Zasady diagnostyki

chorób mitochondrialnych

u dzieci

Dr Dorota Piekutowska-Abramczuk

Zakład Genetyki Medycznej IPCZD

Warszawa, 02.12.2011

Chorobą mitochondrialną

nazywamy stan chorobowy wywołany

uwarunkowaną genetycznie zmianą budowy

białka, pierwotnie zaburzającą przebieg

procesu fosforylacji oksydacyjnej w komórce.

45

7

38

4

4

11

1

10

13

3

10

16

2

14

Podjednostki

mtDNA

nDNA

System fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS)

Dehydrogenaza
bursztynianowa

Dehydrogenaza

NADH

Kompleks

cytochromów bc1

Oksydaza

cytochromu c

Syntaza ATP

Zaburzenia aktywności kompleksów – izolowane lub złożone

najczęściej – KI i KIV

Choroby mitochondrialne

Częstość występowania 1:8500 - 1:5000

Prawdopodobnie wiele przypadków pozostaje nierozpoznanych

Heterogenność kliniczna, biochemiczna i genetyczna

Patomechanizm

obniżenie efektywności syntezy ATP,

wzrost produkcji reaktywnych form tlenu,

zaburzenia wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia.

Choroby mitochondrialne

Uwarunkowane mutacjami w genach:

› mitochondrialnych

» strukturalne podjednostki OXPHOS

» tRNA

» rRNA

› jądrowych

» strukturalne podjednostki OXPHOS

» niestrukturalne

»› czynniki towarzyszące (

assembly factors

) (I-V)

»› czynniki zaburzające replikację mtDNA

»› zaburzające transkrypcję i translację genów OXPHOS

»› zaburzające import białek mitochondrialnych i in.

>50% wszystkich mutacji w mtDNA (gł.

MTTK, MTTL1, MTTI)

Dziedziczenie

matczyne

autosomalne recesywne

autosomalne dominujące

sprzężone z chromosomem X

Przypadki sporadyczne



Występuje w 10

3

– 10

5

liczby kopii



Kolista cząsteczka o wielkości 16 569

kpz (nić H i L)



Zawiera 37 genów (13 strukturalnych

podjednostek systemu OXPHOS, 2 rRNA,

22 tRNA)



Małe lub brak przestrzeni

międzygenowych



Brak intronów



2 małe obszary niekodujące: pętla D –

zawiera miejsca inicjacji transkrypcji i

replikacji nici H i miejsce startu replikacji

nici L



Odstępstwa od uniwersalnego kodu

genetycznego (np. TGA (Stop) Trp)

Mitochondrialne DNA

Genetyka mitochondrialna

• Dziedziczenie matczyne

Tylko kobieta przekazuje zmutowany gen swemu potomstwu, zarówno córce

jak i synowi (nieliczne mtDNA plemnika są aktywnie usuwane we wczesnych

podziałach zygoty).

• Poliploidalność mitochondriów (setki mitochondriów, a w każdym do 10

cząsteczek mtDNA)

• Szybkie tempo ewolucji (mała wydajność systemów naprawy, brak

histonów, brak zjawiska rekombinacji, nadprodukcja ROS)

• Heteroplazmia i wartość progowa

Prezentacja objawów zależy od poziomu heteroplazmii i wartości progowej.

Segregacja mitotyczna (efekt

bottleneck

) w oogenezie tłumaczy częste

zmiany poziomu mutacji w kolejnych pokoleniach i znaczne zróżnicowanie

fenotypowe.

Cechy mutacji mtDNA

Heteroplazmatyczne
Homoplazmatyczne

Stabilne
• silna korelacja genotyp-fenotyp
• mała/brak zmienność poziomu mutacji w różnych tkankach
• mała/brak zmienność poziomu w czasie (podczas rozwoju płodowego i

pourodzeniowego)

m.8993T>G, m.8993T>C

Niestabilne
• bardzo zróżnicowany obraz kliniczny
• niejednorodne tkankowe rozmieszczenie mutacji
• duża zmienność poziomu mutacji w czasie

m.3243A>G

Choroby mitochondrialne u dzieci



Częściej wynikają z mutacji w jądrowym DNA



Cięższe od objawiających się w wieku późniejszym i częściej

wielonarządowe;



Dotyczą dysfunkcji wątroby (MDS), choroby nerek (MDS, deficyt

KIII) i zaburzeń hemopoezy (zespół Pearsona)



Opóźnienie rozwoju w połączeniu z kwasicą mleczanową



Postępujący regres rozwojowy, utrata posiadanych umiejętności

(zespół Leigha)



