Dojrzewanie limfocytów.

Komórki progenitorowe limfopoezy- zasiedlają grasicę. Mogą z nich powstać limfocyty T i B, NK oraz kom.dendrytyczne.

Najważniejszy czynnik transkrypcyjny w komórkach ukierunkowanych w rozwoju w stronę limfocytów to Icaros.

Jedną z cząsteczek powierzchniowych komórek zasiedlających grasicę, determinującą dalszy rozwój w kierunku limfocytów T jest Notch-1.

Limfocyty B powstają w szpikuNajważniejszy czynnik transkrypcyjny determinujący różnicowanie w kierunku limfocytów B jest Pax5. Komórki, w których pojawia się ten czynnik, określane są jako limfocyty pre-pro-B (CD34+,CD10+,B220+). Komórkach tych rozpoczyna się ekspresja genów RAG1, RAG2 i TdT, których produkty uczestniczą w rearanżacji genów dla składowych receptora immunoglobulinowego.

Genetyczne uwarunkowania różnicowania receptorów BCR i TCR.

s.56, kartka, s.74, 84, 81!

Fazy dojrzewania limfocytów T.

S.74, KARTKA

1. wąskie gardło tymopoezy- procesy selekcji, eliminacja 90% dojrzewających komórek.

2. Do kolejnych etapów przechodzą komórki, które prawidłowo rearanżują geny kodujące łańcuch β lub cały receptor TCR (selekcja pozytywna)

3. W wyniku selekcji pozytywnej dochodzi do restrykcji MHC, czyli nastawienia limfocytów T na rozpoznawanie w przyszłości antygenów prezentowanych im przez własne (autogeniczne) cząsteczki MHC

4. Selekcja negatywna prowadzi do usunięcia tych tymocytów, które zdolne są do rozpoznawania własnych antygenów ze zbyt dużym powinowactwem

5. 2 fazy dojrzewania limfocytów T:

1. faza wczesna- dojrzewające komórki nie mają TCR; zaczyna się od powstania komórek progenitorowych w obrębie szpiku kostnego i obejmuje: zasiedlenie grasicy, ekspansję komórek zasiedlających, ukierunkowanie rozwoju w stronę wczesnych tymocytów, rearanżację genów TCRγ,α i β, selekcję β, wyłącznie alleliczne i izotopowe, podjęcie decyzji rozwojowej w kierunku αβ lub γδ

2. faza późna- tymocyty mają pełną ekspresję receptorów rozpoznających antygen; limfocyty są poddane selekcji pozytywnej i negatywnej

3. 4 populacje komórek:

1. tymocyty potrójnie ujemne (CD4-,CD8-,TCR-)

2. tymocyty podwójnie dodatnie (CD4+,CD8+)

3. tymocyty CD4+ lub CD8+

4. dojrzałe limfocyty

Selekcja pozytywna i negatywna prekursorów limfocytów T w grasicy.

1. odpowiadają za utrzymanie tolerancji wobec własnych tkanek

SELEKCJA POZYTYWNA:

1. limfocyty podwójnie dodatnie (CD4CD8)

2. w tym etapie zostaje sprawdzone czy powstałe receptory TCR są prawidłowo zrearanżowane

3. jeżeli dojrzewający tymocyt nie rozpozna żadnego antygenu to ulega apoptozie- ,,śmierć z zaniedbania”

4. restrykcja MHC: limfocyty, które rozpoznają antygen w restrykcji MHC kl.1 zachowują ekspresję CD8; te które w restrykcji MHC kl.2 pozostają CD4+

5. w selekcji pozytywnej uczestniczą korowe komórki nabłonkowe, które prezentują peptydy

SELEKCJA NEGATYWNA

1. uczestniczą grasice komórki dendrytyczne oraz komórki nabłonkowe rdzenia grasicy

• Główne cząsteczki umożliwiające uniknięcie programowanej śmierci są białka Bcl-2 i Bcl-xL

• We wczesnych etapach przy życiu tymocyty utrzymuje IL-7

• W trakcie selekcji β hamuje apoptozę pre-TCR

• W selekcji pozytywnej i negatywnej hamuje apoptozę ostateczny TCR

• Zbyt silne sygnały pobudzające TCR prowadzą do endocytozy receptorów

• PEPTYDY UCZESTNICZĄCE W SELEKCJI POZYTYWNEJ I NEGATYWNEJ:

1. rozpoznanie różnych peptydów prowadzi do zupełnie odmiennej reakcji limfocytu

2. peptydy mogą pobudzić proliferację i cytotoksyczność limfocytu (agoniści reakcji)

3. zmiana 1 aminokwasu może prowadzić do długotrwałej anergii lub apoptozy (antagoniści reakcji)

