Wykład 4
Mikrobiologia Przemysłowa
POZYSKIWANIE SZCZEPÓW MIKROORGANIZMÓW O
ZNACZENIU PRZEMYSA
OWYM cz. 2
1
Proces pozyskiwania mikroorganizmów do zastosowań w
przemyśle obejmuje następujące po sobie etapy
1. Pobranie próby ze środowiska naturalnego
2. Hodowla wzbogacająca
3. Test selekcyjny
4. Testy fermentacyjne
5. Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu
2
1
Wykład 4
5. Identyfikacja taksonomiczna
mikroorganizmów
Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu - określenie
przynależności badanego organizmu do odpowiedniej
jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku
3
Drzewo życia  czyli filogenetyczny podział organizmów
planety Ziemia
FILOGENETYKA - dyscyplina biologii zajmująca się odtwarzaniem dróg rozwoju
rodowego poszczególnych grup organizmów, zarówno żyjących współcześnie, jak
i w epokach minionych
4
2
Wykład 4
Drzewo życia  czyli filogenetyczny podział
organizmów planety Ziemia
v� Drzewo filogenetyczne zbudowane jest w oparciu o taksony
v� Takson - grupa organizmów na tyle do siebie podobnych, że można ją wyróżnić i
zaklasyfikować do kategorii systematycznej np. klasy, rodziny, rodzaju, gatunku
v� Podstawową jednostką klasyfikacji biologicznej jest gatunek
v� System klasyfikacji musi być oparty na cechach występujących we wszystkich
żywych organizmach
5
Identyfikacja taksonomiczna
mikroorganizmów
}� Gatunek (w ujęciu mikrobiologicznym) - populacja mikroorganizmów wykazujących
wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się
od innych gatunków tego samego rodzaju;
�� Szczep  grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki
�� Szczep referencyjny  izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej
scharakteryzowany (wzorzec)
6
3
Wykład 4
Identyfikacja taksonomiczna bakterii
�� Gatunek
�� to grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70%
homologii pełnego genomowego DNA (hybrydyzacja DNA-DNA)
�� grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej
niż o 3% molowe
nG + nC
% G+C = x 100%
nA + nT + nC + nG
przy czym tylko te cechy nie mogą decydować o przynależności do gatunku
�� W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%
7
Cechy umożliwiające identyfikację mikroorganizmów
prokariotycznych - metody konwencjonalne
�� morfologia
�� skład chemiczny ściany komórkowej
�� obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych
�� zdolność do tworzenia pigmentów
�� sposób odżywiania
�� wymagania pokarmowe
�� z
ródła C, N, S
�� skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji
�� wymagania tlenowe
�� zakres temperatur i pH wzrostu
�� wrażliwość na antybiotyki
�� patogenność
�� zależności symbiotyczne z innymi organizmami
�� środowisko występowania
�� obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna)
8
4
Wykład 4
Cechy umożliwiające identyfikację grzybów - metody
konwencjonalne
Sposób generatywnego rozmnażania się
}� W identyfikacji drożdży rozpatruje się ponadto:
}� Cechy morfologiczne komórki
}� Sposób rozmnażania wegetatywnego
}� Cechy hodowlane populacji na pożywkach płynnych i stałych
}� Pigmentację
}� Zdolność tworzenia wegetatywnych spor, pseudogrzybni i grzybni
}� Cechy biochemiczne (synteza ureazy, asymilacja i fermentacja różnych
z
ródeł węgla i azotu)
}� Osmotolerancyjność i osmofilność
}� Budowa ściany komórkowej, zawartość glukanów, mannanów i chityny
}� Ekologia
}� Patogenność
}� Podstawą identyfikacji grzybów strzępkowych jest:
}� Morfologia i cechy makroskopowe grzybni oraz cechy biochemiczne
9
Obserwacja komórek bakterii
" Obserwacje mikroskopowe żywych bakterii nie pozwalają na rozpoznanie kształtów i
szczegółów struktur komórkowych. Kształt bakterii obserwuje się zwykle po ich
wybarwieniu.
