Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

1

E

NZYMY

Enzymy komórkowe:

o Miejscem ich działania są komórki, są związane z różnymi organellami komórkowymi:
o Pojawiają się w dużych ilościach po uszkodzeniu narządów.
o Należą do nich min. ALT, AST

Enzymy sekrecyjne:

o Po uszkodzeniach komórek (np. hepatocytów) zachodzi spadek ich aktywności, ponieważ ich

ilośd zależy od syntezy na rybosomach.

o Należą do nich min. czynniki krzepnięcia krwi oraz fibrynolizy, esterazy cholinowe i lipaza

lipoproteinowa.

Enzymy ekskrecyjne

o przeszkoda w odpływie wydzielin ustrojowych, takich jak: żółd, sok trzustkowy, ciecz

sterczowa czy ślina, powoduje zastój wydzieliny i przedostanie się enzymów do krwiobiegu.

o Do tej grupy należą enzymy soku trzustkowego, żółci oraz fosfataza sterczowa

_________________________________________________
Izoenzymy

o Homologiczne enzymy w obrębie danego organizmu, które katalizują tę samą reakcję,

ale różnią się nieznacznie strukturą, wartościami K

m

i V

max

oraz właściwościami

regulacyjnymi.

o Izoenzymy ulegają ekspresji w różnych tkankach lub organellach w różnych stadiach

rozwojowych.

o Są kodowane przez geny zajmujące różne loci
o Izoenzymy można często odróżnid od siebie na podstawie właściwości biochemicznych, np.:

 ruchliwośd elektroforetyczna – izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej
 Inhibicja przez L-winian: L-winian hamuje kwaśną fosfatazę sterczową, nie działając

na inne izoenzymy fosfatazy kwaśnej

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

2

O

ZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

Typowe przyczyny zmian aktywności enzymów we krwi:

o Zmiana przepuszczalności błony komórkowej
o Rozpad komórek w wyniku patologicznych procesów
o Zmiany w eliminacji/katabolizmie enzymu
o Zwiększona proliferacja komórek/ indukcja enzymów
o Utrudniony odpływ wydzieliny gruczołu zawierającej enzymy ekskrecyjne

o Upośledzenie syntezy enzymu

Zasada pomiaru aktywności enzymów

A) Kofaktory oznaczanych enzymów:

Pomiar spadku/ wzrostu absorbancji pochodzący od powstającego/ zużywanego w reakcji
enzymatycznej NADH lub NADPH :

o NADH/NAD i NADPH/NADP są kofaktorami używanymi przez wiele enzymów
o Redukcja NAD do NADH i NADP do NADPH jest monitorowana przy



=340 nm, ponieważ

forma utleniona nie absorbuje światła przy tej długości fali.

o Jeśli oznaczany enzym nie wymaga do swej aktywności kofaktorów w postaci NADH/NAD

i NADPH/NADP, istnieje koniecznośd sprzężenia reakcji dla oznaczanego enzymu z reakcją
pomocniczą oraz/lub wskaźnikową podczas której wykorzystywany jest enzym wymagający
do prawidłowego funkcjonowania ww. kofaktorów, np.:

ALT

L-alanina + a-ketoglutaran <---------> L-glutaminian + pirogronian

reakcja wskaźnikowa:

LDH

pirogronian + NADH + H

+

<--------> mleczan + NAD

+

B) Analogi naturalnych substratów:

Pomiar wzrostu absorbancji pochodzący od powstającego p- nitrofenolu:

o p-nitrofenol może zostad sprzęgnięty z wieloma związkami chemicznymi, tworząc sztuczny

substrat dla oznaczanego enzymu

o Enzym katalizuje reakcję odszczepienia p-nitrofenolu, który tworzy żółto zabarwiony anion p-

nitrofenolanowy



p-nitrofenylofosforan (pNPP) – fosfatazy



p-nitrofenylo-D-maltoheptozyd (pNP-G7) - amylaza

C) Substancje, z których pod wpływem reakcji enzymatycznej powstają barwne produkty:



3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna (TMB)

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

3

Pomiar szybkości reakcji odbywa się w ustalonych i ściśle kontrolowanych warunkach

(pH, temperatura, stężenie substratów, aktywnośd innych enzymów biorących udział w reakcji),

w określonym przedziale czasu.

Aktywnośd enzymatyczna wyrażamy w dwóch standardowych jednostkach.

o jednostka enzymatyczna (IU – international unit) jest to taka ilośd enzymu, która katalizuje

przekształcenie 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty, w warunkach optymalnych dla danego
enzymu.

o Katal (kat) jest jednostka aktywności enzymatycznej obowiązująca w układzie SI, to taka ilośd

enzymu, która w standardowych warunkach przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 sekundy.

1 kat – 6x10

7

IU

1 IU = 1 μmol/min

1 kat = 1 mol/s

→ 60 mol/min → 6x10

7

IU

1 μkat = 60 IU

1 IU = 16,7 μkat

o Dopuszcza się stosowanie jednostki zwyczajowej (U - unit) pod warunkiem wskazania

przelicznika obu jednostek.

Jednostki U definiuje się w sposób zaproponowany przez producenta danego testu

enzymatycznego np. oznaczanie mieloperoksydazy (enzymu katalizującego reakcję utleniania w
obecności H

2

O

2

):



sztuczny substrat – gwajakol (forma utleniona jest barwna)



przyrost absorbancji związany jest z przyrostem barwnego produktu



ściśle zdefiniowane warunki reakcji: 1% gwajakol, 6mmol H

2

O

2

, pH 7.4, temperatura 37

st. C



pomiar absorbancji dla długości fali



= 450 nm

1U = taka aktywnośd enzymu, która spowoduje przyrost absorpcji równy 1 w czasie 1 min.