4. peptyd może częściowo aktywować limfocyt (częściowy agonista)

5. największy wpływ na selekcję tymocytów ma awidność TCR do peptydów

6. awidność zależy od intensywności sygnałów przekazywanych tymocytowi przez TCR, ma na nią wpływ: liczba rozpoznawanych peptydów i ich powinowactwo do TCR

7. jeśli awidność jest zbyt mała to dochodi do śmierci z zaniedbania

8. jeśli awidność jest zbyt duża to tymocyt ulegnie apoptozie (selekcji negatywnej)

9. jeśli awidność jest optymalna to tymocyt ulega selekcji pozytywnej

• Redagowanie receptorów:

1. zachodzi w obrębie locus TCRα

2. zbyt duża awidność nie musi prowadzić do apoptozy

3. tymocyty, które rozpoznają antygeny ze zbyt dużą awidnością, nie ulegają żadnej selekcji, ale utrzymywana jest wnich ekspresja RAG1 i RAG2, umozliwiająca próbę ponownej rearanżacji genów kodujących TCR

Limfocyty immunologicznie kompetentne.

Zdolne do odpowiedzi immunologicznej, dojrzałe limfocyty T i B, makrofagi, komórki dendrytyczne.????

Immunizacja.

Czynniki decydujące o powstaniu odporności sztucznej nabytej.

• Odporność nabyta sztucznie- szczepienia i podanie Ig

• Uodpornienie czynno-bierne: jednoczesne podanie szczepionki i Ig

• Cel szczepienia: eliminacja drobnoustroju ze środowiska, w którym żyje człowiek, a jeśli jest to niemożliwe, np. ze względu na różne rezerwuary drobnoustroju, wytworzenie tzw.indywidualnej odporności adaptacyjnej wobec określonego drobnoustroju

• Aktywacja komórek immunokompetentnych i wytwarzanie cytokin i swoistych przeciwciał

• Komórki pamięci immunologicznej

• Zabezpieczające stężenie przeciwciał- takie, które chroni przed zakażeniem po kontakcie z przeciętną dawką zakażającą drobnoustroju

• Oprócz stężenia przeciwciał znaczenie ma: przynależność do podklasy, powinowactwo do antygenu, zdolność wiązania dopełniacza, obecność sIgA w błonach śluzowych oraz prawidłowo funkcjonujące mechanizmy pamięci immunologicznej

• Antygeny drobnoustrojów dzielimy na: grasicozależne i grasiconiezależne

• Antygeny grasicozależne: aby wywołać odpowiedź immunologiczną potrzebują aktywacji limfocytów T, które stymulują limfocyty B do wytwarzania przeciwciał; należy do nich większość antygenów bakteryjnych i wirusowych; odpowiedź przeciwko nim jest od urodzenia

• Antygeny grasiconiezależne: stymulują limfocyty B do wytwarzania przeciwciał bez udziału limfocytów T; są to duże cząsteczki z powtarzającymi się determinantami antygenowymi oraz małe cząsteczki białkowe; odpowiedź imm.od 2.roku życia

• Przeciwciała charakteryzują się powinowactwem i awidnością; IgM mają dużą awidność, ale małe powinowactwo

Znaczenie miejsca depozycji antygenu w skuteczności i jakości protektywnej odpowiedzi immunologicznej.

Szczepionka- to produkt pochodzenia biologicznego zawierający substancje zdolne do indukcji określonych procesów immunologicznych warunkujących powstanie trwałej odporności bez wywołania działań toksycznych.

Cechy ,,idealnej szczepionki”.

1. powinna zawierać antygen, który po jednorazowym podaniu indukuje trwałą i swoistą odporność u 100% szczepionych nie wywołując żadnych działań niepożądanych

2. powinna stymulować odpowiednie mechanizmy immunologiczne: pamięć immunologiczną oraz odporność humoralną (zewn.) i komórkową (wewn.)

Drogi podania szczepionek.

1. domięśniowa

2. podskórna

3. doustna

4. śródskórna

Antygeny używane w szczepionkach.

• Atenuacja- proces pozbawienia właściwości chorobotwórczych (zjadliwości, wirulencji) drobnoustroju

• Wybór antygenu zależy od: jego roli w trakcie naturalnego zakażenia, mechanizmów odpowiedzialnych za inwazyjność i zjadliwość drobnoustroju

• Są to zwykle antygeny obecne na powierzchni drobnoustrojów, odgrywające role w początkowych etapach inwazji i proliferacji

Szczepionki swoiste

- mają na celu indukowanie trwałej i specyficznej odpowiedzi immunologicznej przeciw określonemu drobnoustrojowi.

