Wykład 3
Mikrobiologia Przemysłowa
POZYSKIWANIE SZCZEPÓW MIKROORGANIZMÓW O
ZNACZENIU PRZEMYSA
OWYM (cz. 1)
1
Drobnoustroje w przemyśle
}ð Nowoczesne technologie wymagajÄ… czÄ™sto użycia szczepów
produkcyjnych o ściśle określonych właściwościach metabolicznych
}ð SpoÅ›ród drobnoustrojów dzikich, wystÄ™pujÄ…cych w Å›rodowisku,
można wyselekcjonować szczepy wyróżniające się przydatnością do
określonych celów biotechnologicznych
2
1
Wykład 3
y
ródła szczepów mikroorganizmów
o znaczeniu przemysłowym
y
ródło
szczepu
Åšrodowisko
Åšrodowisko Kolekcje
przekształcone Inne z
ródła
naturalne szczepów
przez człowieka
Dobór środowiska często decyduje o właściwościach mikroorganizmów, które izolujemy
Zwykle wymagają udoskonalenia określonych cech produkcyjnych
3
Mikroorganizmy
Mikroorganizmy hodowalne
niehodowalne
ok. 1%
ok. 99%
Kolekcja szczepów
eDNA
DNA
Testy
selekcyjne
(skrining)
Biblioteka
Biblioteka
metagenomowa
genomnowa
(z
ródło genów)
(z
ródło genów)
Szczep przemysłowy
4
2
Wykład 3
Åšrodowisko naturalne
}ð Poszukiwanie nowego, dotÄ…d nieopisanego szczepu o pożądanych przez nas
właściwościach
}ð Wody powierzchniowe, gruntowe, gorÄ…ce z
ródła, gleby, lodowce itp.
Jaskinia Demianowska Antarktyda
Lodowiec
Park Yellowstone Pustynia Danakilska Kominy hydrotermalne
5
Środowisko przekształcone przez człowieka
}ð Åšrodowisko wzbogacone zwiÄ…zkami / czynnikami,
które naturalnie nie są powszechne w środowisku
}ð Obecność mikroorganizmów o specyficznych
właściwościach i wymaganiach pokarmowych
}ð Np. tereny uprzemysÅ‚owione, po katastrofach
ekologicznych
6
3
Wykład 3
Kolekcje przechowalnicze szczepów
}ð Komercyjne i przemysÅ‚owe:
}ð Zapewnienie dostÄ™pnoÅ›ci odpowiednich kultur starterowych mikroorganizmów o
już ustalonych cechach
np. kolekcje piwowarskie, winiarskie, jogurtowe
}ð Badawcze
}ð Przechowywane sÄ… szczepy dobrze poznane
i wstępnie zaklasyfikowane mikroorganizmy
Szczepy z kolekcji można poddawać
screeningowi pod kątem wielu aktywności
7
Inne z
ródła
}ð Modyfikacja scharakteryzowanych już szczepów
}ð Szczepy (dobrze scharakteryzowane) z kolekcji mikroorganizmów mogÄ… być gospodarzem dla
genów heterologicznych, pochodzących z innych organizmów
}ð y
ródłem genów może być DNA mikroorganizmów wyizolowanych i/lub
przechowywanych w kolekcjach przechowalniczych, poddanych skreeningowi lub
DNA metagenomowe (środowiskowe).
