciowa
-fragm. unikalnego genomowego DNA
-homogenny produkt PCR
-Pojedynczy klon DNA
Etapy:
1.synteza drugiej nici DNA
do 4 probówek oznaczonych A,C,G,T wprowadzamy:
-matrycę
-jeden starter
-mieszaninę 4 dd NTP
-odpowiedni bufor
-polimerazę DNA
-jeden z dd NTP (A,G,C,T)
Polimerazy DNA są wybiórcze wobec dd NTP;
Jego stężenie musi być odpowiednio wysokie
Wbudowanie dd NTP do nowopowstałego łańcucha DNA kończy replikację
2.denaturacja produktów syntezy
3.Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym na kliszy RTG
Do reakcji 1 wprowadza się jeden nukleotyd d NTP lub starter wyznakowany radioizotopem 32P lub 21S.Po autoradiografii na kliszy RTG uwidocznione są prążki .
METODA SAUTHERNA
DNA tnie się przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych na fragmenty, które następnie rozdziela się pod względem wielkości poprzez elektroforezę w żelu. Fragmenty te przenosi się następnie na filtr wiążący DNA , a fragmenty komplementarne identyfikuje się za pomocą autoradiografii, stosując wyznakowane, radioaktywne sondy.
Za pomocą analizy Sautherna możemy wykazać mutacje odcinkowe
-o delecji będzie świadczyć zmniejszenie się rozmiarów lub brak prążków
-o amplifikacji -powstanie prążków o zmniejszonych rozmiarach.
PCR (polymerase chain reaction)
Umożliwia powielanie wybranego fragmentu DNA w milionach kopii, bez użycia wektorów i bakterii. Polega na ok.30 powtarzających się cyklicznych etapach.
Etapy:
-denaturacja dna w temp 90-95 C
-wiązanie starterów temp.50-65 C
- wydłużanie starterów temp 68-72 C
(synteza powielanego fragm.DNA)
Każdy cykl ma ok.3 min, a powstające amplikony służą jako matryce w następnych cyklach reakcji
Prowadząc do logarytmicznego przyrostu ilości produktów. Reakcja PCR zachodzi w termoblokach zdolnych do szybkich zmian temp. La poszczególnych etapów reakcji(4C\sek.)
Mieszanina reakcji PCR;
1.matryca DNA lub cDNA
2. Dwa startery -fragm. Jednoniciowych DNA o dł. kilkunastu nukleotydów komplementarnych do matrycy i ograniczające długości powielanego odcinka DNA.
3.dNTP-miesznina dATP,dCTP,dGTP,dTTP,
4.Termostabilna polimeraza DNA(np. polimeraza Taq)
5. kationy magnezu
6.odpowiedni bufor
Cel:
-Wykrywanie mutacji genowych.
-wykrywanie chorób genetycznych
-wykrywanie nowotworów
-wykrywanie polimorficznych sekwencji(identyfikacja osobnicza)
-monitorowanie chorób(białaczki)
-monitorowanie translokacji.
ANALIZA NORTHERN BLOT
(dotyczy RNA)
Etapy;
-elektroforeza preparatów RNA
-transfer na filtr nylonowy
-związanie RNA z filtrem
-hybrydyzacja
-płukanie filtru
-autoradiografia
METODA SAUTHERNA
DNA tnie się przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych na fragmenty, które następnie rozdziela się pod względem wielkości poprzez elektroforezę w żelu. Fragmenty te przenosi się następnie na filtr wiążący DNA , a fragmenty komplementarne identyfikuje się za pomocą autoradiografii, stosując wyznakowane, radioaktywne sondy. Za pomocą analizy Sautherna możemy wykazać mutacje odcinkowe
-o delecji będzie świadczyć zmniejszenie się rozmiarów lub brak prążków
-o amplifikacji -powstanie prążków o zmniejszonych rozmiarach.
PCR (polymerase chain reaction)
Umożliwia powielanie wybranego fragmentu DNA w milionach kopii, bez użycia wektorów i bakterii. Polega na ok.30 powtarzajacych się cyklicznych etapach.
