Nowe kierunki w

diagnostyce nowotworów

u dzieci

Prof. dr hab. n. med. Maryna

Krawczuk Rybak

Klinika Onkologii Dziecięcej

I

1. Cytometria przepływowa

–

diagnostyka białaczek

–

choroba resztkowa

–

oporność wielolekowa

2. FISH
3. PCR/RT-PCR
4. Microchips array

II Medycyna nuklearna

•

Scyntygrafia MIBG, Ga

67

(gal)

•

PET - CT

Metody stosowane w diagnostyce

nowotworów u dzieci

•

mikroskopia świetlna,elektronowa

•

immunofenotypowanie

•

cytogenetyka

•

biologia molekularna

•

analiza biochemiczna

•

Immunofenotypowanie

badanie antygenów przy zastosowaniu specyficznych przeciwciał

–

metoda ELISA

–

metoda cytometrii przepływowej

–

metoda radioimmunologiczna

Teoria Watsona i Cricka

• DNA

-

2 śrubowato oplecione nici tworzące

strukturę podwójnej helisy. Każda z nici
zbudowana jest z 4 rodzajów nukleotydów.

• Hybrydyzacja

-

tworzenie się par

dwóch komplementarnych nukleotydów

Ograniczenia metody cytogenetycznej:

•

trudność w uzyskaniu płytek metafazalnych

•

zła jakość chromosomów

•

ograniczona rozdzielczość prążków

•

złożone rearanżacje kariotypowe

•

FISH:

–

możliwość oceny w jądrach interfazalnych

–

szybka analiza dużej liczby komórek (np. w ocenie choroby resztkowej,
w ocenie odsetka komórek z aberracjami chromosomalnymi

–

konieczność posiadania odpowiednich sond

• FISH

-

fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

–

wykrywanie specyficznych sekwencji DNA w preparatach
cytologicznych poprzez tworzenie kompleksu DNA
chromosomowego ze specyficzną sondą molekularną

• sonda

- fragment DNA , o określonej sekwencji

nukleotydów

•

rodzaje sond:

– centromerowe (badania zmian liczbowych chromosomów)
– malujące
– specyficzne dla określonych genów

•

M - FISH

•

SKY (spectral karyotyping)

–

zastosowanie >24 kolorów do jednoczesnej
analizy wszystkich chromosomów

• PCR

-

umożliwia in vitro amplifikację wybranych sekwencji DNA przy

użyciu polimerazy DNA i syntetycznych
oligonukleotydów (tzw. starterów)
komplementarnych do końców wybranych
sekwencji DNA

• RT - PCR

(reverse transcription PCR) -

modyfikacja reakcji PCR

do wykrywania i analizy cząsteczek RNA. Zasadniczym etapem reakcji
jest odwrotna transkrypcja tj. synteza cDNA na matrycy RNA w
obecności odpowiednich primerów i enzymu odwrotnej
transkryptazy

•

Wysoka czułość metod: wykrycie 1 komórki nowotworowej na
10

3

- 10

7

prawidłowych komórek

PCR, RT - PCR

analiza DNA lub RNA tkanki guza

•

diagnoza

•

prognoza

•

histogenetyka



Wykrywanie:

•

śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)

•

ekspresji genów związanych z nowotworem

•

rearanżacji genów immunoglobulin

•

amplifikacji onkogenów, np. myc - N

•

genu WT1, WT2

•

mutacji genu supresorowego p53

•

wysoka czułość metody

•

bardzo czuła i bardzo szybka diagnoza

•

monitorowanie choroby

•

wykrywanie choroby resztkowej przy remisji cytomorfologicznej

Mikromacierze (chipy DNA)

•

równoczesne prowadzenie reakcji hybrydyzacji poprzez sondy DNA
(każda o innej sekwencji i umieszczona w określonym miejscu płytki)

–

ocena obecności genu/genów

–

określenie kolejności zasad w niezsekwencjonowanych fragmentach DNA

–

określenie ekspresji (aktywności) tysięcy genów

•

badanie ludzkiego genomu

•

szybka diagnostyka infekcji (bakteryjnych, wirusowych)

•

diagnostyka chorób metabolicznych

•

diagnostyka chorób
uwarunkowanych genetycznie

•

badanie mutacji będących
podstawą karcinogenezy

•

odkrywanie nowych leków

•

badanie profilu ekspresji nowotworów

Diagnostyka białaczek

•

morfologiczna - klasyfikacja FAB

•

cytochemiczna

•

immunofenotypowanie

–

metoda Elisa

–

metoda cytometrii przepływowej z użyciem
przeciwciał monoklonalnych dwu-, trój-,
czterokolorowych