8
4
Wykład 3
Proces pozyskiwania mikroorganizmów do zastosowań w
przemyśle obejmuje następujące po sobie etapy
1. Pobranie próby ze środowiska naturalnego
2. Hodowla wzbogacajÄ…ca
3. Test selekcyjny
4. Testy fermentacyjne
5. Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu
9
Pozyskiwanie szczepów mikroorganizmów
o znaczeniu przemysłowym
Izolacja nowych Badanie znanych szczepów
mikroorganizmów
" nowe sposoby hodowli
o pożądanych cechach
" bardziej czułe metody analityczne
" modyfikacje
10
5
Wykład 3
Pozyskiwanie szczepów mikroorganizmów
o znaczeniu przemysłowym
11
1. Pobranie próby ze środowiska
Øð Åšrodowisko (naturalne lub przeksztaÅ‚cone przez czÅ‚owieka), to wybrane przez nas na
drodze racjonalnego wyboru z
ródło mikroorganizmów, z którego spodziewamy się
wyizolować, z zastosowaniem klasycznych technik mikrobiologicznych, mikroorganizmy o
właściwościach, które stanowią o ich atrakcyjności biotechnologicznej
Kryterium wyboru miejsca pobrania próby
założenia projektowe
12
6
Wykład 3
Pobranie próby ze środowiska
}ð Metody stosowane przy pobieraniu i przechowywaniu próbek z
określonych środowisk naturalnych zdeterminowane są
właściwościami fizyko-chemicznymi mikroorganizmów w nim
występujących, na których nam zależy.
13
Pobranie próby ze środowiska
}ð pobranie materiaÅ‚u zawierajÄ…cego jak najwiÄ™cej mikroorganizmów o
poszukiwanych cechach przy jednoczesnej eliminacji / ograniczeniu
występowania drobnoustrojów niepożądanych.
Dominant
Szczep bakterii o poszukiwanych
właściwościach
14
7
Wykład 3
Pobranie próby ze środowiska
Øð ZaÅ‚ożenie projektowe:
wydajna enzymatyczna hydroliza laktozy w mleku w temperaturze 10-15oC
vðMiejsce pobrania próby:  Å›rodowiska naturalne obfitujÄ…ce w gatunki mikroorganizmów
psychrofilnych i psychrotrofowych
" gleba regionów polarnych
" gleby wysokogórskie
" wody jezior polarnych i wysokogórskich
" wody mórz i oceanów
" przewody pokarmowe ryb i skorupiaków
stale żyjących w strefie polarnej
15
Pobranie próby ze środowiska
Øð ZaÅ‚ożenie projektowe:
przetwórstwo skrobi  wytwarzanie syropów glukozowych
vðMiejsce pobrania próby:  Å›rodowiska naturalne obfitujÄ…ce w gatunki mikroorganizmów
termofilnych i hipertermofilnych
" gorÄ…ce z
ródła
" solfatary
Øð ZaÅ‚ożenie projektowe:
nowe antybiotyki
vðMiejsce pobrania próby:  Å›rodowiska naturalne obfitujÄ…ce w gatunki promieniowców
" gleba
" rozkładająca się masa roślinna
" torfowiska
16
8
Wykład 3
Pobranie próby ze środowiska
Øð ZaÅ‚ożenie projektowe:
bioremediacja gleby skażonej produktami ropopochodnymi
vðMiejsce pobrania próby: Å›rodowiska obfitujÄ…ce w gatunki mikroorganizmów
zdolnych do biodegradacji węglowodorów
" gleba okolic lotnisk
" gleba okolic stacji paliw
" gleba okolic torowisk kolejowych
Øð ZaÅ‚ożenie projektowe:
bioremediacja gleby skażonej pierwiastkami radioaktywnymi
vðMiejsce pobrania próby: Å›rodowiska obfitujÄ…ce w gatunki mikroorganizmów
odpornych na promieniowanie jonizujÄ…ce
17
Pobranie próby ze środowiska
Izolacja gatunków mikroorganizmów dominujących w populacj drobnoustrojów
w danym środowisku nie stanowi problemu
Problem: mikroorganizmy potencjalnie przydatne w procesach przemysłowych
