BADANIA MUTACJI W DIAGNSTYCE NOWOTWORÓW

Badania:

• badania chromosomów

1. metody genetyki klasycznej (prążkowanie)

2. cytogenetyka molekularna (FISH, MC-FISH, CGH)

• badania molekularne

1. poszukiwanie mutacji: PCR, SSCP...

2. sekwencjonowanie genu lub fragmentu genu

• badanie szczególnych zdarzeń w genomie

1. MSI

2. LOH

• SNP (single nucleotide polymorphism)

• Mikroczipy (microarrays)

1. DNA

2. Białkowe

BRCA1

• chromosom 17q21

• 100 k par zadad

• 24 eksony

• duże białko 1863 aa

• funkcje:

• aktywator transkrypcji

• rola w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA (DBS)

• uczestniczy w remodelowaniu chromatyny

• mutacje de novo -bardzo rzadko(przyczyna ęfektu założyciela)

• rodzaje mutacji(bardzo duże spektrum):

• 5382insC (najczestsza)

• C61G

• 4153delA

• 185delAG

• 13,9% przypadkow klinicznych w Polsce ma mutację BRCA1

• badania:

• sekwencjonowanie

• long PCR , Soutern-RFLP, SSCP

• ACRS-PCR, ASA -PCR

• test BRCA1 (mulitiplex PCR)-z krwi obwodowej ,szybki i skuteczny

• wskazania do badań - stwierdzenie u krewnych I i II stopnia:

• raka piersi/jajnika

• zachorowania przed 50 r.ż na raka piersi lub w dowolnym wieku na raka jajnika

BRCA2

• chromosom 13q12-13

• 26 eksonów

• białko 3418 aa

• brak „hot spots”(trzeba sekwencjonowac)

• funkcje:

• aktywator transkrypcji

• wykazuje aktywność acylotransferazy histonów

ACRS-PCR (ang.artificial creating restriction site -PCR)

• sztuczne wytworzenie miejsca restrykcyjnego

• sekwencje które chcemy badać byłyby palindromowe, gdyby nie 1 nukleotyd lub kilka

wt

naprawa

mut

enzym nie trawi

ASA-PCR (ang.allele-specific amplification -PCR)

• wykrywanie mutacji przy pomocy specyficznych nukleotydów

• oprócz starterów flankujących(rewers i foward) stosuje się

• starter w pełni komplementarny do allela z mutacją (foward)

• starter w pełni komplementarny do allela niezmienionego(foward)

• startery sa tak zlokalizowane ze powstaja różne produkty

• 2 h

wt

mut

MSH2, MLH1

• geny naprawy DNA

• mutacje w genie MSH2

• transwersja A na T w intronie 5 (50%)

• mutacje w genie MLH1

• tranzycja A na G w intronie 18

• 90% mutacji dziedzicznych w HNPCC (3-6% nowotworów jelita grubego)

• inne geny których mutacje są odpowiedzialne za HNPCC to :

• MSH3,

• MSH6,

• PMS1,

• PMS2

• badania:

• test nosicielstwa mutacji MSH2, MLH1

• immunohistochemiczne metody (ekspresja bialka)

• sekwencjonowanie

• wskazania do wykonania:

• podejrzenie o HNPCC

• kryteria Amsterdamskie

LOH = utrata heterozygotyczności (ang.Loss of Heterozygosity)

• wiąże się z utratą jednego z dwóch różnych alleli tego samego genu (heterozygota), co prowadzi do hemizygotyczności (obecność pojedynczego allelu) danego genu.

• odgrywa ważną rolę w genetycznej etiologii nowotworów, gdyż

• delecja jest jednym z głównych mechanizmów odpowiedzialnych za utratę funkcji genów supresorowych i mutatorowych.

• geny obu tych grup mają recesywny efekt działania na poziomie komórkowym, tzn. mutacje muszą dotyczyć obu alleli danego genu, aby doszło do jego inaktywacji.

• odgrywa kluczową rolę zarówno w inicjacji procesu nowotworowego, jest też obserwowane we wczesnych i zaawansowanych stadiach karcinogenezy.

