W ydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii

Metody kontroli stanu higienicznego powierzchni

Monika Śniadowska

Nr albumu 190621

1. Wstęp teoretyczny

"Stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego powierzchni jest ważnym wskaźnikiem czystości urządzeń oraz prawidłowości procesów mycia i dezynfekcji. Ocena stanu higienicznego powierzchni obejmuje: określenie liczby drobnoustrojów, ocenę sanitarną polegającą na kontroli obecności pałeczek Escherichia coli oraz wykrywanie bakterii chorobotwórczych(np. Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes itd.) Istotny jest także sposób poboru materiału do analizy mikrobiologicznej, umożliwiający uzyskanie prób z różnego rodzaju powierzchni."[1]

W celu sprawdzenia stanu higienicznego powierzchni możemy zastosować metody referencyjne oraz metody alternatywne. Sposób w jaki należy wykonać metody referencyjne został opisany w normie PN-ISO 18593:2005. Jako uzupełnienie metod referencyjnych stosuje się metody alternatywne. Jednakże wymagają one korelacji z metodami alternatywnymi.

Do metod referencyjnych zaliczamy:

• metodę wymazów

Metoda stosowana jest do badania powierzchni płaskich i wypukłych, a także do oceny czystości mikrobiologicznej rąk pracowników. Badać możemy obszar ograniczony szablonem, wynik podając w jtk/100cm² jaki i obszar o nieregularnym kształcie. Wówczas wynik testu podajemy w jtk/pow. „Gdy badana powierzchnia została poddana wcześniej procesom mycia i dezynfekcji, zaleca się stosowanie neutralizatorów, które zapobiegają toksycznemu działaniu środków dezynfekcyjnych na mikroorganizmy”[2] Do pobrania próby stosuje się wymazówkę lub tampon z waty, gazy lub gąbki. Pobraną próbę przenosi się do jałowego płynu do wymazów i wytrząsa, ażeby zawiesić w nim drobnoustroje. Uzyskaną zawiesinę wysiewa się na płytki z odpowiednim rodzajem pożywki, w zależności o grupy oznaczanych mikroorganizmów.

• metoda płytek kontaktowych

Metoda stosowana jest do powierzchni gładkich i płaskich. Duże znaczenie ma rodzaj zastosowanej pożywki. W zależności od jej składu możemy oznaczyć ogólną liczbę bakterii, liczbę drożdży i pleśni lub liczbę określonej grupy bakterii. W metodzie tej, podobnie jak w metodzie wymazów istotna jest inaktywacja ewentualnych czynników dezynfekujący na badanej powierzchni poprzez dodanie do pożywki związków neutralizujących. Należy też zwrócić uwagę, ażeby powierzchnia agarowa płytki znajdowała się w możliwie dokładnym kontakcie z badaną powierzchnią.

Do metod alternatywnych zaliczamy:

• metodę luminometryczną

Zasada tej metody polega na oznaczeniu ilości ATP na badanej powierzchni. Oznaczenie wykonuje się korzystając z gotowych „piór” zawierających substrat lucyferynę, enzym lucyferazę i jony magnezu. Ilość reagującego ATP, znajdującego się na badanej powierzchni, odczytujemy za pomocą luminometru, który mierzy ilość fotonów, wydzielających się podczas reakcji oksydatywnej dekarboksylacji lucyferyny, która katalizowana jest przez enzym w obecności enzymu.. Pomiary wykonuje się przy długości fali 562 nm, a wynik wyraża się w tzw. RLU, czyli umownych jednostkach świetlnych. Ze względu na to, iż ATP występuje bardzo powszechnie, przed badaniem trzeba ustalić „tło oznaczenia”, które będzie oznaczać dopuszczalną ilość ATP, jaka może występować na danym surowcu.

• testy białkowe

Służą do wykrywania zanieczyszczeń białkowych na powierzchniach produkcyjnych. Istnieje kilka różnych testów do oznaczania substancji białkowych, np. Orion Clean Card^® PRO, 3M^TM Clean-Trace^TM Surface Protein Plus. W środowisku zasadowym jony Cu²⁺ tworzą kompleksowe połączenia z wiązaniami peptydowymi i redukują się do Cu⁺. Powstałe jony reagują z kwasem bis-cynchinonowym tworząc barwny kompleks. Wynik interpretowany jest w oparciu o skalę uwzględniającą zabarwienie roztworu.