Niespecyficzne objawy zaburzenia w odżywianiu, wzrastania,

drgawki, częste infekcje



Rzadko obecne RRF

Rozpoznanie choroby mitochondrialnej



Zdefiniowane, wysoce prawdopodobne

analiza mutacji



Prawdopodobne

biopsja mięśnia



Możliwe

obserwacja, biopsja mięśnia, zabezpieczenie

materiału w wypadku zgonu

Materiał biologiczny



mięsień



krew obwodowa



wymaz z nabłonka jamy ustnej



mocz



wątroba



fibroblasty



włosy



płyn owodniowy



kosmki kosmówki

Oragene DNA

www.dnagenotek.com

Biopsja mięśnia

kompleksowe potwierdzenie rozpoznania



Ocena morfologiczna (włókna RRF)



Badanie histochemiczne (oksydaza cytochromu c mozaikowość,

dehydrogenaza bursztynianowa)



Badanie proteomiczne (obecność i aktywność kompleksów łańcucha

oddechowego i ich poszczególnych podjednostek)



Analiza enzymatyczna (aktywność kompleksów łańcucha oddechowego i

syntazy cytrynianowej)



Analiza molekularna

Diagnostyka molekularna chorób

mitochondrialnych w ZGM IPCZD

1. Identyfikacja powszechnych mutacji
• m.8993T>C/G (

MTATP6

) - NARP/MILS

• m.3243A>G (

MTTL1

) - MELAS

• m.8344A>G (

MTTK

) - MERRF

• delecja 4977pz (m.8470_13446del) KSS i in. zespoły delecyjne
• m.11778G>A (

MTND4

), m.3460G>A (

MTND1

), m.14484T>C (

MTND6

) - LHON

• g.1541G>A (

SCO2

) - deficyt białka SCO2

• c.845_846delCT, c.311_312insAT312_321del10(

SURF1

) – LS

2. Poszukiwanie mutacji w innych, znanych genach związanych z fenotypem
•

MTND1-MTND6 -

LS

•

DGUOK, MPV17

- HC-MDS

3. W przyszłości dalsza analiza molekularna obejmująca geny nie badane lub nowo

odkryte.

podstawowy

skrining mtDNA

Zespół Leigha sprzężony z

deficytem COX i mutacjami w

genie

SURF1

S1

(COXI)

OXA1, COX10, COX15,

SURF1

Hem a, Hem a

3

COX11, COX17, SCO1, SCO2

Cu

B

COX11

COXIV

S2

SURF1

,

OXA1

COXII

COX17, SCO1, SCO2

Cu

A

COXIII, Va, Vb, VIb,

COXVIc, VIIb, VIIc, VIII

S3

COXVIa, VIIa

S4

Składanie kompleksu

COX

NH

2

61-79

274-290 COOH

1

300

TS N-TM C-TM

1

2

4

6

7

8

9

5

3

1 2

4

6

7

8

9

5

3

Gen

SURF1

9q34

4664 pz

965 pz

Białko SURF1

Mutacja

Liczba

alleli

Częstość

alleli (%)

Liczba

homozygot

Oczekiwana

zmiana w budowie

białka

c.39delG

1

1,4

0

p.Ala13AlafsX71

c.311_312insAT

312_321 del10

8

11,1

2

p.Pro104ProfsX105

c.688C>T

1

1,4

0

p.Arg230X

c.704T>C

1

1,4

0

p.Met235Thr

c.752-1G>C

4

5,5

0

spl int7

c.756_757delCA

1

1,4

0

p.Ser252SerfsX290

c.800_801insT

1

1,4

0

p.Leu267LeufsX290

c.821A>G

1

1,4

0

p.Tyr274Cys

c.845_846delCT

52

75

20

p.Leu281LeufsX290

44/36 pacjentów z LS

14

0

0

3

54

8

0

Częstość nosicielstwa powszechnej delecji w różnych populacjach

Badania populacyjne

Mutację c.845_846delCT w genie

SURF1

wykryto na 75% alleli

8 heterozygotycznych nosicieli/ 2890 noworodków

częstość nosicielstwa delecji 1: 357

(0.28%)

częstość nosicielstwa choroby 1: 277

(0.36%)

częstość choroby w populacji polskiej

1: 306 400

SURF1

69%

SCO2

4,9%

MTND1,3,5,6

14,7%

MTATP6

9,8%

MTTK

1,6%

Zespół Leigha w populacji polskiej

Schemat diagnostyki molekularnej w zespole

Leigha

1. Identyfikacja powszechnych mutacji w genie S

URF1

(c.845_846delCT,

c.311_312insAT312_321del10)

2. Identyfikacja mutacji w genie

MTATP6

(m.8993T>C/G)

3. Poszukiwanie mutacji w genach

MTND1-MTND6

4. Identyfikacja powszechnej mutacji w genie

SCO2

(g.1541G>A)

5. Identyfikacja mutacji za pomocą techniki MLPA: m.3243A>G (

MTTL1

),

m.8344A>G (

MTTK

), m.11778G>A (

MTND4

), m.3460G>A (

MTND1

),

m.14484T>C (

MTND6

)

6. W przyszłości dalsza analiza molekularna obejmująca geny nie badane lub nowo

odkryte, sekwencjonowanie całego genomu mitochondrialnego.

