Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

1

E

LEKTROFOREZA BIAŁEK SUROWICY

Frakcja

%

Białka

Albuminy

60-71

Albumina

Alfa 1

1.4-2.9



1antytrypsyna, kw.



1glikoproteid,



1mikroglobulina,



1 chymotrypsyna

Alfa 2

7-11

haptoglobina, a2 makroglobulina

Beta

8-13

Transferyna, ceruloplazmina, hemopeksyna,



lipoproteina, C3 ukł. dopełniacza

Gamma

9-16

Immunoglobuliny, białko C-reaktywne

Obraz elektroforetyczny charakterystyczny dla gammapatii monoklonalnych (szpiczak mnogi):



Białko monoklonalne zlokalizowane jest we frakcji gamma (najczęściej immunoglobuliny IgG
oraz IgM) lub we frakcji beta (najczęściej immunoglobulina klasy IgA).



We frakcji gamma brak fizjologicznie występującej poliklonalnej frakcji immunoglobulinowej
– prawidłowe plazmocyty i ich produkt- poliklonalna immunoglobulina zostały „wyparte”
przez patologiczny klon plazmocytów oraz białko monoklonalne.



Niska albumina i podwyższona frakcja alfa2 mogą sugerowad towarzyszące szpiczakowi
uszkodzenie nerek.

Obraz elektroforetyczny charakterystyczny dla zespołu nefrotycznego (nerczycowego):



Obniżona frakcja albuminowa wskazuje na utratę albuminy z moczem (uszkodzenie nerek).



Wzrost frakcji alfa2 z powodu wzrostu stężenia białka alfa2 makroglobuliny (alfa2
makroglobulina o masie cząsteczkowe 725 kDa nie przechodzi przez uszkodzoną błonę
podstawną kłębuszków nerkowych, stąd względny (w stosunku do pozostałych białek
osocza) wzrost stężenia tego białka. W zespole nefrotycznym, z przyczyn idiopatycznych,
wzrasta również bezwzględne stężenie alfa2 makroglobuliny.



Wzrost frakcji beta może byd spowodowany wzrostem stężeo białek ostrej fazy na skutek
reakcji zapalnej obejmującej kłębuszki nerkowe.



Możliwa widoczna hipoproteinemia (obniżenie stężenia białka całkowitego)

Obraz elektroforetyczny charakterystyczne dla chorób wątroby



Obniżona frakcja albuminowa (spadek produkcji albuminy)



Podwyższona frakcja gamma – chorobom wątroby często towarzyszą przewlekłe procesy
zapalne.



Widoczny także charakterystyczny dla chorób wątroby tzw. ”mostek beta-gamma”.

Obraz charakterystyczny dla przewlekłego procesu zapalnego oraz chorób autoimmunologicznych:



Wzrost frakcji gamma (hipergammaglobulinemia) – wzrost produkcji poliklonalnych
immunoglobulin jako reakcja na stan zapalny lub na tle odpowiedzi autoimmunologicznej.



Możliwy wzrost frakcji a1 oraz a2 spowodowany wzrostem stężeo białek ostrej fazy.

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

2

Obraz charakterystyczny dla ostrego stanu zapalnego:



Wzrost frakcji a1 oraz a2 (wzrost orozomukoidu,



1 antytrypsyny i haptoglobiny).



Brak charakterystycznego wzrostu frakcji gamma.

________________________________________________________________________

I

MMUNOFIKSACJA BIAŁEK SUROWICY

Jest badaniem wykonywanym w diagnostyce gammapatii monoklonalnej:

 Metoda bardziej czuła niż tradycyjna elektroforeza na żelu agarozowym
 Pozwala ocenid klasę oraz typ immunoglobuliny monoklonalnej

Zasada metody:



Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym (warunki standardowe)



Reakcja antygen – przeciwciało



Usunięcie niezwiązanego przeciwciała



Utrwalenie białka na żelu (kwas TCA)



Barwienie (kwaśny fiolet)

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

3

M

ETODY OZNACZANIA BIAŁEK

wartości referencyjne białka całkowitego w surowicy: 60-80 g/L

1. Metoda biuretowa

o Skład odczynnika : CuSO

4

, winian sodowo – potasowy, NaOH, KJ (winian sodowo-potasowy -

stabilizator, KJ zapobiega redukcji alkalicznego kompleksu miedzi)

o Pomiar absorbancji – 540 nm

o Zakres liniowości metody: 2 - 15 g/L
o Stosunkowo mało substancji interferujących (sole amonowe, jony magnezu, biuret)
o Intensywnośd barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu aminokwasowego

oznaczanego białka (dla różnych białek podobny współczynnik absorbcji molowej)

o możliwośd przystosowania do suchej chemii
o Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w surowicy (analizator Hitachi – Roche Diagnostics)
o Metoda użyteczna również do oznaczania peptydów

