Techniki molekularne stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej

280

Molecular methods applied in microbiological diagnostic

Izabela Mecler

, Urszula Nawrot

Oddzia³ Analityki Medycznej Wydzia³u Farmaceutycznego AM we Wroc³awiu (student)

Katedra i Zak³ad Mikrobiologii AM we Wroc³awiu

W ostatnich latach obserwuje siê bardzo szybki rozwój technik molekularnych, które znajduj¹ zastosowanie w rozlicznych dzia³ach medycyny,
w tym w diagnostyce mikrobiologicznej. W przewa¿aj¹cej wiêkszoœci nowe techniki opieraj¹ siê na reakcji PCR, która pozwala w krótkim czasie na
uzyskanie milionowych kopii dowolnego fragmentu genomu. Postêp w dziedzinie biologii molekularnej przejawia siê w ci¹g³ym udoskonalaniu
technik pozwalaj¹cych na detekcjê i charakterystykê produktu uzyskanego w PCR, s¹ to np. analiza restrykcyjna, analiza przyrostu produktu w cza-
sie rzeczywistym (Real-time PCR), analiza sekwencji. Cech¹ wspóln¹ metod molekularnych jest ich wysoka czu³oœæ i specyficznoœæ oraz stosunko-
wo krótki czas potrzebny do uzyskania wyniku. Wszêdzie tam, gdzie klasyczne metody diagnostyczne s¹ zbyt czasoch³onne i ma³o precyzyjne, po-
szukuje siê metod molekularnych. Dotyczy to równie¿ zaka¿eñ wywo³anych przez grzyby. Celem niniejszej pracy jest zaznajomienie czytelnika
z podstawowymi technikami molekularnymi, stosowanymi w mikrobiologii.

S³owa kluczowe: PCR, analiza fragmentów restrykcyjnych, analiza sekwencji DNA, analiza przyrostu produktu reakcji PCR w czasie rzeczywistym

The significant development of molecular techniques has been observed in last decades. Most of molecular methods based on the polymerase
chain reaction (PCR), which enable amplification of millions copies of any fragment of the genome. The classical methods of detection and charac-
terization of PCR product has been improved and the new ones has been invented, e.g. restriction fragment length analysis with the use of capilla-
ry electrophoresis, quantitative PCR (Real-time PCR), automated sequencing, and the others. Molecular methods characterize high sensitivity and
specificity, as well as relatively short performance time. Whenever the classical diagnostic methods are not enough precise and strongly time-
consuming the application of molecular methods has been expected. In this paper we shortly described the most popular molecular methods,
which are in use in routine and research microbiological laboratories.

Key words: PCR (Polymerase chain reaction), RFLP (Restiction Fragments Length Polymorphism), DNA sequence analysis, Real-Time PCR

Wprowadzenie

W ostatnim czasie obserwuje siê szybki rozwój metod mole-

kularnych i ich szerokie zastosowania w wielu dziedzinach me-
dycyny, w tym w mikrobiologii. Wykrycie i identyfikacja wielu
drobnoustrojów metodami tradycyjnymi bywa trudne, czaso-
ch³onne, a czêsto wrêcz niemo¿liwe. Istnieje zatem potrzeba
opracowania precyzyjnych metod diagnostycznych, które
umo¿liwi¹ zarówno zidentyfikowanie ju¿ wyhodowanego drob-
noustroju, jak i jego detekcjê i identyfikacjê bezpoœrednio
w próbce klinicznej, z pominiêciem etapu hodowli.

Najnowsze techniki stosowane w diagnostyce mikrobiolo-

gicznej w przewa¿aj¹cej wiêkszoœci opieraj¹ siê na reakcji PCR.
Z powodzeniem stosowane s¹ tak¿e bezpoœrednie metody hy-
brydyzacyjne, z wy³¹czeniem etapu amplifikacji. Poni¿ej przed-
stawiono krótk¹ charakterystykê najpopularniejszych technik
wykorzystywanych w mikrobiologii, w tym równie¿ w mikologii.

£añcuchowa reakcja polimerazy – PCR (1-3)

Wiêkszoœæ wspó³czeœnie stosowanych metod molekular-

nych wykorzystuje ³añcuchow¹ reakcjê polimerazy (PCR), opi-
san¹ w 1983 r. (cyt. za 1).

Adres do korespondencji:

Dr Urszula Nawrot

Katedra i Zak³ad Mikrobiologii AM
ul. Cha³ubiñskiego 4, 50-368 Wroc³aw
tel.: +48 071 78 00 77, e-mail: nawrot@mbio.am.wroc.pl

Technika PCR przeprowadzana in vitro wzorowana jest na

procesie replikacji odbywaj¹cym siê w ¿ywych komórkach. Pod-
stawow¹ sk³adow¹ mieszaniny reakcyjnej stanowi matryca
DNA (DNA badanego organizmu), do której nastêpnie w okre-
œlonych punktach przy³¹czaj¹ siê komplementarne startery.
Niezbêdne s¹ ponadto trójfosforany deoksynukleotydów
(dNTP), które s¹ dobudowywane do starterów, a tak¿e termo-
stabilna polimeraza katalizuj¹ca przy³¹czanie DTP oraz jony
Mg

, wp³ywaj¹ce na aktywnoœæ polimerazy.