to tylko niewielki odsetek całej populacji
Udział bakterii rozkładających paliwa w ogólnej
liczbie drobnoustrojów glebowych [%]
Miejsce pobrania próbki
Lotnisko 0,2  2,2
Stacja paliw 0,01  0,29
Torowisko kolejowe 0,03  1,09
18
9
Wykład 3
2. Sposoby zwiększania liczebności
poszukiwanych drobnoustrojów
ØðOddziaÅ‚ywanie na Å›rodowisko przed pobraniem próby
ØðWprowadzenie do Å›rodowiska wabików  puÅ‚apek
ØðWstÄ™pna obróbka fizyczna lub mechaniczna próbki
ØðHodowla wzbogacajÄ…ca
19
Oddziaływanie na środowisko przed
pobraniem próby
Zwiększenie liczby promieniowców
1. Wprowadzenie środka
selekcyjnego (Atrazyna)
2. Inkubacja
Gleba
3. Pobranie
próby
4. Posiew
20
10
Wykład 3
Stosowanie wabików
1. Wprowadzenie wabika
(elementy na których rozwijają się pożądane
Gleba
mikroorganizmy)
Pałeczki powlekane parafiną  Streptomyces
Pyłek kwiatowy drzew iglastych  Actinoplanaceae
2. Inkubacja 3. Pobranie próby
4. Posiew
21
Wstępna obróbka fizyczna lub mechaniczna
1. Pobranie próby
Gleba
2. Wstępna obróbka
- Zmieszanie próby z kredą  zwiększenie liczby
3. Inkubacja
promieniowców i redukcja grzybów
- Odwirowywanie spor promieniowców
4. Posiew - Inkubacja próbki w odpowiednio niskiej/wysokiej
temperaturze
22
11
Wykład 3
Hodowla wzbogacajÄ…ca
Hodowla wzbogacajÄ…ca - metoda ta opiera siÄ™ na wprowadzeniu do
próbki pobranej ze środowiska związków chemicznych mogących
pełnić rolę czynnika selekcyjnego, pozwalającego na zmiany
liczebności mikroorganizmów tworzących populację
drobnoustrojów zawartych w badanej próbce, podczas jej inkubacji w
określonych warunkach fizykochemicznych, tj. temperatura, czas
inkubacji.
23
H. wzbogacająca z zastosowaniem podłoży
wzbogacajÄ…cych
1. Pobranie próbki
środowiskowej
Gleba
2. Inkubacja w pożywce zawierającej
czynnik selekcyjny
3. Posiew
Np. glicerol lub laktoza jako z
ródło węgla
cykloheksamid lub nystatyna - hamowanie wzrostu
grzybów
Tetracykliny  hamowanie wzrostu bakterii
24
12
Wykład 3
Metody izolacji czystych kultur
}ð Aby móc wyizolować konkretny
szczep mikroorganizmu i go
zidentyfikować w pierwszej
kolejności należy wyodrębnić go w
postaci czystej kultury
}ð Najczęściej izolowane w postaci
kolonii z podłóż zestalonych
25
Posiew  izolacja czystych kultur
ØðTechnika seryjnych (wielokrotnych) rozcieÅ„czeÅ„ (Józef Lister)
ØðMetoda pÅ‚ytkowa (Robert Koch)
}ð metoda rozsiewu (posiew redukcyjny, metoda suchych rozcieÅ„czeÅ„)
}ð metoda pÅ‚ytek lanych
}ð metoda wysiewu powierzchniowego
26
13
Wykład 3
Posiew  izolacja czystych kultur
}ð Posiew technikÄ… seryjnych (wielokrotnych) rozcieÅ„czeÅ„ pozwala
bardzo dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie.
}ð PodstawÄ… metod iloÅ›ciowych jest prawo mówiÄ…ce, że z jednej
bakterii w roztworze wyjściowym powstaje na drodze podziałów
jedna kolonia.
27
Technika seryjnych (wielokrotnych)
rozcieńczeń
Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL).
Z kolejnych rozcieńczeń wykonuje się posiewy na podłoże płynne (min. 2 powtórzenia) i inkubuje
w odpowiedniej temperaturze.
Odczytuje się próby dodatnie (wzrost w podłożu) i korzystając z tablic McCrady ego wylicza się
NPL.
W końcowych rozcieńczeniach nie powinno być już mikroorganizmów.