• testy enzymatyczne

Pozwalają na wykrycie charakterystycznych enzymów, a tym samym na detekcję określonych grup drobnoustrojów. Testy enzymatyczne pozwalają uzyskać wynik kontroli już po kilku minutach. Przykładem testu białkowego jest System HY-RiSE^®. Metoda ta opiera się na oznaczaniu obecności NAD⁺ i NADP⁺. Im ciemniejsze zabarwienie paska testowego, tym większe zanieczyszczenie na badanej powierzchni materiałem biologicznym.

W kwietniu 2004 r., w ramach podejścia „od pola do stołu” przyjęte zostały nowe ramy ustawodawcze znane jako pakiet higieniczny.

Pakiet ten tworzą:

• Rozporządzenie (WE) nr 852/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. w sprawie higieny środków spożywczych,

• Rozporządzenie (WE) nr 853/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. ustanawiające szczególne przepisy dotyczące higieny w odniesieniu do żywności pochodzenia zwierzęcego

• Rozporządzenie (WE) nr 854/2004 Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. wprowadzające wspólnotowe ramy dla urzędowych kontroli w odniesieniu do produktów pochodzenia zwierzęcego przeznaczonych do spożycia przez ludzi, które ustanawia również szczegółowe zasady dotyczące świeżego mięsa, małży, mleka i przetworów mlecznych

• Pakiet nakłada odpowiedzialność za higienę środków spożywczych bezpośrednio na różne podmioty należące do łańcucha żywnościowego, poprzez samoregulujący się system wykorzystujący metodę HACCP („Analiza zagrożeń i krytycznych punktów kontroli”), monitorowany poprzez kontrole urzędowe, które muszą być przeprowadzane przez właściwe organy, jak określono w rozporządzeniu nr 854/2004 zmienionym rozporządzeniem nr 882/2004 Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r.

2. Materiały i metody

   1. Opis miejsca poboru materiału

Miejscem poboru materiału do badań było laboratorium znajdujące się w Instytucie Technologii Fermentacji i Mikrobiologii na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej.

2. Pożywki

Przeprowadzając analizy kontrolne stanu higienicznego powierzchni płaskich zastosowano pożywkę PCA, stałą nieselektywną, używaną do określania ogólnej liczby bakterii. Wykorzystano również pożywkę VRBD, stosowaną do oznaczania liczby bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

3. Metody

   1. Metody referencyjne

• Metoda wymazów

Stosując tą metodę w pierwszej kolejności wyjęto z opakowania wyjałowiony wcześniej szablon ograniczający powierzchnię 25 cm², który następnie przyłożono do badanej powierzchni. Przygotowaną wymazówkę zamoczono w 20 ml roztworu soli, a nadmiar płynu odciśnięto o ściankę naczynia. Wilgotną wymazówką dokładnie przetarto całą powierzchnię ograniczoną szablonem i przeniesiono do butelki z płynem po czym wytrząsano przez chwilę w celu wypłukania bakterii. Kolejną sterylną wymazówką osuszono badaną powierzchnię i ponownie wytrząsano przez ok. 2 minuty. W kolejnym etapie wymazówki usunięto, a z otrzymanej zawiesiny wykonano posiewy wgłębne po 1 ml na pożywkę PCA i VRBD, każdy w dwóch powtórzeniach. Wysiane próby opisano i inkubowano odpowiednio w temperaturze 30°C i 37°C przez 48-72h. Po inkubacji policzono wyrosłe kolonie i uwzględniając wykorzystaną objętość płynu oraz pole ograniczonej powierzchni, obliczono ogólną liczbę drobnoustrojów.