W reakcji PCR mo¿na amplifikowaæ dowolny fragment DNA,

w zale¿noœci od u¿ytych starterów. S¹ one projektowane
w oparciu o znajomoœæ sekwencji nukleotydowych DNA regio-
nu, który zamierza siê powieliæ. Proces amplifikacji przebiega
kilkuetapowo. W pierwszym z nich nastêpuje denaturacja dwu-
niciowego DNA w temp. 92-96°C, dziêki czemu uzyskuje siê
dwie jednoniciowe matryce DNA. Nastêpnie zostaj¹ przy³¹czo-
ne startery, przy czym etap ten zachodzi w temp. 37-72°C
(w zale¿noœci od d³ugoœci i sk³adu nukleotydowego zastosowa-
nych starterów). W ostatnim etapie reakcji PCR dokonuje siê
wyd³u¿anie starterów od koñca 3’. Proces zachodzi w temp.
72°C w obecnoœci termostabilnej polimerazy DNA, która katali-
zuje przy³¹czanie trójfosforanów dezoksynukleozydów (dNTP).

Ca³¹ procedurê PCR przeprowadza siê w termocyklerach za-

pewniaj¹cych szybkie zmiany temperatury, optymalne dla ka¿de-
go etapu reakcji. Cykl jest powtarzany 25-35 razy, a ka¿dorazowo
nowo powsta³a niæ DNA staje siê matryc¹ w kolejnym cyklu, dziê-
ki czemu iloœæ produktu reakcji roœnie w sposób wyk³adniczy.
Schemat reakcji PCR zosta³ przedstawiony na rycinie 1.

Abstract

Streszczenie

Prace pogl¹dowe

Rreview articles

Mikologia Lekarska 2007, 14 (4): 280-284

www.cornetis.com.pl

ISSN 1232-986X

07ML_04_13_Macler_Techniki_S.indd 280

2007-12-17, 11:01:50

281

Izabela Mecler, Urszula Nawrot

Techniki molekularne stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej

Wydajnoœæ reakcji PCR zale¿y od wielu czynników. Wœród nich

nale¿y podkreœliæ rolê temperatury i czasu, w jakich przebiegaj¹
kolejne etapy reakcji. Laboratoria czêsto w sposób empiryczny
dobieraj¹ optymalne warunki reakcji. Szczególny wp³yw na po-
wodzenie reakcji ma temperatura, w jakiej zachodzi przy³¹cza-
nie starterów. W przypadku, gdy jest ona za wysoka, startery
mog¹ siê nie przy³¹czyæ, co skutkuje niepowodzeniem amplifika-
cji. Z kolei hybrydyzacja przeprowadzona w zbyt niskiej tempera-
turze mo¿e powodowaæ przy³¹czanie starterów w regionach nie
w pe³ni komplementarnych, co w konsekwencji prowadzi do
uzyskania dodatkowych, niespecyficznych produktów.

W czasie syntezy nowej nici istotne jest, aby stê¿enie po-

szczególnych trójfosforanów deoksynukleozydów (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP) by³o odpowiednio du¿e. W przypadku niedoboru
któregoœ ze sk³adników wydajnoœæ PCR siê obni¿a. Wa¿nym
czynnikiem jest tak¿e odpowiednie stê¿enie jonów Mg

, które

wp³ywaj¹ na aktywnoœæ polimerazy.

Warto podkreœliæ, jak znacz¹ce jest równie¿ przygotowanie

i czystoœæ badanego DNA. Priorytetow¹ spraw¹ jest ochrona
próbki przed kontaminacj¹. Nale¿y te¿ mieæ na uwadze to, ¿e
w próbkach klinicznych mog¹ znajdowaæ siê inhibitory reakcji
PCR, np. heparyna, porfiryny. Tak¿e czêste zamra¿anie próbki
DNA mo¿e ograniczaæ powtarzalnoœæ wyników. Na efektyw-
noœæ reakcji wp³ywaj¹ tak¿e proporcje i stê¿enia sk³adników
znajduj¹cych siê w buforze reakcyjnym.

Przestrzeganie procedur, stosowanie wystandaryzowanych

metod, a tak¿e odpowiedniej jakoœci odczynników i sprzêtu
pozwala ograniczyæ wystêpowanie reakcji niespecyficznych
i zapewnia powtarzalnoœæ wyników. Tote¿ reakcja PCR znalaz³a
szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach medycyny, a jej
g³ównymi zaletami s¹ du¿a czu³oœæ i swoistoœæ oraz stosunko-
wo krótki czas potrzebny do uzyskania ostatecznego wyniku.