28
14
Wykład 3
Metoda płytkowa
}ð Stosowana do
}ð OkreÅ›lania liczby mikroorganizmów
}ð Izolowania czystych kultur
}ð Obserwacji morfologii kolonii
29
Metoda płytkowa
}ð Posiew odpowiednio rozcieÅ„czonej próbki na
podłoże stałe  w 1 cm3 powinno znajdować się od
30 do 300 komórek.
}ð Posiew można wykonać metodÄ…
}ð wgÅ‚Ä™bnÄ… (komórki mieszane z podÅ‚ożem i
wylewane)
}ð powierzchniowÄ… (komórki wysiewane na
powierzchniÄ™)
30
15
Wykład 3
Metoda wysiewu powierzchniowego
Zliczanie jednostek tworzÄ…cych koloniÄ™ (jtk lub cfu  colony forming units)
Wysianie odpowiednich rozcieńczeń w kilku powtórzeniach.
Jeżeli ilość kolonii w powtórzeniach nie różni się więcej niż 10%, to obliczamy średnią wartość
arytmetycznÄ… podstawiajÄ…c do odpowiedniego wzoru.
31
Posiew redukcyjny
Tzw. metoda suchych
rozcieńczeń
32
16
Wykład 3
Typy posiewów redukcyjnych
33
3. Test selekcyjny
}ð Podstawowa metoda identyfikacji mikroorganizmów wykorzystywanych w przemyÅ›le
}ð W konstrukcji tego rodzaju testów poszukuje siÄ™ cechy biochemicznej powiÄ…zanej
bezpośrednio lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmu do produkcji
wybranego bioproduktu
}ð Obecnie dąży siÄ™ do opracowania testów selekcyjnych umożliwiajÄ…cych prostÄ… i
szybką identyfikację mikroorganizmów o poszukiwanych właściwościach
biochemicznych
34
17
Wykład 3
Test selekcyjny  poszukiwanie mikroorganizmu
produkujÄ…cego ²-D-galaktozydazÄ™
Selekcja z wykorzystaniem wskaz
ników
PodÅ‚oże selekcyjne zawiera substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-²-D-galaktopiranozyd)
i induktor IPTG (izopropylo-²-D-galaktopiranozyd)
Klony posiadające aktywność
²-D-galaktozydazy
35
Test selekcyjny  poszukiwanie mikroorganizmu
wytwarzajÄ…cego kwasy organiczne
Selekcja z wykorzystaniem wskaz
ników
Zastosowanie wskaz
nika pH np. błękitu bromofenolowego, czerwieni obojętnej lub fenolowej
Podłoże Chapmana z dodatkiem mannitolu
i wysokim stężeniem NaCl do identyfikacji
gronkowców.
Zakwaszone środowisko
36
18
Wykład 3
Test selekcyjny  poszukiwanie mikroorganizmu o
aktywności proteolitycznej
Zastosowanie podłoża wzbogaconego
Aktywność proteolityczna
odtłuszczonym mlekiem jako wskaz
nika dla
aktywności enzymów proteolitycznych
syntetyzowanych przez mikroorganizmy
37
Test selekcyjny  Metoda podwójnej hodowli na
płytkach Petriego
Do identyfikacji szczepów produkujących antybiotyki, witaminy i aminokwasy
zewnątrzkomórkowo.
Aby uniknąć
zanieczyszczenia
szczepu badanego
szczepem testowym
stosuje siÄ™ cienkÄ… foliÄ™
celofanową lub płytki z
półprzepuszczalną
membranÄ…
A  zastosowanie folii półprzepuszczalnej; B  zastosowanie podwójnych płytek z przegrodą
półprzepuszczalną; C  metoda bloczków agarowych
38
19
Wykład 3
Test selekcyjny  Metoda podwójnej hodowli na
płytkach Petriego
}ð Wokół kolonii wytwarzajÄ…cych antybiotyki powstajÄ… strefy zahamowania wzrostu
szczepu testowego, których wielkość zależy od ilości produkowanego antybiotyku
wydzielanego poza komórkę
}ð W przypadku szczepów nadprodukujÄ…cych aminokwasy lub witaminy stosuje siÄ™
szczepy testowe tzw. mutanty auksotroficzne (pokarmowe).