• Metoda płytek kontaktowych

Płytki kontaktowe po otworzeniu zostały przyłożone do badanej powierzchni. Dociśniętą płytkę przytrzymano przez 5-10sekund, a następnie zamknięte, oznakowane i inkubowane w warunkach odpowiednich dla oznaczanej grupy drobnoustrojów. Wyrosłe po inkubacji drobnoustroje policzono, uwzględniając powierzchnię płytki(25 cm² i 28 cm²) podano ogólną liczbę drobnoustrojów występujących na analizowanej powierzchni.

2. Metody alternatywne

• Testy łopatkowe

Test łopatkowy pokryty pożywką po obu stronach i znajdujący się w pojemniku zakręcanym korkiem dociśnięto do badanej powierzchni. Po pobraniu próby umieszczono go ponownie w pojemniku i inkubowano w odpowiednich dla określanej grupy drobnoustrojów warunkach. Wyniki odczytano w oparciu o załączone wzorce odczytu, uwzględniając powierzchnię płytki i podano ogólną liczbę drobnoustrojów.

• Metoda luminometryczna systemu HY-LiTE^®

W celu pobrania wymazu, wymazówkę zwilżono płynem do przemywania, a następnie zrobiono wymaz z 25 cm², wykorzystując do tego szablon. Wymazówkę wypłukano w roztworze do przemywania i wyrzucono. W kolejnym etapie pobrano próbkę przy użyciu pióra HY-LiTE^®. W tym celu pióro zanurzone zostało w roztworze przemywającym. Następnie końcówką pióra uderzono, aby wprowadzić próbkę do kuwety. Części pióra przekręcono tak, ażeby znajdujące się w nim odczynniki reagujące wymieszały się z próbką. Po dokładnym wstrząśnięciu pióro wprowadzono do luminometru i po ok. 15 sekundach od zamknięcia pokrywy odczytano wyświetlony wynik, który wyrażono w umownych jednostkach świetlnych RLU.

• Metoda systemu HY-RiSE^®

W celu pobrania próby, z opakowania jednostkowego wyjęto pasek testowy. Pole reakcyjne pokryto substancją zwilżającą i tak przygotowanym paskiem przeciągnięto po badanej powierzchni przez ok 30 cm. W przypadku, gdy mamy do czynienia z powierzchniami nierównymi, próbki pobiera się z minimum 10 różnych miejsc. Następnie na obszar testowy paska naniesiono kroplę roztworu substratu i kroplę roztworu enzymu. Tak przygotowany pasek umieszczono ponownie w opakowaniu i inkubowano przez 5 minut w temperaturze otocznia. Po tym czasie określono kolor obszaru reakcyjnego, odnosząc się do skali wzorcowej.

• Metoda 3M^TM Clean-Trace^TM Surface Protein Plus( Noack)

Po wyjęciu wymazówki z opakowania jednostkowego, pobrano próbkę stosując substancję zwilżającą w przypadku badania suchej powierzchni. Wymazówkę umieszczono ponownie w opakowaniu jednostkowym, tak aby znajdujące się w niej odczynniki reagujące mogły się uwolnić. Próbkę energicznie wymieszano i pozostawiono na 10 minut w temperaturze otocznia. Po tym czasie dokonano porównania ze skalą znajdującą się na probówce i zinterpretowano wynik.

• Orion Clean Card^® PRO(Noack)

Test wyjęto z pudełka, a badaną powierzchnię zwilżono sterylną wodą i przetarto testem. Po upływie 30 sekund oczytano wynik i dokonano oceny w oparciu o natężeniu zabarwienia. Im intensywniejszy kolor zielony testu, tym bardziej zanieczyszczona jest powierzchnia substancjami białkowymi.