Charakterystyka produktu uzyskanego w reakcji PCR

Elektroforeza w ¿elu agarozowym (4)

Elektroforeza DNA w ¿elu agarozowym jest standardow¹

technik¹ umo¿liwiaj¹c¹ rozdzielenie i okreœlenie wielkoœci pro-
duktów reakcji PCR. Wykorzystuje ona zdolnoœæ przemieszcza-
nia siê ujemnie na³adowanych cz¹steczek DNA w polu elek-
trycznym w kierunku elektrody dodatniej.

Pory ¿elu agarozowego stanowi¹ rodzaj sita molekularnego,

przez które cz¹steczki DNA migruj¹ z pewn¹ prêdkoœci¹, zale¿-
n¹ od ich wielkoœci. Du¿e fragmenty napotykaj¹ na wiêksze
opory i trudnoœci w penetracji porów ¿elu, przez co charaktery-
zuj¹ siê mniejszym tempem migracji. ¯ele agarozowe o ró¿nym
stê¿eniu wykorzystuje siê do rozdzia³u fragmentów DNA od
200 do 50 000 pz. Zastosowanie barwnika interkaluj¹cego
(bromku etydyny), który fluoryzuje w œwietle UV, pozwala na
precyzyjne lokalizowanie fragmentów DNA w ¿elu.

Podstawow¹ zalet¹ tej techniki jest prostota jej wykonania.

Identyfikacja produktu opiera siê na porównaniu drogi migracji
fragmentów DNA badanego i standardu (tzw. markerów wielkoœci).

Elektroforeza z mikrochipem (ME) (5, 6)

Elektroforeza ME jest stosunkowo niedawno wprowadzon¹

metod¹ rozdzia³u produktów PCR. Zasada elektroforezy z za-
stosowaniem mikrochipa, podobnie jak w elektroforezie ¿elo-
wej, polega na migracji cz¹stek obdarzonych ³adunkiem elek-
trycznym w polu elektrycznym. Mikrochip zawiera 3 studzienki
po³¹czone ze sob¹ kana³ami szerokoœci 0,1 mm, g³êbokoœci
0,03 mm i d³ugoœci 45 mm. Kana³y wype³nia siê roztworem
hydroksypropylometylocelulozy z dodatkiem bromku etydyny.
W jednej ze studzienek umieszcza siê próbkê DNA z buforem
obci¹¿aj¹cym, który zawiera wewnêtrzne wzorce mas. Po-
cz¹tkowo przez 1 min przy³¹cza siê napiêcie 300 V, aby wpro-

wadziæ próbki w pod³o¿e, po czym przez 3 min przeprowadza
siê rozdzia³ próbek przy napiêciu 750 V. Wielkoœæ otrzyma-
nych produktów PCR jest oceniana na podstawie densyto-
gramu.

Metoda to po raz pierwszy zosta³a zastosowana przez Fujita

i wsp. (5) w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida. Wyniki ba-
dañ wskazuj¹, ¿e obie techniki elektroforetyczne charakteryzu-
j¹ siê t¹ sam¹ czu³oœci¹ i rozdzielczoœci¹, przy czym technika
z u¿yciem mikrochipa pozwala na skrócenie czasu analizy do
4 min, podczas gdy metoda klasyczna trwa oko³o 2 godz.

Elektroforeza kapilarna (7)

Technik¹ pozwalaj¹c¹ na okreœlenie d³ugoœci otrzymanego

produktu z dok³adnoœci¹ do 1 pz jest elektroforeza kapilarna.
Zastosowano w niej kapilary (g³ównie krzemionkowe) o bardzo
ma³ej œrednicy wewnêtrznej (10-100 µm) i pojemnoœci kilku
mikrolitrów. Koñce takiej kapilary zanurzone s¹ w pojemnikach
z odpowiednim buforem, z których jeden zawiera próbkê z ma-
teria³em badanym. Po przy³o¿eniu napiêcia, DNA z próbki mi-
gruje w kierunku dodatniej elektrody. Rozdzielone produkty s¹
analizowane detektorami fluorescencji.

G³ównymi zaletami elektroforezy kapilarnej s¹: wysoka

sprawnoœæ rozdzielania, ma³e zu¿ycie odczynników i rozpusz-
czalników organicznych, ma³a objêtoœæ analizowanych próbek.