Mitochondrialny zespół deplecyjny (MDS)

(OMIM 251880)



heterogenna grupa chorób charakteryzującą się tkankowo

specyficznym obniżeniem ilości kopii mtDNA - deplecji (do poniżej

30%);



Wynika z zaburzeń replikacji mtDNA lub zaburzeń równowagi puli

nukleotydów, dostępnych do syntezy mtDNA;



odpowiada za ok. 50% złożonych deficytów OXPHOS u dzieci;



fenotypy: wątrobowo-mózgowy, mózgowo-mięśniowy, mięśniowy;



większość objawia się w okresie noworodkowym (wiotkość mięśni,

niewydolność wątroby, tubulopatia nerkowa, kwasica mleczanowa,

zgon przed ukończeniem 1 r.ż), lub we wczesnym dzieciństwie

(izolowana miopatia z regresją funkcji ruchowych lub wolno

postępująca encefalomiopatia);



objawy mogą początkowo ograniczać się do jednego narządu lub

tkanki, później dotyczą wielu narządów;



dziedziczony w sposób autosomalny recesywny;



w ok. 20-80% przypadków nie udaje się ustalić molekularnego

podłoża choroby.

Geny związane z MDS

TK2

RRM2B

f. mięśniowa

SUCLA2

TYMP

f. mózgowo-mięśniowa

SUCLG1

DGUOK

MPV17

f. wątrobowo-mięśniowa

C10orf2

POLG1

Najczęstsza przyczyna chorób mitochondrialnych u człowieka
adPEO i arPEO, parkinsonizm, SANDO (zespół zaburzeń

czuciowo-ruchowych), męska niepłodność

Postać wątrobowo-mózgowa (OMIM #251880)

Objawy:

od urodzenia do 6 mies. ż.

Początkowo – powiększenie wątroby i postępująca niewydolność, wymioty,

zaburzenia wzrastania, hipotonia niewielkiego stopnia;

koagulopatia, hipoglikemia, poziom całkowitej i związanej bilirubiny, AlAT i

AspAT, poziom tyrozyny i fenyloalaniny w osoczu;

później – odjawy neurologiczne – ataksja, drżenia, dystonia, neuropatia,

oczopląs, ciężkie upośledzenie rozwoju;

kwasica mleczanowa, znaczny wzrost stężenia AFP,

zgon przed końcem 1 r.ż.

Aktywność kompleksów łańcucha oddechowego obniżona (z wyjątkiem

kompleksu II)

Histopatologia: wielko- i drobnopęcherzykowate stłuszczenie, cholestaza

hepatocytarna i kanalikowa, włóknienie, odkładanie żelaza

Z. Alpersa

Padaczka oporna na leczenie, regresja rozwoju psychoruchowego, dysfunkcja

wątroby; przebieg postępujący, rokowanie niekorzystne.

W 50% przypadków czynnikiem inicjującym uszkodzenie wątroby jest podanie

kwasu walproinowego

Diagnostyka prenatalna

W rodzinach z defektem jądrowego DNA TAK
W rodzinach z defektem mtDNA ???

Diagnostyka preimplantacyjna, selekcja płci ???

m.8993 heteroplazmia <50%

prawdopodobnie zdrowe, >80%

chore

m.3243 <15%

prawdopodobnie zdrowe

<18%

zdrowe z prawdopodobieństwem 85%

Ścisła korelacja między poziomem mutacji a ciężkością objawów

Równy poziom mutacji w różnych tkankach

Brak zmian poziomu mutacji w czasie

OBIETNICA POSIADANIA

ZDROWEGO DZIECKA

ZMNIEJSZENIE RYZYKA URODZENIA

CHOREGO DZIECKA

Mitochondria w sieci

Kliniczne i molekularne informacje dla lekarzy i badaczy

On-line Mendelian Inheritance in Man www.ncbi.nlm.nih.gov

Mitomap www.mitomap.org

Geneclinics www.geneclinics.org

Dane molekularne Uppsala http://www.genpat.uu.se/mtDB/index.html

Dane biochemiczne i molekularne

Mitop mips.gsf.de/proj/medgen/mitop

Mitodat http://www-lecb.ncifcrf.gov/mitoDat/

Informacje dla pacjentów

United Mitochondrial Diseases Foundation (USA) www.umdf.org

Mitolinks (UK) http://www.communigate.co.uk/ne/

mitolinks/index.phtml

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