–

określa:

•

pochodzenie komórek blastycznych

•

stopień ich dojrzałości i zróżnicowania (stadium
rozwojowe, na którym dany limfoblast uległ
transformacji nowotworowej)

•

zawartość DNA w komórce (ploidia)

L1

L2

L3

Poszerzenie diagnostyki

morfologicznej i cytochemicznej

•

przy ujemnych barwieniach, np. PAS - ujemnych
ALL - możliwość błędnego zakwalifikowania

•

wykrywanie koekspresji (dwuklonalności)

•

wykrywanie białaczek mieszanych (15-20% AML
wykazuje koekspresję antygenów limfoidalnych)

•

możliwość określenia linii, do której należą
limfoblasty (T, B, NK)

•

hiperploidia (index DNA 1,16 i 1,6 - dobre

rokowanie natomiast ID1,6 prognoza zła

•

hipoploidia - rokowanie złe

Znaczenie prognostyczne

określenia immunofenotypu

ostrych białaczek

•

Dostosowanie protokołu chemioterapii do typu
komórek nowotworowych

•

B- ALL - duże dawki ARA - C, cyklofosfamidu

•

brak ekspresji CD 10 - gorsze rokowanie

•

ekspresja CD 34 - dobre rokowanie

•

gorsze efekty w T - ALL - intensyfikacja
leczenia

CD 34

Oporność wielolekowa

(MDR - multidrug

resistance

)

DNA

topoizomeraza

II

naprawa DNA

LPR, PGR, MPR

(1)

(1)

(2)

(4,5)

(6)

(3)

METABOLIZM

LEKU

LEK

GLUTATION

APOPTOZA

białka
regulujące
apoptozę

MDR - diagnoza

1) Cytometria przepływowa

•

Przeciwciała monoklonalne znakowane
fikoerytryną skierowane przeciwko
zewnątrzkomórkowej cząsteczce P - gp

(P-

glikoproteina)

2) RT - PCR - ocena mRNA białka P - gp

Remisja

•

kryterium cytomorfologiczne

-

obecność 1-5% blastów (czułość 10

-

1

-10

-2

)

•

choroba resztkowa

- obecność

populacji komórek białaczkowych między
populacją komórek o prawidłowym
fenotypie poniżej wykrycia w badaniu
morfologicznym

0

10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

10

-7

1

1 2 3 4

czułość badania
cytomorfologicznego

czułość immunofenotypizacji
i techniki PCR

,,wyleczenie”

okres obserwacji

I - Rx Con - Rx / M - Rx

Wykrywanie / monitorowanie

choroby

resztkowej

1)

Immunofenotypowanie

:

wykrywa 0,01% komórek białaczkowych (10

-3

- 10

-

4

)

•

nieprawidłowa ekspresja antygenów

•

koekspresja antygenów innych linii
hematopoetycznych (w ALL pre B możliwość
koekspresji linii T - komórkowej, mieloidalnej)

•

asynchroniczna rozwojowo ekspresja antygenów
(nadmierna ekspresja, brak ekspresji)

•

ekspresja ektopowych antygenów (obecność
antygenów poza ich typową lokalizacją)

Wykrywanie / monitorowanie

choroby

resztkowej cd.

2) Łańcuchowa reakcja polimerazy
(PCR)

•

czułość metody 10

-4

- 10

-6

•

wykrywa:

•

specyficzne transkrypty fuzyjne,
np. BCL - ABL, E2A - PBX1,
TEL - AML1

•

specyficzne immunoglobuliny IgH
i rearanżacje genu TCR
(T - cell receptor)

Znaczenie wykrywania MRD

(minimal residual

disease)

•

określenie wstępnej odpowiedzi na leczenie,
niski poziom MRD lub jej brak - dobre
rokowanie

•

MRD po indukcji remisji jest najważniejszym
czynnikiem rokowniczym (niezależnie od
innych czynników ryzyka jak wiek, liczba blastów,
immunofenotyp, obecność aberracji
chromosomalnych w czasie rozpoznania,
odpowiedź na prednison)

•

ocena prawdopodobieństwa wznowy po
leczeniu, po przeszczepie szpiku

Aberracje chromosomalne w

nowotworach -informacja o

potencjalnym mechanizmie

patogenetycznym choroby

•

aktywacja protoonkogenu - np. dostanie się
onkogenu c-myc pod kontrolę genu regulującego
ekspresję łańcucha ciężkiego immunoglobulin
- rozwój chłoniaka Burkitta lub ALL
- L3; cytogenetycznie translokacja t (8;14)