- szczepionki monowalentne (jeden gatunek llub typ drobnoustroju)

- szczepionki poliwalentne- kilka serotypów tego samego gatunku

- szczepionki swoiste skojarzone- zawierają antygeny kilku gatunków drobnoustrojów w jednej strzykawce ( przeciw błonicy, tężcowi, różyczce, odrze, śwince)

- 4 grupy szczepionek:

1. zawierają żywe drobnoustroje o zmodyfikowanych właściwościach

2. zawierają martwe drobnoustroje inaktywowane chemicznie lub termicznie

3. zawierają oczyszczone produkty drobnoustrojów, np. antygeny pow.,inaktywowane toksyny

4. zawierają produkty rekombinowanego DNA (antygen HBs)

- działania zmierzają do uzyskania szczepów niejadliwych na drodze ukierunkowanej manipulacji genetycznej

- w celu zwiększenia immunogenności niektórych antygenów wprowadza się do szczeponki białko nośnikowe np.toksoid tężcowy lub błoniczy

Szczepionki nieswoiste:

- mieszaniny drobnoustrojów lub ich lizaty

- stosowane jako niespecyficzne stymulatory odporności w nawracających lub przewlekłych zakażeniach

- zawierają słabo oczyszczone mieszaniny bakteryjnych białek, peptydów, lipopolisacharydów, kwasów nukleinowych

- mieszaniny są podawane doustnie, donosowo, podskórnie i domięśniowo

- możliwość denaturacji niezidentyfikowanych Ag może stwarzać ryzyko działań niepożądanych

- autoszczepionki- zawiesiny inaktywowanych drobnoustrojów przygotowane na podstawie wyizolowanej od chorego flory bakteryjnej

Skuteczność szczepień.

Skuteczność szczepionki zależy od:

1. rodzaju i dawki użytego antygenu

2. drogi podania

3. zawartości adiuwantu

4. stanu klinicznego, funkcji układu odpornościowego osoby szczepionej

Są 2 rodzaje skuteczności:

1. skuteczność laboratoryjna- oznacza odsetek populacji docelowej, który po podaniu szczepionki posiada mierzalne wskaźniki jej efektu

2. skuteczność kliniczna- odsetek populacji docelowej, który po podaniu szczepionki będzie zabezpieczony przed wystąpieniem aktywnego zakażenia (zachorowania)

Dawka antygenu jest dobierana eksperymentalnie, tak aby uzyskać maksymalną odpowiedź immunologiczną przy najmniejszych działaniach niepożądanych.

Schemat szczepienia (3-stopniowy):

1. szczepienie pierwotne (1-3 dawek)

2. szczepienie uzupełniające (1 dawka)

3. szczepienie przypominające (pojedyncza dawka co kilka lat)

Adiuwanty (rola w procesie immunizacji, przykłady adiutantów).s.362

1. Adiuwanty- substancje o właściwościach nieswoistego modulatora, które zwiększają naturalną zdolność antygenu do wywołania odpowiedzi immunologicznej.

2. Nie mogą wykazywać właściwości antygenowych i stymulować swoistej reakcji immunologicznej, mają za zadanie spowolnić uwalnianie antygenu z miejsca podania oraz wzmocnić odpowiedź poszczepienną

3. Przykłady:

1. Adiutant Freuda (mieszanina oleju parafinowego i prątków gruźlicy)- zbyt toksyczny

2. Związki glinu- fosforan lub wodorotlenek

3. LPS

4. Składnik LPS- lipid A

5. MDP (dipeptyd muramylowy)

6. Segmenty białek porynowych E.coli (aktywatory

7. Syntetyczny kompleks SAF (MDP, Tween20, C3b dopełniacza)

8. ISCOM

9. MF- 59 jest stabilizowaną detergentami emulsją skwalenu w wodzie (szczepionka przeciw grypie)

10. Cytokiny (IL-2,IL-12,TNF,INF-γ)

4. liposomy i polimery mają na celu zwiększenie prezentacji antygenu, pobudzenie odpowiedzi cytotoksycznej limfocytów T

5. polimeryzacja antygenu w postaci kompleksów immunostymulujących (ISCOM) z dodatkiem detergentu zwiększa prezentację antygenu dzięki tworzeniu kompleksów z cząsteczkami cholesterolu

Wskazania i przeciwwskazania do immunizacji czynnej.

Przeciwwskazania:

• u osób ze słabą odpowiedzią poszczepienną po masywnym kontakcie z czynnikiem zakaźnym może dojść do rozwoju objawowego zespołu chorobowego

• brak odpowiedzi poszczepiennej u osób z uwarunkowanymi genetycznie zaburzeniami prezentacji antygenu oraz funkcji limfocytów B

• pierwotne lub wtórne zaburzenia odporności

• niepożądane odczyny poszczepienne

• nadwrażliwość na składnik szczepionki

Wskazania:

• eliminacja lub wyraźne ograniczenie występowania naturalnych zachorowań

Bezpieczeństwo szczepionki zależy od:

- rodzaju antygenu

- adiuwantu

- środków konserwujących

- substancji resztkowych procesu technologicznego

Niekorzystne skutki szczepień.

s.365

Szczepionki DNA.