Etapy:
-denaturacja dna w temp 90-95 C
-wiązanie starterów temp.50-65 C
- wydłużanie starterów temp 68-72 C
(synteza powielanego fragm.DNA)
Każdy cykl ma ok.3 min, a powstające amplikony służą jako matryce w następnych cyklach reakcji
Prowadząc do logarytmicznego przyrostu ilości produktów. Reakcja PCR zachodzi w termoblokach zdolnych do szybkich zmian temp. La poszcególnych etapów reakcji(4C\sek.)
Mieszanina reakcji PCR;
1.matryca DNA lub cDNA
2. Dwa startery -fragm. Jednoniciowych DNA o dł. kilkunastu nukleotydów komplementarnych do matrycy i ograniczajace długości powielanego odcinka DNA. 3.dNTP-miesznina dATP,dCTP,dGTP,dTTP,
4.Termostabilna polimeraza DNA(np. polimeraza Taq)
5. kationy magnezu
6.odpowiedni bufor
Cel:
-Wkrywanie mutacji genowych.
-wykrywanie chorób genetycznych
-wykrywanie nowotworów
-wykrywanie polimorficznych sekwencji(identyfikacja osobnicza)
-monitorowanie chorób(białaczki)
-monitorowanie translokacji.
ANALIZA NORTHERN BLOT
(dotyczy RNA)
Etapy;
-elektroforeza preparatów RNA
-transfer na filtr nylonowy
-związanie RNA z filtrem
-hybrydyzacja
-płukanie filtru
-autoradiografia
Typy sąd molekularnych w FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja insitu)
Sondy specyficzne dla unikalnych sekwencji DNA stosowane w identyfikacji mikrodelecji i innych submikroskopowych aberacji
Sondy specyficzne dla powtórzonych sekwencji tzw. DNA satelitarnego; sondy centromerowe, telomerowe, komplementarne do
rejonów hetrochromatyny krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych.
Służą w diagnozowaniu aneuploidii, chromosomów markerowych, komórek mozajkowych
Sondy złożone specyficzne dla dużych fragmentów lub całych chromosomów; identyfikacj aberacji chromosomowych, złożonych lub ukrytych translokacji, addycji niewiadomego pochodzenia
Zakres stosowania FISH w genetyce
identyfikacja mozajkowatości komórki
wykrywanie i identyfikacja niektórych rejonów chromosomowych płci
iden. addycji niewiadomego pochodzenia
iden. chromosomów markerowych
analiza translokacji (szczególnie złożonych)
iden. Mikrodelecji iden. Tzw. ukrytych aberacji
szybka diagnostyka aneuploidii
Wykonanie : preparat + sonda (znakowana fluorochromami -> wyznakowanie sondy -> denaturacja preparatu (DNA) i sondy -> hybrydyzacja z wyznakowaną sondą -> detekcja związanej sądy - > analiza obrazu mikroskopowego
SONDA
Fragment DNA którego sekwencje nukleotydowe są komplementarne czyli mają określoną specyficzność względem badanego rejonu chromosomowego.
Sonda może być specyficzna wzgl. Badanego genu lub dla sekwencji otaczającej ten gen.
Sądą mogą być:
-syntetyczne lub naturalne geny lub ich fragmenty
-syntetyczne oligonukleotydy
-cDNA
-fragmenty chromosomów lub całe genomy bakteryjne
-fragmenty DNA genomowego
Metody znakowania sond:
izotopowe -> sprawdzane są nukleotydy wyznaczone pierwiastkami
promieniotwórczymi; jest to metoda autoradiograficzna
nieizotopowe -> znacznikiem jest nukleotyd zawierający cząsteczkę znacznikową np. biotyna lub digoksygenina lub fluorochromy emitujące światło przy różnej długości fali [nm]
Systemy detekcji sprzężonych z sondą znaczników
immunocytochemiczne
immonofluorescencyjne
przeciwciało skoniugowane jest z fluorochromem; obraz widoczny pod mikroskopem fluorescencyjnym