Analiza fragmentów restrykcyjnych – RFLP (Restriction frag-
ment length polymorphism) (6, 8)

Techniki elektroforetyczne pozwalaj¹ okreœliæ wielkoœæ pro-

duktu reakcji PCR, nie daj¹ jednak informacji o jego sekwencji.
W celu pe³niejszej charakterystyki uzyskane amplikony s¹ pod-
dawane dzia³aniu enzymów restrykcyjnych, które posiadaj¹ zdol-
noœæ rozpoznawania i ciêcia DNA w punktach o okreœlonej se-
kwencji. Po rozdziale elektroforetycznym mo¿na okreœliæ liczbê
i wielkoœæ powsta³ych fragmentów DNA, czyli uzyskaæ tzw. wzór
restrykcyjny. W zale¿noœci od swoistoœci genu wybranego do
analizy metoda RFLP mo¿e byæ stosowana do identyfikacji gatun-
kowej lub typowania wewn¹trzgatunkowego drobnoustrojów.
Wa¿nym czynnikiem wp³ywaj¹cym na skutecznoœæ metody jest
dobór odpowiedniego enzymu, gdy¿ poszczególne restryktazy
rozpoznaj¹ inne sekwencje nukleotydowe, wskutek czego jeden
fragment DNA, w zale¿noœci od zastosowanego enzymu, prezen-
tuje inny wzór restrykcyjny. Znajomoœæ sekwencji amplikowanego
fragmentu genomu pozwala na oznaczenie miejsc restrykcyjnych
(ryc. 2) i dobór enzymów restrykcyjnych umo¿liwiaj¹cych uzyska-
nie ³atwych do interpretacji wzorów restrykcyjnych. Czêsto stosu-
je siê trawienie DNA kilkoma enzymami lub ich kombinacj¹, aby
uzyskaæ szerszy zakres informacji o genomie.

Charakterystyka produktu RFLP technik¹ Southern blotting (4)

W technice Southern blotting odcinki restrykcyjne DNA s¹

utrwalane na b³onie nitrocelulozowej. W tym celu rozdzielone
w ¿elu fragmenty DNA poddaje siê denaturacji w buforze alkalicz-
nym. W kolejnym etapie przenosi siê materia³ DNA z ¿elu na odpo-
wiednio spreparowan¹ b³onê nylonow¹, a nastêpnie wybarwia.

Obraz pasków uzyskanych na b³onie celulozowej stanowi

charakterystyczny wzór restrykcyjny. Wybrane fragmenty DNA
mo¿na nastêpnie oznaczyæ przez hybrydyzacjê z odpowiednimi
sondami, znakowanymi izotopowo lub fluorescencyjnie.

LCR – ligazowa reakcja ³añcuchowa (8)

Technika LCR wykorzystuje zasadê reakcji PCR, przy czym

jest to technika amplifikacji DNA, a nie polimeryzacji. W reakcji
bior¹ udzia³ dwie pary komplementarnych starterów, które sta-

07ML_04_13_Macler_Techniki_S.indd 281

2007-12-17, 11:01:53

Mikologia Lekarska 2007, 14 (4)

Izabela Mecler, Urszula Nawrot
Molecular methods applied in microbiological diagnostic

282

nowi¹ d³u¿sze sekwencje nukleotydowe zaprojektowane tak,
by koniec 3’ pokrywa³ potencjaln¹ ró¿nice w sekwencji. W przy-
padku pe³nej komplementarnoœci, przy³¹czone pary starterów
ulegaj¹ ligacji, czyli ³¹czeniu przez termostabiln¹ ligazê, co zo-
sta³o przedstawione schematycznie na rycinie 3. W kolejnym
cyklu powsta³e fragmenty DNA stanowi¹ matrycê dla dalszych
syntez. Produkty reakcji LCR rozdziela siê elektroforetycznie.

Real-Time PCR (reakcja PCR w czasie rzeczywistym) (9, 11)

Technika Real-Time PCR, czyli reakcja PCR z analiz¹ przyro-

stu iloœci produktu w czasie rzeczywistym, umo¿liwia monitoro-
wanie iloœci powstaj¹cych amplikonów. Ka¿dorazowo, w kolej-
nym cyklu dokonuje siê pomiaru iloœci powstaj¹cych kopii frag-
mentu DNA, na podstawie odczytu poziomu fluorescencji
emitowanej przez sondy wyznakowane fluorochromami, lub
barwnik interkaluj¹cy.

Do przeprowadzenia reakcji Real-Time PCR wymagany jest

termocykler z przy³¹czonym fluorymetrem, którego zadaniem
jest pomiar fluorescencji w czasie trwania reakcji. Ka¿dy aparat
ma okreœlony próg fluorescencji, tzw. C

, który jest definiowany

jako liczba cykli potrzebna do uzyskania statystycznie znacz¹-
cego wzrostu fluorescencji. Z kolei liczba cykli wymaganych do
otrzymania iloœci produktu, który emituje fluorescencjê prze-
kraczaj¹c¹ próg C

, jest uzale¿niona od iloœci matrycy DNA

w pierwszym cyklu PCR. Poniewa¿ teoretycznie iloœæ ampliko-
nów roœnie wyk³adniczo z ka¿dym cyklem reakcji PCR, tote¿
mo¿liwe jest, w oparciu o znajomoœæ wartoœci C

, oszacowanie

iloœci DNA, jaka obecna by³a w próbce wyjœciowej. W praktyce
stosuje siê w tym celu wyznaczon¹ empirycznie krzyw¹ zale¿-
noœci liczby cykli PCR w punkcie C

od liczby matryc obecnych

w punkcie wyjœciowym reakcji.