" Do celów diagnostycznych stosuje się barwienie różnicujące, metodę Grama,
która jest podstawą podziału bakterii na dwie grupy o odmiennych cechach
fizjologicznych i biochemicznych.
10
5
Wykład 4
Hans Christian Gram
Duński farmakolog i lekarz. W
roku 1884 opublikował autorską
metodę barwienia bakterii.
Dokonał przełomowego odkrycia
przyczyniającego się do rozwoju
mikrobiologii
(13.09.1853  14.11.1938)
11
Budowa ściany komórkowej bakterii G+ i G-
12
6
Wykład 4
13
Obserwacja przetrwalników bakteryjnych
}� Metoda Schaeffera-Fultona
}� Barwienie przetrwalników zielenią malachitową na gorąco
}� Dobarwianie komórek wegetatywnych fuksyną zasadową
Bacillus subtilis
14
7
Wykład 4
Metody identyfikacji mikroorganizmów
Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:
}� biochemiczne
}� biofizyczne
}� biologii molekularnej
}� immunochemiczne
15
I. Metody biochemiczne
Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji
lub rozkładu określonych związków chemicznych
�� cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych
zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych
�� wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo
}� wzrost lub jego brak
}� zmiana zabarwienia pożywki
}� reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem
}� wytworzenie gazu
16
8
Wykład 4
Metody biochemiczne
}� Poszczególne taksony
mikroorganizmów posiadają
charakterystyczne dla nich szlaki
enzymatyczne
17
Metody biochemiczne
}� Obecnie stosuje się zestawy miniprobówek lub płytek zawierających odwodnione
podłoża z ewentualnym indykatorem.
}� Czysta kultura o określonej gęstości jest zawieszana w rozcieńczalniku, a następnie
taka sama objętość mieszana jest z podłożem.
18
9
Wykład 4
Testy biochemiczne
Zawieszenie Naniesienie
INKUBACJA
(18  48 h)
Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)
Identyfikacja ponad 550 gatunków bakterii (głównie
chorobotwórczych) oraz drożdży
19
Testy biochemiczne
}� Istnieją również wersje zautomatyzowane, gdzie wynik w postaci odczytu
densytometrycznego zawiesiny jest analizowany przez odpowiedni program.
}� Wynik testu może być również wprowadzany w postaci numerycznej do programu,
który analizuje dane i generuje listę możliwych gatunków wraz z %
prawdopodobieństwa identyfikacji.
20
10
Wykład 4
Testy biochemiczne
}� Przykładem takiego uniwersalnego testu biochemicznego do identyfikacji
mikroorganizmów (bakterii, drożdży i grzybów) jest system  Biolog" firmy  Biolog
Inc", który służy do identyfikacji ponad 2500 gatunków drobnoustrojów.
}� 96 studzienek
}� Forma mikropłytki umożliwia uzyskanie charakterystycznego obrazu testu
unikatowego dla gatunku drobnoustroju
21
II. Metody biofizyczne
Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie
produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład
struktur komórkowych
�� Techniki elektroforetyczne
�� Techniki oparte na chromatografii gazowej
22
11
Wykład 4
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych oparta jest
na analizie profili białkowych
}� skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek komórkowych, który jest
charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej
Sposób postępowania:
�� izolacja białek komórkowych
�� rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym
�� barwienie rozdzielonych białek, co umożliwia uzyskanie obrazu profili
polipeptydowych charakterystycznych dla danego gatunku mikroorganizmu
�� porównanie z profilami białkowymi bazy danych
Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu
23
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych
Przed identyfikacją białek często stosuje
się inkubację hodowli w pożywce
zawierającej marker metaboliczny, np.
znakowaną radioaktywnie siarkę, która
zostaje wbudowana do białek komórek
badanego szczepu.
Po rozdziale obraz żelu jest odczytywany
(skaner promieniowania � lub
densytometr), a następnie porównywany
przez odpowiedni program z bazą danych.