•

fuzja genów - wytworzenie aktywnego produktu
białkowego zaangażowanego w proces
powstawania nowotworu,
np. białkowe produkty
genów fuzyjnych w wyniku
translokacji t (9;22), t (8;21)

C-myc

Chromosom Philadelphia

Znaczenie aberracji

cytogenetycznych: w

białaczkach

•

powyżej 50 chromosomów u 25-50 % ALL -
dobre rokowanie

•

82-94 (około - tetraploidia) - 1% - złe
rokowanie

•

47-50 chromosomów - pośrednie rokowanie

•

pseudodiploidia (strukturalne rearanżacje),
46 chromosomów - rokowanie złe

•

diploidia - rokowanie pośrednie

•

hypoploidia - rokowanie złe

• Translokacje:



 ALL

–

t (1;19) - 5-6%. E2-PBX1, hyperleukocytoza,
wysokie wartości LDH,DI 1,16, rokowanie złe

–

t (9;22) - około 5%, BCR-ABL, rokowanie złe

–

t (4;11) - 2-5%, AF4-MLŁ rokowanie złe

–

t (8;14) - około 2% TCR alfa - c-myc



 AML

–

t (8;21) M2-AML,często pozaszpikowa lokalizacja ,
korzystna rokowniczo

–

t (15;17) w M3 - gen fuzyjny pml/rara koduje białko
nieprawidłowego receptora kwasu retinowego

W guzach litych:

•

mięsak Ewinga - t (11;22)

•

retinoblastoma - chromosom 13q14 - locus Rb

•

guz Wilmsa - anomalie chromosomu 11,12,1

•

neuroblastoma - delecja ramienia krótkiego
chromosomu 1, amplifikacja onkogenu n - myc

produkt genu WT1

Nowotwory drobno -

okrągłokomórkowe u dzieci

1. PNET (kości i tkanki miękkie)

a) sarcoma Ewing
b) peripheral neuroepithelioma
c) guz Askina
d) PNET kości
e) pozakostny s. Ewing
(neuralny)

2. Guzy kości

a) osteosarcoma
b) chondrosarcoma
c) prymitywny mięsak kości

3. Guzy tkanek miękkich

a) RMS
b) ppozakostny mięsak Ewing
(nie - neuralny)

4. Neuroblastoma

5. Pozawęzłowy chłoniak

immunofenotypowanie

1.

Neurospecyficzna enolaza

(neuroepitelialne guzy, mięśnie)

2.

Leu 7 - guzy pochodzenia neuralnego

3.

Neurofilamenty - guzy pochodzenia neuralnego

4.

Desmina - guzy pochodzenia miogennego

5.

Aktyna - guzy pochodzenia miogennego

6.

Wimentyna - guzy mezenchymalne, mięsaki,

chłoniaki

7.

Keratyna - guzy zarodkowe, synowiosarcoma,

neurofibrosarcoma

8.

MIC2 - s. Ewing, PNET

cząsteczka keratyny

Badanie radiologiczne (rtg, CT, usg)

•

ocena anatomiczna

•

charakterystyka zaburzeń strukturalnych

Badanie scyntygraficzne

•

zlokalizowanie miejsca przemian
metabolicznych

Scyntygrafia z Ga

67

 

po terapii chłoniaków

•

ocena masy resztkowej guza

•

diagnostyka wznowy
po okresie remisji

•

ocena reakcji po leczeniu

Scyntygrafia MIBG

•

diagnostyka

•

monitorowanie terapii

•

diagnostyka wznowy
nowotworów układu
neuroendokrynnego

PET/CT

•

połącznie metody badania
obrazowego z lokalizacją
przemian metabolicznych w
tkance (badanie anatomiczno
- czynnościowe)

•

dokładna ocena lokalizacji i
identyfikacja rodzaju patologii
na poziomie molekularnym

•

dokładny staging zmiany
nowotworowej

PET/CT

•

izotopy pozytronowe (18F-FDG), fluorine-IP,
fluorodeoksyglukoza

•

18F - FDG jest akumulowana wewnątrzkomórkowo
następnie ulega fosforylacji (przez heksokinazę) do
18F - FDG - fosforanu i pozostaje w komórce

•

połączenie wizualne obrazu, a także
radioznakowanego analogu glukozy