Zastosowanie w praktyce znalaz³o kilka metod analizy przyro-

stu iloœci produktu w reakcji PCR, przy czym najczêœciej stosowa-
ne s¹ sondy znakowane fluorescencyjnie, w sposób wykorzystu-
j¹cy zjawisko transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET
– fluorescence resonance energy transfer). W czasie reakcji PCR
energia œwietlna zaadsorbowana przez jeden fluorochrom zosta-
je przeniesiona na drugi, co skutkuje emisj¹ lub wygaszaniem
fluorescencji. Najczêœciej stosowane s¹ techniki:
• Hybprobes – wykorzystuje dwie krótkie sondy, z których

jedna zawiera fluorochrom zwi¹zany w koñcem 5’, a druga
z koñcem 3’. Na etapie hybrydyzacji w reakcji PCR, obie son-
dy przy³¹czaj¹ siê do komplementarnej sekwencji DNA

Ryc. 1. Schemat reakcji PCR
Fig. 1. Schema of the polymerase chain reaction (PCR)

CYKL 1

DNA badane
Template DNA

Denaturacja
i przy³¹czanie
starterów
Denaturation
and primers
hybridization

Wyd³u¿anie
nici
Strand
elongation

CYKL 2

Denaturacja
i przy³¹czanie
starterów
Denaturation
and primers
hybridization

Wyd³u¿anie
nici
Strand
elongation

Ryc. 2. Mapa restrykcyjna fragmentu rDNA Candida albicans (mapa wykonana na podstawie sekwencji AY939786 z zastosowaniem programu SeqBuilder,
Lasergene)
Fig. 2. Restriction map of the Candida albicans rDNA fragment constructed on the base of the squence AY939786 (Genebank), with the help of Seqbuilder
software, (Lasergene)

07ML_04_13_Macler_Techniki_S.indd 282

2007-12-17, 11:01:54

283

Izabela Mecler, Urszula Nawrot

Techniki molekularne stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej

w bardzo bliskiej odleg³oœci. Œwiat³o o odpowiedniej d³ugoœci
fali powoduje pobudzenie fluorochromu 3’ i przekazanie
energii na fluorochrom 5’, który emituje œwiat³o ulegaj¹ce
detekcji. Na etapie wyd³u¿ania sondy s¹ usuwane, co skut-
kuje zanikiem fluorescencji. Dlatego natê¿enie fluorescencji
na etapie hybrydyzacji jest proporcjonalne do liczby ampliko-
nów danego fragmentu DNA na koñcu poprzedniego cyklu,

• Molecular Beacons – stosuje pojedyncz¹ sondê, na której

przeciwleg³ych koñcach znajduj¹ siê fluorochrom oraz wyga-
szasz. Sonda zawiera sekwencje komplementarne do sie-
bie, dziêki czemu tworzy strukturê „spinki do w³osów”, a to
zbli¿a do siebie obie cz¹steczki, skutkuj¹c wygaszaniem
fluorescencji (wygaszacz przechwytuje energiê ze wzbudzo-
nego œwiat³em fluorochromu). Na etapie hybrydyzacji sonda
przy³¹cza siê do komplementarnej sekwencji DNA, w wyniku
czego fluorochrom zostaje odseparowany przestrzennie od
wygaszacza i nastêpuje pomiar emitowanego œwiat³a.
W czasie wyd³u¿ania sonda jest usuwana i fluorescencja
zanika. Podobnie jak w powy¿szej metodzie natê¿enie flu-
orescencji w czasie hybrydyzacji odnosi siê proporcjonalnie
do iloœci produktu powsta³ego na koñcu poprzedniego cy-
klu,

• TaqMan – z u¿yciem pojedynczej sondy, zakoñczonej z jed-

nej strony fluorochromem, a z drugiej wygaszaczem, która
jest na tyle krótka, ¿e umo¿liwia transfer energii miêdzy
nimi. Na etapie wyd³u¿ania polimeraza Taq, posiadaj¹ca
aktywnoœæ 5’-egzonukleazy, powoduje degradacjê sondy,
przez co uwalniany jest fluorochrom emituj¹cy œwiat³o.
Popularn¹ technik¹ jest zastosowanie barwnika interkaluj¹-

cego SYBR Green I. Fluorochrom emituje œwiat³o po przy³¹cze-
niu do dwuniciowego DNA (dsDNA), którymi s¹ amplikony (sy-
gna³ z matrycowego DNA jest traktowany jako t³o i zostaje odjê-
ty). Zaletê tej techniki stanowi stosunkowo niski koszt,
poniewa¿ nie wymaga ona zastosowania sondy, jednak jest
mniej specyficzna i mo¿e dawaæ fa³szywie pozytywne wyniki.