Elektroforeza dwukierunkowa
24
12
Wykład 4
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu
o chromatografię gazową
�� Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany
komórkowej
}� skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku
mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli
}� zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii kodowany jest przez
DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach
Kwasy tłuszczowe ściany komórkowej mogą być analizowane:
�� jakościowo  obecność specyficznych kwasów tłuszczowych
�� ilościowo  określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych
25
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu
o chromatografię gazową
Sposób postępowania:
}� Komórki czystej kultury identyfikowanych bakterii poddaje się saponifikacji (hydroliza
triglicerydów) i uwolnieniu kwasów tłuszczowych
}� Następnie prowadzi się metylowanie kwasów oraz ich ekstrakcję z fazy wodnej w celu
zwiększenia lotności, po czym przeprowadza rozdział metodą chromatografii gazowej
}� Wyniki są analizowane przez komputer i porównywane z bazą profili chromatograficznych
charakterystycznych dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów
Metoda pozwalająca określić
przynależność gatunkową mikroorganizmu
26
13
Wykład 4
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
chromatografię gazową
Poszczególne piki są identyfikowane w oparciu o wzorce kwasów tłuszczowych.
27
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
FTIR
}� Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)
}� Uzyskuje się widma w podczerwieni komórek poddanych
dezintegracji, które są odzwierciedleniem ich składu chemicznego 
obraz zależny od:
}� rodzaju białek,
}� kwasów nukleinowych,
}� elementów błony plazmatycznej i ściany komórkowej
}� Unikatowy rozkład widma dla gatunku jest porównywany z bazą
szczepów wzorcowych o znanej przynależności systematycznej.
28
14
Wykład 4
III. Metody biologii molekularnej
}� Oparte na analizie kwasów nukleinowych
}� ilościowej (% molowy GC)
}� jakościowej (homologia)
}� Kariotypowanie elektroforetyczne
}� Analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych RFLP
}� Techniki wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy PCR
}� Analiza polimorfizmu fragmentów zamplifikowanych AFLP
}� Metody analizy porównawczej rRNA (16S i 18S)
}� Sekwencjonowanie fragmentów lub całych genomów
29
DNA  cel molekularny
v� Molekularna miara stopnia pokrewieństwa  sekwencja DNA wspólnych
genów  genów kodujących rybosomalny RNA
(Carl Woese)
Jako standardowy cel molekularny wykorzystywany w metodach biologii molekularnej,
które służą identyfikacji rodzajowej mikroorganizmów, wykorzystuje się geny
należące do tzw. rDNA:
}� 16S rDNA dla organizmów prokariotycznych
}� 18S rDNA dla organizmów eukariotycznych
30
15
Wykład 4
Molekularna miara stopnia pokrewieństwa
Porównanie sekwencji genów rRNA z różnych organizmów
Organizm I ACTGCATTACGCCTTAAGAGGCTCT
Organizm II ACTGCATTAGGCCTTAAGAGGCTCT
Organizm III ACTGCATAATGCACAATGAGGCTCT
Sekwencja Sekwencja Sekwencja
zakonserwowana zmienna zakonserwowana
Organizm I
Organizm II
Organizm III
31
Metody biologii molekularnej
Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów
kwasów nukleinowych
Ponieważ sekwencja nukleotydów w łańcuchu kwasu nukleinowego jest
specyficzna, charakterystyczna dla danego gatunku organizmu, określenie
stopnia podobieństwa fragmentu DNA lub RNA badanego mikroorganizmu, w
odniesieniu do wzorca wiadomego pochodzenia, umożliwia jego identyfikację
taksonomiczną
�� Metody hybrydyzacyjne
�� Metody oparte o technikę PCR i jej modyfikacje
32
16
Wykład 4
Metody hybrydyzacyjne
Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych
�� sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, zawierające sekwencje unikalne
dla danego organizmu
�� kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest znakowany
}� radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H]
}� barwnikiem fluorescencyjnym
}� Enzymem (peroksydaza)
�� Pozwala to na określenie stopnia hybrydyzacji sondy z badanym DNA lub RNA
33
Metody hybrydyzacyjne
}� Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystują sondy DNA komplementarne do
charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego
RNA (rRNA)
}� Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż występuje on w komórce
bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od 1 000 do 10 000)
}� Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępność informacji odnośnie sekwencji rRNA
pochodzących od różnych, często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych
mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej
specyficzności
34
17
Wykład 4
Metody hybrydyzacyjne
Dot blot
35
Metody hybrydyzacyjne
Southern blotting
36
18
Wykład 4
Metody hybrydyzacyjne
}� homologia kwasów nukleinowych powyżej 70% świadczy o przynależności
organizmu do określonego gatunku
}� stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego
drobnoustroju z danym rodzajem
}� hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów
niespokrewnionych
37
FISH  hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem
38
19
Wykład 4
FISH  hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Wynik FISH dla mikroorganizmów z
domen Archaea (czerwone) i
Bacteria (zielone)
Wynik FISH dla
mieszaniny wybranych
Wyznaczone bakterie (żółte/pomarańczowe) i
bakterii z rodzaju
mikroorganizmy nie będące bakteriami (zielone)
Bacillus, Escherichia,
pobrane z powierzchni glonów Ulva sp. Pseudomanas, Shigella
39
Metody wykorzystujące technikę PCR
Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) - enzymatyczna amplifikacja
(zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów
Sposób postępowania:
�� amplifikacja fragmentu DNA
�� sekwencjonowanie
�� porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów
}� 5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku
}� Specyficzne fragmenty uzyskane w wyniku reakcji PCR mogą być również
wykorzystane w metodzie hybrydyzacji.
40
20
Wykład 4
Metody wykorzystujące technikę PCR
badanie mieszanej populacji mikroorganizmów
41
Izolacja DNA
P
C
R
Sekwencjonowanie
DNA
agctgatcgtagtctgt
aggctggtgtaccctg
Analiza
atgcttgtatgttaaaag
Sekwencji
ctagatgctgagtgagt
cgtagtggatcgatgct
gagtcgtaggctggct
42
21
Wykład 4
sekwencjonowanie
}� Nowe metody sekwencjonowania typu Next-Generation Sequencing (NGS)
umożliwiają odczyt do kilku mld pz
}� Rozwój metod bioinformatycznych umożliwia coraz szybszą i efektywniejszą analizę
takiej ilości danych, dzięki czemu możliwe jest porównywanie coraz większej ilości
fragmentów DNA, a nawet całych genomów badanych mikroorganizmów
43
Analiza sekwencji
44
22
Wykład 4
Metody wykorzystujące technikę PCR
��Geny kodujące białka bakteryjne
}� białko szoku termicznego Hsp 70
}� białko szoku termicznego Hsp 60
}� syntaza asparaginylo-tRNA
}� syntaza alanylo-tRNA
}� dehydrogenaza glutaminianowa
}� hydrolaza pirofosforanu
}� podjednostka � polimerazy RNA (RpoB)
}� podjednostka � polimerazy RNA (RpoC)
}� czynniki elongacyjne: EF 1ą/Tu, EF-Tu, Ef-G/2
}� białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12
}� gyrazy
45
IV. Metody immunochemiczne
}� Stosowane do szybkiego wykrywania mikroorganizmów patogennych w
- Medycynie
- Przemyśle spożywczym (Sanepid) i farmaceutycznym
Oparte są na specyficznej reakcji zachodzącej pomiędzy przeciwciałem i
antygenem
46
23
Wykład 4
Metody immunochemiczne
}� Antygenem mogą być:
}� Komórki mikroorganizmów lub ich elementy  antygen cząstkowy
}� Specyficzne metabolity mikroorganizmów, np. toksyny
}� Przeciwciała:
}� Białka z grupy immunoglobulin biorące udział w reakcjach odpornościowych
wyższych organizmów eukariotycznych
47
Przeciwciało
Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie  łańcuchy ciężkie
żółte  łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/ciemnożółte  regiony zmienne
jasnoniebieskie/jasnożółte  regiony stałe
szare  mostki disiarczkowe
48
24
Wykład 4
Metody immunochemiczne
W identyfikacji mikroorganizmów najczęściej stosuje się:
}� Testy aglutynacji
}� Metody radioimmunologiczne (RIA)
}� Metody immunoenzymatyczne (EIA)
}� Metody immunofluorescencyjne (FIA)
49
Test aglutynacji
Umożliwia identyfikację gatunków bakterii i grzybów strzępkowych na podstawie analizy antygenów
ścian komórkowych, komórek lub specyficznych toksyn wytwarzanych przez komórki.