Szczepionki zawierające DNA przenoszone przez wektory biologiczne (wirusy, bakterie), nagie kwasy nukleinowe oraz przeciwciała antyidiotypowe.

DNA z układem promotora eukariotycznego

Wektor szczepionkowy- atenuowany drobnoustrój, w którego genom wprowadzono gen innego drobnoustroju. S.370

Szczepionki antyidiotypowe- wykorzystuje się przeciwciała monoklinalne do uzyskania przeciwciał antyidotypowych o potwierdzonym działaniu ochronnym, s.370

Poszukiwanie szczepionek nowej generacji.

1. szczepionki śluzówkowe

2. szczepienia w okresie noworodkowym

3. szczepienia w ciąży

4. szczepionki terapeutyczne

5. ,,reverse vaccinology” s.371

Cytometria przepływowa. (FACS)

• immunofluorescencyjna analiza komórek w
  zawiesinie

• immunofenotypizacja czyli badanie fenotypu
  komórek (właściwości powierzchniowych

Ogólna budowa i zasada działania cytometru.

1. moduł ogniskowania hydrodynamicznego - zapewnia laminarny przepływ analizowanych komórek

2. moduł optyczny - zawiera laser argonowy 488 nm (lub kryptonowy 568nm) oraz fotodetektory dla różnych długości fali. Wielkość komórek (FSC) i granularność komórek (SSC)

3. moduł elektromagnetyczny - amplifikacja sygnału na fotopowielaczach

4. komputer - obróbka i archiwizacja danych

Możliwości zastosowania w badaniach naukowych.

Badanie funkcji komórek immunologicznych:

• ocena aktywności fagocytujących komórek żernych
  (monocyty, makrofagi, granulocyty)

• wybuch tlenowy

• profil i ilość cytokin, hormonów, enzymów produkowanych w
  komórce

• ilość komórek martwych - jodek propydyny - wbudowuje się do
  DNA komórek martwych

• ilość DNA i faza cyklu komórkowego - jodek propydyny
  - wbudowuje się proporcjonalnie do ilości DNA

• stosunek DNA : RNA - oranż akrydyny - (DNA - czerwony,
  RNA - zielony)

• badanie zjawiska apoptozy (hipodiploidalna ilość DNA)

Możliwości zastosowania w klinice.

Zastosowanie FACs w diagnostyce chorób:

• niedobory odporności (SCID, AIDS)

• choroby nowotworowe (białaczka, chłoniaki)

• ocena skuteczności leczenia immunosupresyjnego

• zaburzenia cząsteczek adhezyjnych leukocytów (LAD)

• przewlekłe choroby płuc

• Transplantologia

Sortery komórkowe- zastosowanie.

• selekcja plemników zawierających chromosom X
  lub Y (sztuczna inseminacja)

• sortowanie komórek pnia (CD34+) w transplantacjach szpiku

CD

Funkcja

limf. B

limf. T

NK

Monocyty

Neutrofile

Th

Tc

γδ

CD45

przenoszenie sygnału, różne izoformy (45R, 45RO, 45RA, 45RB)

+

+

+

+

+

+ (brak u bydła)

+

CD14

receptor dla LPS

-

-

-

-

-

+

-

CD2

cząsteczka adhezyjna, przenoszenie sygnału

-

+

+

-

+

-

-

CD3

przenoszenie sygnału

-

+

+

+

-

-

-

CD4

cząsteczka adhezyjna, przenoszenie sygnału

-

+ zwykle

- zwykle

-

-

sporadycznie

-

CD5

nieznana

+

+

+

+

-

-

-

CD 8

cząsteczka adhezyjna, przenoszenie sygnału

-

- zwykle

+ zwykle

-

-

sporadycznie

-

CD16

FcγR III

-

-

-

-

+

+

+

CD19

składowa BCR, przenoszenie sygnału

+

-

-

-

-

-

-

CD21

CR2 - receptor C3d, składowa BCR

+

-

-

-

-

po aktywacji

-

CD18

łańcuch β2 integryny

+

+

+

+

+

+

+

CD11a

LFA-1

+

+

+

+

+

+

+

CD11b

część Mac-1

subpopulacje

subpopulacje

subpopulacje

+

+

+

CD11c

subpopulacje

subpopulacje

subpopulacje

głównie makrofagi

WC1

-

-

-

+

-

-

-

---