Charakterystyka produktu w Real-Time PCR (11, 12)

Niektóre techniki Real-Time PCR, np. metoda SYBR Green,

umo¿liwiaj¹ pomiar temperatury topnienia powstaj¹cego am-
plikonu. Monitorowanie przyrostu produktu w czasie, pozwala
na okreœlenie momentu, w którym reakcja wchodzi w fazê pla-
teau, po której mo¿liwe jest wyznaczenie krzywej topnienia
otrzymanych produktów. W tym celu podnosi siê temp. do 95°C

na 1 s, a nastêpnie sch³adza do 65-70°C na 15 s, w tym czasie
do wszystkich dwuniciowych fragmentów DNA przy³¹cza siê
barwnik SYBR Green (lub sondê). W kolejnym etapie powoli
podnosi siê temp. 0,1-0,5°C na 1 s (do 95-99°C) i prowadzi
ci¹g³y pomiar fluorescencji. Wzrost temperatury prowadzi do
powolnej denaturacji dwuniciowego DNA, w efekcie od³¹cza siê
fluorochrom i fluorescencja spada. W momencie osi¹gniêcia
temperatury topnienia produktu, nastêpuje bardzo gwa³towna
denaturacja i ostry spadek fluorescencji, który odczytuje siê
jako wyraŸny pik na krzywej.

Krzywa topnienia zastêpuje rozdzia³ elektroforetyczny po

klasycznej reakcji PCR. Temperatura topnienia jest cech¹ cha-
rakterystyczn¹ uzyskanego produktu, zale¿y od jego d³ugoœci
i sekwencji, odsetka zasad purynowych i pirymidynowych, dla-
tego mo¿e byæ wykorzystana w identyfikacji. Krzywa topnienia
pozwala ponadto okreœliæ specyficznoœæ reakcji. Jeden pik na
krzywej potwierdza obecnoœæ jednego amplikonu. W sytuacji,
gdy wystêpuj¹ reakcje konkurencyjne, powstaj¹ natomiast pro-
dukty niespecyficzne, co skutkuje pojawieniem siê dwóch lub
wiêcej ró¿nych pików temperatur topnienia.

PCR in situ (2, 6)

Metoda PCR in situ sk³ada siê z dwóch etapów. £¹czy ona

w sobie zalety PCR z technikami hybrydyzacji i jest z powodze-
niem wykorzystywana w badaniu bezpoœrednim tkanki objêtej
procesem chorobowym.

Po wyizolowaniu DNA z materia³u klinicznego przeprowadza

siê klasyczn¹ reakcjê PCR. Odpowiednie startery pozwalaj¹ na
powielenie specyficznego gatunkowo fragmentu DNA patoge-
nu. W kolejnym etapie produkty uzyskane w PCR poddaje siê
hybrydyzacji, w czasie której nastêpuje przy³¹czenie specyficz-
nych sond umo¿liwiaj¹cych identyfikacjê.

Stosowane do hybrydyzacji sondy s¹ jednoniciowymi frag-

mentami DNA lub RNA, których sekwencja nukleotydowa jest
zgodna z poszukiwan¹, charakterystyczn¹ dla danego gatunku
sekwencj¹ DNA.

Metoda PCR in situ charakteryzuje siê wysok¹ czu³oœci¹

i specyficznoœci¹. Dodatkowo jest to metoda szybka i zapewnia
wiarygodnoœæ wyników. Mo¿liwoœæ zanieczyszczenia materia³u
innym DNA jest eliminowana przez u¿ycie wysoce specyficz-
nych starterów. Nale¿y wspomnieæ, ¿e reakcja mo¿e byæ niekie-
dy blokowana przez obecne w tkance inhibitory polimerazy
DNA, a mimo to technika PCR in situ znalaz³a zastosowanie
w identyfikacji patogenu bezpoœrednio w tkance pochodz¹cej
od zaka¿onego pacjenta

Nested PCR – „zagnie¿d¿ony” PCR (2, 6)

Modyfikacja wprowadzona do klasycznej reakcji PCR polega

na przeprowadzeniu dwóch nastêpuj¹cych po sobie amplifika-
cji. Dla nested PCR wymagane jest zastosowanie osobnych
starterów zarówno dla pierwszego, jak i drugiego etapu.

W pierwszym cyklu PCR stosuje siê tzw. startery zewnêtrz-

ne, które zwykle wykazuj¹ nisk¹ specyficznoœæ gatunkow¹, ale
pozwalaj¹ na powielenie fragmentu markerowego DNA patoge-
nu. Nastêpnie produkty uzyskane w pierwszej reakcji PCR wy-
korzystuje siê jako matryce w kolejnym cyklu amplifikacji.
W drugim etapie przy³¹czaj¹ siê tzw. startery wewnêtrzne, któ-
re charakteryzuje du¿a specyficznoœæ gatunkowa.