3. Wyniki

Tabela 1. Zestawienia wyników analizy czystości mikrobiologicznej dla badanych powierzchni

Miejsce analizy	OGÓLNA LICZBA DROBNOUSTROJÓW				Metoda luminometryczna [RLU/25cm^2]
	Metoda wymazów [jtk/25cm^2]	Metoda płytek kontaktowych [jtk/25cm^2]	Testy łopatkowe [jtk/10cm^2]	Metoda płytek kontaktowych [jtk/28cm^2]
Parapet	2,2*10^2	49	14	61	240
Szafka I	1,4*10^2	2	nieobecne	53	76
Szafka II(drzwi)	20	0	1	125	450
Szafka III	40	1	3	25	74
Pojemnik na ręczniki	5,5*10^2	22	3	4,5*10^2	4400
Drzwi	3,4*10^3	1	3	5	66
Stół	10	41	19	114	71

Analizując wyniki przedstawione w tabeli w oparciu o metodę wymazów możemy stwierdzić, że najbardziej zanieczyszczoną powierzchnią były drzwi. Metoda płytek kontaktowych o powierzchni 25cm² wskazuje parapet jako najbardziej brudną powierzchnię, płytki kontaktowe o powierzchni 28cm² pojemnik na ręczniki. W przypadku testów łopatkowych największe zanieczyszczenie odnotowano na stole.

W przypadku metody luminometrycznej trudno stwierdzić poziom zanieczyszczenia badanych powierzchni, gdyż nie wyznaczono tła oznaczenia koniecznego do porównania wyników

Biorąc pod uwagę skalę ocen czystości powierzchni wg Draft European Standard, trudno dokonać oceny stanu mikrobiologicznego czystości badanych powierzchni, gdyż uwzględnia ona liczbę drobnoustrojów w przeliczeniu na powierzchnię 100 cm².

W tabeli nie przedstawiono wyników dla bakterii z grupy Enterobacteriaceae, ponieważ w żadnej z metod nie odnotowano wzrostu tych bakterii.

Wykres 1. Wykres zależności między wynikami uzyskanymi metodą wymazów a metodą płytek kontaktowych.

Dla tej zależności współczynnik korelacji r wynosi 0,292062, co wskazuje na korelację dodatnią, jednakże jest to słaba zależność.

Wykres 2. Wykres zależności między wynikami uzyskanymi metodą wymazów a metodą luminometryczną.

Dla tej zależności współczynnik korelacji r wynosi 0,053851, co wskazuje na korelację dodatnią i brak związku liniowego pomiędzy otrzymanymi wynikami.

Wykres 3. Wykres zależności między wynikami uzyskanymi metodą płytek kontaktowych oraz metodą luminometryczną.

Dla tej zależności współczynnik korelacji r wynosi 0,111803, co wskazuje na korelację dodatnią i brak związku liniowego pomiędzy otrzymanymi wynikami.

Analizując powyższe wykresy możemy stwierdzić, że największa zależność występuje pomiędzy wynikami uzyskanymi metodą wymazów, a metodą płytek kontaktowych.

Niskie wartości współczynnika korelacji mogą być spowodowane:

• różnym odzyskiem drobnoustrojów(metoda poboru ma duże znaczenie)

• obecnością innych substancji pochodzenia organicznego

• różnym stopniem zanieczyszczenia badanych powierzchni

4. Wnioski

• Najbardziej zanieczyszczonym miejscem był pojemnik na ręczniki.

• Charakteryzowane powierzchnie cechuje różny stopień zanieczyszczenia.

• Na żadnej powierzchni nie zaobserwowano wzrostu bakterii z grupy Enterobacteriaceae.

• Otrzymane wyniki wskazują na korelację słabą lub jej brak.

5. Literatura

[1,2]Libudzisz Z., Kowal K. Żakowska Z. (red): Mikrobiologia techniczna. t. II. Mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcja żywności. PWN, Warszawa, 2008, str. 448

[3] Kręgiel D., (2011). Zastosowanie luminometrii w badaniach adhezji drobnoustrojów do powierzchni abiotycznych. Laboratoria. Aparatura Badania, 16, 10-14.

[4] Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych. Dz. U. UE L 338/1.

[5] PN-ISO 18593:2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalne metody pobierania próbek z powierzchni z użyciem płytek kontaktowych i wymazów.

[6] http://www.europarl.europa.eu/atyourservice/pl/displayFtu.html?ftuId=FTU_5.5.5.html

[6] http://labnews.pl/informacje/Referencyjne-i-alternatywne-metody-kontroli-stanu-higienicznego- powierzchni,112

[7] http://www.food.rsi.org.pl/dane/spozywka.pdf