W celu wzmocnienia efektu stosowane są
cząsteczki lateksu, które opłaszczane są
przeciwciałem. W obecności specyficznego
antygenu zachodzi reakcja immunologiczna
wynikiem czego jest aglutynacja (zlepianie
się) cząstek lateksu opłaszczonych
przeciwciałem.
50
25
Wykład 4
Metody immunochemiczne
}� Reakcja immunologiczna wykrywana jest poprzez specyficzne
znakowanie samego przeciwciała:
}� fluorochromami (np. fluoresceiną, rodaminą, fikoerytryną, fikocyjaniną),
}� radioizotopem
}� enzymem (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, �-galaktozydaza)
51
Metody immunochemiczne
}� Znakowanie przeciwciała enzymem umożliwia wykrycie reakcji immunologicznej po
dodaniu kompleksu chromogenu z substratem enzymu.
}� Zmiana barwy środowiska na skutek utworzenia barwnego produktu pozwala na
detekcję nawet bardzo małych ilości antygenu.
52
26
Wykład 4
Metody immunofluorescencyjne - FACS
}� Komórki znakowane markerem
fluorescencyjnym
}� Rozdział przy użyciu cytometru
przepływowego (fluorescence-activated cell
sorter)  aktywacja fluorescencji
przeciwciała przy użyciu lasera
}� Sortowanie w polu elektrycznym komórek z
różnym znacznikiem
}� Istotny jest dobór odpowiedniego
przeciwciała
53
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
}� ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay
}� Wyróżnia się 3 odmiany:
}� Bezpośrednia współzawodnicząca
}� Pośrednia współzawodnicząca
}� Kanapkowa
54
27
Wykład 4
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
}� Metoda współzawodnicząca:
}� Specyficzne przeciwciało wiązane jest ze stałą fazą (np. powierzchnia mikropłytki
}� Dodanie określonej ilości antygenu oznakowanego enzymem oraz próba badana
(antygen nieoznakowany - nie połączony z enzymem)
}� Współzawodnictwo (kompetycja) o miejsce wiązania pomiędzy antygenem
oznakowanym i nieoznakowanym
Ilość oznakowanego antygenu związanego z przeciwciałem jest odwrotnie proporcjonalna do
zawartości antygenu w próbie badanej.
Odmiana bezpośrednia  stosowane są oczyszczone, oznakowane przeciwciała
specyficzne dla antygenu  wykrywany jest antygen
Odmiana pośrednia  nieoznakowane przeciwciało specyficzne dla antygenu, a następnie
użycie wtórnego przeciwciała, połączonego z enzymem
55
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
}� Metoda kanapkowa:
}� Antygen z badanej próby jest unieruchomiony pomiędzy dwoma warstwami przeciwciał
}� Przeciwciało specyficzne dla antygenu związane jest z fazą stałą
}� Jeżeli w badanej próbie jest antygen  wiąże się on z przeciwciałem i zostaje
unieruchomiony na nośniku. Niezwiązane antygeny są wymywane.
}� Druga porcja specyficznych przeciwciał jest wyznakowana enzymatycznie.
}� Barwny kompleks powstaje w wyniku reakcji immunoenzymatycznej
56
28
Wykład 4
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
57
Metody immunochromatograficzne
Test kanapkowy ELISA
Zabarwione cząstki lateksu opłaszczone przeciwciałem po wprowadzeniu antygenu z badanym
materiałem migrują wzdłuż membrany.
Kompleks antygen-przeciwciał jest unieruchamiany na pewnej wysokości wskutek reakcji
antygenu z unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym tworząc barwny pasek.
Niezwiązany barwny lateks połączony z przeciwciałami migruje dalej, napotykając na linię
utworzoną z IgG i tworzy pasek kontrolny.
58
29