2. Metoda Lowry’ego (Folin-Ciocalteu)

o Skład odczynników:

A) CuSO

4

,winian sodowo – potasowy, NaOH, Na

2

CO

3

B) Odczynnik Folin-Ciocalteu (mieszanina kwasu fosfowolframowego i kwasu

fosfomolibdenowego)

Ponieważ odczynnik Folin-Ciocalteu nie jest stabilny w środowisku alkalicznym, musi byd prowadzona

jako reakcja dwuetapowa

o Pomiar absorbancji - 750 nm

o Zakres liniowości metody: 10mg/L – 1 g/L
o Wiele substancji interferujących (np. Tris, HEPES, EDTA, SDS i inne detergenty, mocznik, DTT,

merkaptoetanol, związki tiolowe, redukujące cukry)

o reakcja wymaga ścisłej kontroli pH
o Trudna do automatyzacji
o Natężenie powstałej barwy różna dla różnych białek (zależy od zawartości aminokwasów:

tyrozyny, tryptofanu, cysteiny – problemy z otrzymaniem uniwersalnej krzywej kalibracyjnej)

3. Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA)

o Skład odczynnika: Na2CO3, NaOH , winian sodowy - Na

2

C

4

H

4

O

6 ,

CuSO4, BCA

o Pomiar absorbancji – 562 nm

o Zakres liniowości metody: 0,1–1 g/L (mikrometoda) lub 0,5 – 10 mg/L (makrometoda)
o Niewielkie różnice współczynnika absorpcji dla różnych białek
o Reakcja jednoetapowa - kompleks jest stabilny w środowisku alkaicznym
o Znacznie większa tolerancja metody na większośd czynników interferujących z metoda

Lowry’ego (przede wszystkim detergenty)

o Możliwośd automatyzacji metody
o Reakcję przeprowadza się w temperaturze pokojowej 37 °C

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM

2010/2011

Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej

4

4. Metoda Bradforda

o Skład odczynnika: Coommassie Brillant Blue G- 250, 95% etanol, 85% kwas fosforowy
o Pomiar absorbancji – 595 nm

o Wysoce specyficzna dla białek
o Zakres liniowości metody: 1-10 µg (mikrometoda) 10-100 µg (makrometoda)
o Test kompatybilny z większością substancji interferujących w metodach Lowrego i BCA
o Nieliniowa krzywa kalibracyjna
o Współczynnik absorpcji ściśle zależy od rodzaju mierzonego białka (przede wszystkim od

zawartości takich aminokwasów jak lizyna i arginina w białku), bardzo ważny dobór
odpowiedniej krzywej kalibracyjnej

o Ważny czas prowadzenia reakcji – kompleks barwnik – białko jest stabilny przez około 1

godzinę

5. Absorbancja w nadfiolecie

o Pomiar absorbancji roztworu białka przy długości fali 280 nm
o Używana do oszacowania stężenia białka, lub do detekcji np. przez detektor HPLC
o Światło absorbowane jest przede wszystkim przez aromatyczne aminokwasy obecne w białku

(tyrozyna, tryptofan)

o Znaczna ilośd substancji interferujących (np. kwasy nukleinowe)

6. Metoda nefelometryczna

o Zasada metody: pomiarze natężenia światła rozproszonego pod kątem różnym od 180 stopni

w stosunku do kąta padania światła (najczęściej pod kątem 90 lub 45 stopni).

o BEHRING Nephelometer II (immunonefelometria):

 Szeroki panel oznaczanych białek:

(albumina, prealbumina, CRP (hs CRP), transferyna, immunoglobuliny, transferyna,
ceruloplazmina, haptoglobina, składniki dopełniacza, SAA, cystatyna C,beta2 mikroglobulina,
alfa1 maktoglobulina, łaocuchy lekkie immunoglobulin – kappa, lambda)

 Wykorzystywany materiał : surowica/ osocze, mocz, PMR
 Nie nadaje się do oznaczeo w roztworach wstępnie mętnych (lipemia)

7. Metoda turbidymetryczna

o Metoda zmętnieniowa: z użyciem kwasu TCA (trichlorooctowego), kwasu sulfosalicylowego,

chlorku benzetonium (w środowisku NaOH)

o Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w moczu, PMR (analizator Hitachi – Roche

Diagnostics)

o Zakres liniowości metody: 2 – 200 mg/dl