• badanie LOH

• polimorfizm długości markerów mikrosatelitarnych

Polimorfizm długości markerów mikrosatelitarnych w ocenie LOH

• wykorzystanie polimorficznych markerów mikrosatelitarnych

• 1-6 nukleotydów

• równomiernie rozproszone w genomie, np. (CA)n,

• zidentyfikowanych ponad 5000

• allel matczyny i ojcowski - heterozygoty informatywne

• markery informatywne, tzn. takie które występują w komórkach prawidlowych w postaci heterozygotycznej (posiadają różne allele w badanym locus).

• DNA guza jest amplifikowane ze starterami (najczęściej znakowanymi fluorescencyjnie) swoistymi dla wybranych markerów mikrosatelitarnych.

• otrzymane produkty są następnie

• rozdzielane na żelu (najczęściej poliakrylamidowym) i uwidaczniane za pomocą barwienia bromkiem etydyny, srebrzeniem, audioradiografią

• analizowane w sekwenatorach DNA z użyciem markerów fluorescencyjnych.

• wynik badania:

• w żelu poliakrylamidowym heterozygota rozpoznawana jest na podstawie obecności dwóch prążków

• w automatycznym sekwenatorze na podstawie występowania dwóch krzywych dla badanego locus

• analiza polegaja na porównaniu markerów mikrosatelitarnych pomiędzy DNA wyizolowanym z tkanki nowotworu a DNA tkanek prawidłowych (głównie z krwi obwodowej), pochodzących od tego samego pacjenta.

• LOH rozpoznawana jest jako utrata jednego z prazkow w DNA guza w porównaniu z DNA komórek prawidłowych.

• analiza LOH w sekwenatorze polega na porównaniu pola pod krzywymi odpowiadającymi allelom badanego markera mikrosatelitarnego.

• [N1/N2]/[T1/T2] - częściowa redukcja (co najmniej 20%) ilości jednego z alleli tkanki nowotworowej w stosunku do tkanki referencyjnej

• całkowity LOH - rzadko

MS = mikrosatelity = sekwencje mikrosatelitarne

• są to krótkie sekwencje DNA,

• składają się z tandemowo ułożonych, powtarzających się motywów

• motywy te sa 1-6 nukleotydwe (mono, di, tri, tetra, penta, sexta - nukleotydowe).

• są równomiernie rozmieszczone w genomie, zarówno w obszarach kodujacych, jak i niekodujących

• zmienne

MSI = niestabilność mikrosatelitarna (ang. microsatellite instability)

• zmiana długości (wielkości) alleli na skutek zwiększenia lub zmniejszenia liczby powtórzeń nukleotydowych

• cecha fenotypu mutatorowego (Replication Error Phenotype; RER).

• nowotwory RER+

• niepolipowatym raku jelita grubego(92%)

• sporadyczny rakiem jelita grubego (15%)

• 2-64% innych nowotworów zarówno dziedzicznych, jak i sporadycznych.

• do oceny MSI

• polimorfizm długości markerów mikrosatelitarnych

Polimorfizm długości markerów mikrosatelitarnych w ocenie MSI

• obecnie rekomendowane jest stosowanie 5 markerów mikrosatelitarnych:

• 2 mononukleotydowych

• 3 dinukleotydowych

• rozpoznawana na podstawie każdej zmiany długości allelu, bedacej wyrazem zmiany liczby jednostek powtarzalnych w mikrosatelitach w komórkach guza w porównaniu z tkanką prawidłową.

• nieswoista utrata heterozygotycznosci, wyrazajaca sie utrata jednego z dwoch alleli danego markera w mniej niz 20% badanych guzow, jest traktowana jako wyraz MSI.

• analizę niestabilności mikrosatelitarnej w automatycznym sekwenatorze można przeprowadzać zarówno u konstytucjonalnych homozygot, jak i heterozygot w odniesieniu do badanego markera.

mikroczipy = mikromacierze (ang.microarrays)

• zaleta jest olbrzymia ilość informacji jaką dostarcza to badanie

• pozwala na wykrycie naddatków lub ubytków materiału genetycznego w badanym DNA nowotworowym




DNA guza

DNA kontrolne








mRNA mRNA





odwrotna transkrypcja

znakowanie

cDNA cDNA

hybrydyzacja

(płytka mikroczipowa)

□□□□□□□□

□ czerwono -zielony - norma

□ nadmiar czerwonego -naddatek (amplifikacja) w komórkach guza

□ nadmiar zielonego- delecja w komorkach guza

□ brak barwy - brak transferuslepa próba