Zastosowanie dwóch par starterów w dwuetapowej reakcji

zwiêksza czu³oœæ techniki nested PCR. Wykazano, ¿e w przy-
padku klasycznej metody PCR, potrzeba oko³o 50 pg matryco-
wego DNA, aby uzyskaæ produkty reakcji. Metoda nested PCR
daje pozytywne rezultaty w przypadku obecnoœci 50 fg DNA
w próbce.

Ryc. 3. Schemat reakcji LCR
Fig. 3. Schema of the Ligose Chain Reaction

CYKL 1

DNA badane
Template DNA

Denaturacja
i przy³¹czanie
starterów
Denaturation
and primers
hybridization

Ligacja
Ligation

07ML_04_13_Macler_Techniki_S.indd 283

2007-12-17, 11:01:56

Mikologia Lekarska 2007, 14 (4)

Izabela Mecler, Urszula Nawrot
Molecular methods applied in microbiological diagnostic

284

Przez wzgl¹d na zwiêkszon¹ czu³oœæ, metodê nested PCR

stosuje siê do detekcji i identyfikacji patogenu bezpoœrednio
w materiale klinicznym.

Sekwencjonowanie jako sposób identyfikacji produktu PCR (13)

Najdok³adniejsz¹ metod¹ charakterystyki produktu reakcji

PCR jest oznaczenie jego sekwencji nukleotydowej. Zastosowa-
nie odpowiednich programów komputerowych, np. Blast (http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), umo¿liwia okreœlenie homo-
logii miêdzy sekwencj¹ badanego produktu i tysi¹cami sekwen-
cji zgromadzonymi w publicznych (GenBank/NCBI) lub komer-
cyjnych bazach danych. Wiarygodnoœæ uzyskanej w ten sposób
identyfikacji zale¿y od swoistoœci fragmentu DNA wybranego
do analizy oraz zakresu danych przechowywanych w bazach.

Metody sekwencjonowania

• Metoda Maxama-Gilberta – metoda czêœciowej, chemicznej

degradacji oczyszczonego fragmentu DNA (wyznakowanego
radioaktywnie) z zastosowaniem 4 ró¿nych zwi¹zków, które
rozszczepiaj¹ cz¹steczki w specyficznych miejscach po-
szczególnych nukleotydów. Po przeprowadzeniu ka¿dej
z 4 niezale¿nych reakcji otrzymuje siê pulê ró¿nej d³ugoœci
fragmentów DNA, które rozdziela siê elektroforetycznie
w denaturuj¹cym ¿elu poliakryloanidowym. Nastêpnie w wy-
niku autoradiografii uzyskuje siê charakterystyczny wzór
pr¹¿kowy umo¿liwiaj¹cy odczyt sekwencji badanego frag-
mentu. Aktualnie technika ta jest rzadko stosowana.

• Metoda Sangera – metoda terminacji wyd³u¿ania ³añcucha

(zwana sekwencjonowaniem „dideoksy”). Technika wykorzy-
stuje 4 rodzaje dideoksyrybonukleotydów (ddATP, ddCTP,
ddGTP, ddTTP), pozbawione grupy hydroksylowej, która wa-
runkuje tworzenie wi¹zañ fosforanowych miêdzy kolejnymi
nukleotydami. W efekcie w czasie enzymatycznej syntezy
komplementarnych ³añcuchów do jednoniciowego DNA
w ró¿nych miejscach przy³¹czaj¹ siê ddNTP i nastêpuje ter-
minacja ³añcucha. Podobnie jak w ww. metodzie w ka¿dej
z 4 reakcji uzyskuje siê fragmenty DNA ró¿nej d³ugoœci, któ-
re nale¿y rozdzieliæ elektroforetycznie i uwidoczniæ autora-
diograficznie pr¹¿ki odpowiadaj¹ce poszczególnym produk-
tom terminacji.

• Sekwencjonowanie cykliczne – przypomina reakcje PCR,

przy czym iloœæ produktu zwiêksza siê liniowo, poniewa¿
stosuje siê tylko jeden starter. W mieszaninie reakcyjnej po-
jawiaj¹ siê ddNTP znakowane izotopowo lub fluorescencyj-
nie. Po przeprowadzeniu 4 osobnych reakcji dla ka¿dego
ddNTP analizê sekwencji przeprowadza siê jak powy¿ej.

• Sekwencjonowanie automatyczne – metoda obecnie naj-

czêœciej stosowana wykorzystuje 4 rodzaje ddNTP, z których
ka¿dy jest znakowany innym fluorochromem, dziêki czemu
podczas jednej reakcji mo¿liwe jest ró¿nicowanie powstaj¹-
cych produktów terminacji. Detekcjê procesu przeprowadza
siê w sekwenatorach kapilarnych. Wyznakowane fragmenty
DNA migruj¹ w ¿elu kapilary, gdzie po zadzia³aniu wi¹zki la-
sera nastêpuje wzbudzenie sygna³u fluorescencyjnego.