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

4

S

TANDARYZACJA OZNACZEO ENZYMATYCZNYCH

:

Cel: otrzymanie porównywalnych wyników aktywności enzymów w materiale biologicznym,
niezależnie od:

 rodzaju użytych odczynników (firmy produkującej zestawy odczynników),
 analizatora biochemicznego, na którym dane oznaczenie było przeprowadzone,
 laboratorium w którym oznaczenie było przeprowadzone

Próba standaryzacji metod enzymatycznych przez IFCC (International Federation of Clinical Chemistry
and Laboratory Medicine – Międzynarodowa Organizacja Chemii Klinicznej) zaproponowała system
referencyjny, który obejmuje:

 dobrze zdefiniowane metody referencyjne oznaczania aktywności enzymów, które

cechują się linową zależnością wyników pomiaru od stopnia rozcieoczenia materiału,

 stworzenie certyfikowanych materiałów referencyjnych,
 utworzenie sieci laboratoriów referencyjnych

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

5

E

NZYMY

-

WYBRANE ZAGADNIENIA

1. Aminotransferazy a alkoholowe uszkodzenie wątroby

o W większości typów schorzeo wątroby aktywnośd AlAT jest wyższa niż AspAT; wyjątek

stanowi alkoholowe zapalenie wątroby, w którym może byd wiele przyczyn podwyższenia
aktywności AspAT.

o Alkohol indukuje uwalnianie mitochondrialnej AspAT z komórek bez ich widocznego

uszkodzenia.

o Niedobór pirydoksyny, częsty u alkoholików, zmniejsza aktywnośd wątrobowej AlAT

2. Wskaźnik de Ritisa

Określa stosunek poziomu (aktywności) aminotransferazy asparaginianowej do poziomu
aminotransferazy alaninowej (AST/ALT).
W warunkach prawidłowych parametr ten jest nieco wyższy od 1
Wskaźnik <1 (AspAT < AlAT) sugeruje takie choroby miąższu wątroby, jak:

 przewlekłe wirusowe zapalenia wątroby,
 hemochromatoza,
 uszkodzenia polekowe i toksyczne,
 autoimmunologiczne zapalenie wątroby

Wskaźnik >1 (AspAT > AlAT) może świadczyd o:

 toksycznym uszkodzeniu wątroby (często w praktyce wskazywad to może na alkoholową

chorobę wątroby AspAT/AlAT>2)

 marskości wątroby
 pozawątrobowej przyczynie - zap. trzustki, zawał serca, uszkodzenie mięśni szkieletowych

3. Wielokrotnośd górnej granicy normy – znaczenie diagnostyczne

o 100x – ciężkie uszkodzenie wątroby spowodowane działaniem toksyn
o W przebiegu ostrego WZW wzrost aktywności AlAT i AspAT jest co najmniej 10-krotny

powyżej górnej granicy normy, a często 20-30-krotny i wyższy

o W przebiegu przewlekłego WZW wzrost aktywności AlAT i AspAT jest niższy niż 10-krotny

powyżej górnej granicy normy

o W autoimmunologicznym zapaleniu wątroby aktywnośd AlAT i AspAT zwykle fluktuują

w granicach 100-1000 U/l

o W marskości aktywnośd AlAT i AspAT najczęściej jest nieznacznie podwyższona (np. 1,5-5 razy

powyżej g.g.n.), ale aminotransferazy w normie nie wykluczają marskości wątroby

o Przewlekłe, niewielkie podwyższenie aktywności AlAT i AspAT u pacjentów bezobjawowych

może byd spowodowane najczęściej: nadużywaniem alkoholu, stosowanymi lekami,
stłuszczeniem wątroby (niealkoholowym)

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

6

4. Diagnostyka enzymatyczna chorób wątroby – porównanie:

5. Przykładowe enzymy oznaczane w moczu:



Amylaza



NGAL - lipokaina związana z żelatynazą neutrofili

 Nowy wczesny marker ostrej niewydolności nerek, może byd oznaczany we krwi i w

moczu, przy czym w moczu notuje się wyższy wzrost stężenia (>100-krotny) niż w osoczu
(ok. 10-krotny).

 Ekspresja NGAL w komórkach cewek nerkowych znacznie wzrasta w związku z ich

niedokrwieniem lub uszkodzeniem przez nefrotoksyny.

 ABBOTT Architect – oznaczenie immunochemiluminescencyjne (CMIA)



N-acetylo-β-D – heksozoaminidaza

 W moczu oznaczana jest przede wszystkim izoforma a składająca się z podjednostek



 NAG jest wczesnym markerem uszkodzenia nerek oraz markerem nasilającej się

niewydolności nerek

C

HOROBY WĄTROBY

AST

ALT

AST/ALT

ALP

GGT

Ostre zapalenie

wątroby



10-20 x



10-30 x

<1

N



3 x

N



3 x

Przewlekłe zapalenie

wątroby

N



10 x

N



8 x

>1

N



3 x

N



3 x

Choroba alkoholowa

N



7 x

v N



2 x

>5

N



2 x



1-10 x

Cholestaza

wewnątrzwątrobowa

N



5 x

N



3 x

>1,5

N



7 x

N



7 x

Cholestaza

zewnątrzwątrobowa

N



3 x

N



5 x

<1,5



2-10 x



2-10 x