Strefy wzrostu wokół kolonii testowanych świadczą o wytwarzaniu i wydzielaniu
pozakomórkowym badanego metabolitu
Strefa zahamowania wzrostu
39
Test selekcyjny  poszukiwanie mikroorganizmu
produkującego inhibitor enzymu rozkładającego antybiotyk
Metoda bloczków agarowych połączona z użyciem wskaz
nika barwnego
Oporność mikroorganizmów na antybiotyki wiąże się m.in. z syntezą enzymów , które je inaktywują na
drodze degradacji lub blokowania grup reaktywnych.
Nitrocefina (chromogen)  substrat ²-laktamazy (enzym rozkÅ‚adajÄ…cy antybiotyki ²-laktamowe),
półsyntetyczna cefalosporyna.
I. Zalanie bloczków agarem z dodatkiem ²-laktamazy i inkubacja
II. Pokrycie warstwÄ… agaru z dodatkiem nitrocefiny
Wokół kolonii wytwarzajÄ…cych inhibitory ²-laktamazy pozostaje niezmieniona żółta strefa (enzym
nie rozłożył analogu antybiotyku), zaś cała płytka w wyniku degradacji nitrocefiny, zmienia kolor
na czerwony.
40
20
Wykład 3
Test selekcyjny  poszukiwanie mikroorganizmu
odpornego na wysokie stężenie substancji toksycznej
Metoda płytek gradientowych
Ze zmianą stężenia związku toksycznego zmienia się ilość i wielkość kolonii badanego szczepu w
zależności od jego wrażliwości na dany związek.
Analogicznie można stosować zestaw płytek z różnymi stężeniami związku toksycznego.
41
Test selekcyjny - Metoda replik
}ð Zastosowanie stempla, za pomocÄ… którego kolonie z pÅ‚ytki wyjÅ›ciowej sÄ… przenoszone
(replikowane) na płytki z podłożem selekcyjnym.
}ð Kolonie wyrosÅ‚e na replikach sÅ‚użą do testowania syntezy metabolitów lub opornoÅ›ci na
związki toksyczne, podczas gdy płytka wyjściowa może posłużyć do izolacji wybranych
kolonii.
42
21
Wykład 3
Z kolonii, które przeszły testy selekcyjne z wynikiem
pozytywnym, za pomocÄ… posiewu redukcyjnego zostajÄ…
wyprowadzone czyste kultury, które poddawane są następnie
testom fermentacyjnym
43
4. Testy fermentacyjne
Øð PozwalajÄ… na ocenÄ™ stopnia przydatnoÅ›ci w przemyÅ›le poszczególnych izolatów
mikroorganizmów wyselekcjonowanych w testach selekcyjnych
Øð Ich celem jest wybór mikroorganizmu przeprowadzajÄ…cego okreÅ›lony proces
biotechnologiczny z największą wydajnością po uwzględnieniu kosztów
ekonomicznych zwiÄ…zanych z prowadzeniem procesu produkcji wybranego
bioproduktu na skalę przemysłową
44
22
Wykład 3
Testy fermentacyjne
Øð Prowadzone sÄ… w niewielkich bioreaktorach o pojemnoÅ›ci 5-20l
Øð W testach tych ustala siÄ™ optymalnÄ… metodÄ™ hodowli badanego mikroorganizmu
}ð wybór okreÅ›lonego rozwiÄ…zania konstrukcyjnego bioreaktora
}ð wybór sposobu hodowli (ciÄ…gÅ‚a, dolewowa, okresowa)
}ð warunki fizyko-chemiczne hodowli
}ð skÅ‚ad pożywki hodowlanej
45
Wybrane, na podstawie testów fermentacyjnych mikroorganizmy,
zostają poddane badaniom mającym ustalić ich przynależność
gatunkowÄ…
46
23