• Pirosekwencjonowanie – sekwencjonowanie w czasie rze-

czywistym. Zasada metody opiera siê na detekcji pirofosfo-
ranu (PPi) uwalnianego w czasie syntezy DNA. Poszczególne
dNTP dodawane kolejno powoduj¹ uruchomienie kaskady

reakcji skutkuj¹cej emisj¹ œwiat³a, którego intensywnoœæ
zale¿na jest od iloœci uwolnionego PPi. W³¹czenie nukleoty-
du rejestrowane jest na bie¿¹co jako b³ysk chemilumine-
scencji. Technika ta nie wymaga u¿ycia ddNTP, ani elektrofo-
rezy.

Podsumowanie

Metody konwencjonalne oparte na hodowli drobnoustrojów

i ocenie ich cech fenotypowych pozostaj¹ podstaw¹ diagnosty-
ki mikrobiologicznej. Metody molekularne s¹ wykorzystywane
w uzupe³nieniu klasycznej diagnostyki. Ograniczeniem do za-
stosowania najnowoczeœniejszych technik w podstawowych
pracowniach mikrobiologicznych jest wymaganie odpowiednie-
go wyposa¿enia sprzêtowego oraz z³o¿onoœæ procedur. Nie-
mniej jednak mo¿liwoœci, jakie stwarzaj¹ metody molekularne
w wielu dziedzinach medycyny, powoduj¹, i¿ podstawowe ter-
mocyklery dla reakcji PCR powoli staj¹ siê standardem w labo-
ratoriach. Umo¿liwi to wykorzystanie prostych technik, np.
RFLP, do szybkiej identyfikacji patogenu. Metody bardziej za-
awansowane, np. Real-time PCR, s¹ obecnie zarezerwowane
jedynie dla laboratoriów referencyjnych. W kolejnym artykule
zamieszczony zostanie przegl¹d literatury zawieraj¹cej wyniki
doœwiadczeñ, w których do identyfikacji grzybów z rodzaju Can-
dida wykorzystano opisane powy¿ej techniki molekularne.

Piœmiennictwo

1. Kur J., Samet A., Juszczyk J., G³adysz A.: PCR – nowa era w klinicznej diagnostyce

mikrobiologicznej i badaniach epidemiologicznych. Przegl. Epidemiol., 1996, 50,
219-225.

2. Bojarski £., Dobrowolska A., Grabowski M., Czarnecki M., Jaworski A.: Molekularna

diagnostyka i epidemiologia zaka¿eñ niektórymi gatunkami grzybów chorobo-
twórczych. Postêpy Mikrob., 2001, 40, 311-324.

3. Grzeszkowiak M., Dembiñska M., Adamski Z.: Technika PCR i jej zastosowanie

w diagnostyce zaka¿eñ grzybami z rodzaju Candida. Post. Derm. Alergol., 2001,
18, 17-20.

4. Podzorski

R.P.:

Gel electrophoresis, Southern hybridization and restriction frag-

ment length polymorphism analysis. [w:] Molecular microbiology. Diagnostic
principles and practice. red. D.H. Pershing. ASM Press, 2004, 273-281.

5. Fujita S., Senda Y., Nakaguchi S., Hashimoto T.: Multiplex PCR using internal trans-

cribed spacer 1 and 2 regions for rapid detection and identification of yeast stra-
ins. J. Clin. Microbiol., 2001, 39, 3617-3622.

6. Dobrowolska A., Bojarski £., St¹czek P.: Metody i techniki molekularne stosowane

w diagnostyce i epidemiologii zaka¿eñ grzybami chorobotwórczymi. Wiad. Para-
zytol., 2002, 48, 241-255.

7. Michalski

R.:

Elektroforeza kapilarna – zalety i ograniczenia. Laboratorium, 2006,

7, 15-20.

8. Murawska

B.,

Dzier¿anowski

D.:

Zastosowanie metod biologii molekularnej w dia-

gnostyce mikrobiologicznej. Mikrobiol. Med., 1999, 19, 38-44.

9. Atkins S. D., Clark I.M.: Fungal molecular diagnostics: a mini review. J. Appl. Ge-

net., 2004, 45, 3-15.

10. Yeo S.F., Wong B.: Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive

fungal infections. Clin. Microbiol. Rev., 2002, 15, 465-484.

11. Valasek M.A., Repa J.J.: The Power of Real-Time PCR. Adv. Physiol. Educ., 2005,

29, 151-159.

12. Wittwer C.T., Kusukawa N.: Real-Time PCR. [w:] Molecular microbiology. Diagno-

stic principles and practice. red. D.H. Pershing. ASM Press, 2004, 71-85.

13. Witoñ M., Sala K.: Sekwencjonowanie DNA. Laboratorium Medyczne, 2006, 8,

52-54.

Praca wp³ynê³a do Redakcji: 2007.09.17. Zaakceptowano do druku: 2007.11.21.

07ML_04_13_Macler_Techniki_S.indd 284

2007-12-17, 11:01:57