MLPA – MULTIPLEX LIGATION –DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION
Odmiana techniki PCR, pozwalająca na względną rownoczesną i ilościową ocenę do czterdziestu sekwencji nukleotydowych. W MLPA sondy dodane do reakcji są amplifikowane metodą PCR i przyłączona sonda pełni funkcję matrycy. Produkty amplifikacji są identyfikowane i określane ilościowo metodą elektorforezy kapilarnej.
Zastosowanie MLPA
• wykrywanie aneuploidii chromosomow 13, 18, 21, X oraz Y
• wykrywanie dużych chromosomalnych delecji i duplikacji:
- DiGeorge syndrome,
- Williams syndrome
- Pelizaeus-Merzbacher disease
- Spinal Muscular Atrophy (SMA)
- subtelomeric regions etc
• wykrywanie pozyskiwania i utraty genow w tkankach nowotworowych: Her2-neu
• wykrywanie delecji i duplikacji w najważniejszych znanych genach silnie predysponujących do nowotworow: BRCA 1 i 2, MSH2, MLH1, VHL, SHOX, MECP2, APC, NF1,2, MSH6, PMS2, FANCA, FANCD2, CDH1, MEN1, STK11, SMARCB1.
• MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA), ktora wykorzystywana jest do poszukiwania metylowanych wysp CpG w obrębie genomu
QF-PCR – QUANTITIVE FLUORESCENCE-POLYMERASE CHAIN REACTION
zastosowanie w diagnostyce prenatalnej wybranych aberracji chromosomowych (ocena ilości kopii chromosomow 13, 18, 21, X i Y)
opiera sie na wykorzystaniu jako markerow sekwencji STR (ang. short tandem repeats) rutynowo zrodłem DNA są amniocyty płynu owodniowego
startery do amplifikacji poszczegolnych STR są znakowane fluorescencyjnie,
odczyt za pomoca sekwenatora kapilarnego
RT-PCR - REAL TIME REVERSED TRANSCRIPTASE PCR
Reakcja PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym
Na podstawie RNA odwrotna transkryptaza syntetyzuje komplementary DNA (cDNA), następnie drodze "zwykłej" reakcji PCR otrzymane DNA jest amplifikowane.
Zgodnie z zasadą PCR, ilość produktu po zakończeniu reakcji jest wykładniczo proporcjonalna do początkowej ilości analizowanej sekwencji.
W RT - PCR wyznacznikiem początkowej ilości matrycy jest ilość cykli CT, po ktorych kinetyka reakcji wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu.
Analiza przyrostu ilości produktow oparta na związkach fluorescencyjnych (np. SYBR GreenI, TaqMan).
Termocykler sprzężony z fluorymetrem umożliwia pomiar fluorescencji w czasie trwania reakcji.
MIKROMACIERZE DNA
Umożliwiają analizę praktycznie całego genomu badanego organizmu w pojedynczym eksperymencie.
oligonukleotydowe (chipy DNA)
- wykorzystują jako sondy krotkie fragmenty DNA o długości od 20 do 70 nukleozydow; sondy te syntetyzowane są najczęściej in situ (bezpośrednio na płytce), co zapewnia wysoką gęstość mikromacierzy i umożliwia umieszczenie na niewielkiej powierzchni nawet kilkudziesięciu tysięcy sond
- otrzymywane techniką fotolitografii (firma Affymetrix - USA) mikromacierze typu GeneChip
- znajomość sekwencji analizowanych genow
cDNA
- otrzymywane metodą RT
- wykorzystują jako sondy długie fragmenty cDNA (od 200 do 600 nuklozydow), najczęściej tzw. krotkie sekwencje ekspresyjne ESTs (ang. expressed sequence tags);
- długie fragmenty cDNA zmniejszają ryzyko niespecyficznej hybrydyzacji
- analiza ekspresji genow o nieznanej sekwencji lub znanej częściowo
Hybrydyzacja Southerna
służy wykrywaniu określonych fragmentów DNA
najpierw trzeba przeprowadzić elektroforetyczne rozdzielenie mieszaniny fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi)
potem umieścić w alkalicznym buforze który wywoła denaturację DNA
Następnie całość przenosi się na błonę nylonową
Po odpowiednim spreparowaniu błony nylonowej z DNA wykonuje się hybrydyzację z sondą
następnie przy pomocy odpowiedniej metody detekcji uwidacznia się interesujące fragmenty DNA
Hybrydyzacja northern
Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających transkrypcji w komórce
RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (elektroforezie) na żelu
po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz utrwala na niej
membranę z RNA inkubuje się z sondą, tzn. cząsteczką DNA lub RNA, która po pierwsze jest komplementarna do poszukiwanej sekwencji, a po drugie daje się łatwo wykryć
po inkubacji i odpłukaniu nadmiaru sondy przeprowadza się detekcję, czyli uwidacznianie sondy, która związała się do poszukiwanej sekwencji RNA na membranie.
RFLP
( Restriction Fragments Length Polymorphism – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych).
RFLP jest wykorzystywany w technice, w której organizmy mogą być różnicowane poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA.
Tą techniką wykrywa się różnice pomiędzy rozmiarami fragmentów DNA pociętych restryktazami.
Różnice długości fragmentów DNA powstają w wyniku mutacji, które tworzą lub eliminują miejsca rozpoznawane przez te enzymy
RFLP jest kluczowym narzędziem w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych alleli u osobników
Western blot
służąca do wykrywania określonych białek
Rozdziela zdenaturowane białka według ich mas
Później białka są przenoszone na membranę