Wykład 4
Mikrobiologia Przemysłowa
POZYSKIWANIE SZCZEPÓW MIKROORGANIZMÓW O
ZNACZENIU PRZEMYSA
OWYM cz. 2
1
Proces pozyskiwania mikroorganizmów do zastosowań w
przemyśle obejmuje następujące po sobie etapy
1. Pobranie próby ze środowiska naturalnego
2. Hodowla wzbogacajÄ…ca
3. Test selekcyjny
4. Testy fermentacyjne
5. Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu
2
1
Wykład 4
5. Identyfikacja taksonomiczna
mikroorganizmów
Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu - określenie
przynależności badanego organizmu do odpowiedniej
jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku
3
Drzewo życia  czyli filogenetyczny podział organizmów
planety Ziemia
FILOGENETYKA - dyscyplina biologii zajmująca się odtwarzaniem dróg rozwoju
rodowego poszczególnych grup organizmów, zarówno żyjących współcześnie, jak
i w epokach minionych
4
2
Wykład 4
Drzewo życia  czyli filogenetyczny podział
organizmów planety Ziemia
vð Drzewo filogenetyczne zbudowane jest w oparciu o taksony
vð Takson - grupa organizmów na tyle do siebie podobnych, że można jÄ… wyróżnić i
zaklasyfikować do kategorii systematycznej np. klasy, rodziny, rodzaju, gatunku
vð PodstawowÄ… jednostkÄ… klasyfikacji biologicznej jest gatunek
vð System klasyfikacji musi być oparty na cechach wystÄ™pujÄ…cych we wszystkich
żywych organizmach
5
Identyfikacja taksonomiczna
mikroorganizmów
}ð Gatunek (w ujÄ™ciu mikrobiologicznym) - populacja mikroorganizmów wykazujÄ…cych
wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się
od innych gatunków tego samego rodzaju;
Øð Szczep  grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki
Øð Szczep referencyjny  izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej
scharakteryzowany (wzorzec)
6
3
Wykład 4
Identyfikacja taksonomiczna bakterii
Øð Gatunek
Øð to grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujÄ…cych co najmniej 70%
homologii pełnego genomowego DNA (hybrydyzacja DNA-DNA)
Øð grupa szczepów różniÄ…cych siÄ™ zawartoÅ›ciÄ… G+C w genomowym DNA nie wiÄ™cej
niż o 3% molowe
nG + nC
% G+C = x 100%
nA + nT + nC + nG
przy czym tylko te cechy nie mogą decydować o przynależności do gatunku
üð W obrÄ™bie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogÄ… przekroczyć 10%
7
Cechy umożliwiające identyfikację mikroorganizmów
prokariotycznych - metody konwencjonalne
üð morfologia
üð skÅ‚ad chemiczny Å›ciany komórkowej
üð obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych
üð zdolność do tworzenia pigmentów
üð sposób odżywiania
üð wymagania pokarmowe
üð z
ródła C, N, S
üð skÅ‚ad jakoÅ›ciowy i iloÅ›ciowy produktów fermentacji
üð wymagania tlenowe
üð zakres temperatur i pH wzrostu
üð wrażliwość na antybiotyki
üð patogenność
üð zależnoÅ›ci symbiotyczne z innymi organizmami
üð Å›rodowisko wystÄ™powania
üð obecność okreÅ›lonych antygenów (charakterystyka immunologiczna)
8
4
Wykład 4
Cechy umożliwiające identyfikację grzybów - metody
konwencjonalne
Sposób generatywnego rozmnażania się
}ð W identyfikacji drożdży rozpatruje siÄ™ ponadto:
}ð Cechy morfologiczne komórki
}ð Sposób rozmnażania wegetatywnego
}ð Cechy hodowlane populacji na pożywkach pÅ‚ynnych i staÅ‚ych
}ð PigmentacjÄ™
}ð Zdolność tworzenia wegetatywnych spor, pseudogrzybni i grzybni
}ð Cechy biochemiczne (synteza ureazy, asymilacja i fermentacja różnych
z
ródeł węgla i azotu)
}ð Osmotolerancyjność i osmofilność
}ð Budowa Å›ciany komórkowej, zawartość glukanów, mannanów i chityny
}ð Ekologia
}ð Patogenność
}ð PodstawÄ… identyfikacji grzybów strzÄ™pkowych jest:
}ð Morfologia i cechy makroskopowe grzybni oraz cechy biochemiczne
9
Obserwacja komórek bakterii
" Obserwacje mikroskopowe żywych bakterii nie pozwalają na rozpoznanie kształtów i
szczegółów struktur komórkowych. Kształt bakterii obserwuje się zwykle po ich
wybarwieniu.
" Do celów diagnostycznych stosuje się barwienie różnicujące, metodę Grama,
która jest podstawą podziału bakterii na dwie grupy o odmiennych cechach
fizjologicznych i biochemicznych.
10
5
Wykład 4
Hans Christian Gram
Duński farmakolog i lekarz. W
roku 1884 opublikował autorską
metodÄ™ barwienia bakterii.
Dokonał przełomowego odkrycia
przyczyniajÄ…cego siÄ™ do rozwoju
mikrobiologii
(13.09.1853  14.11.1938)
11
Budowa ściany komórkowej bakterii G+ i G-
12
6
Wykład 4
13
Obserwacja przetrwalników bakteryjnych
}ð Metoda Schaeffera-Fultona
}ð Barwienie przetrwalników zieleniÄ… malachitowÄ… na gorÄ…co
}ð Dobarwianie komórek wegetatywnych fuksynÄ… zasadowÄ…
Bacillus subtilis
14
7
Wykład 4
Metody identyfikacji mikroorganizmów
Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:
}ð biochemiczne
}ð biofizyczne
}ð biologii molekularnej
}ð immunochemiczne
15
I. Metody biochemiczne
Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji
lub rozkładu określonych związków chemicznych
Øð cechy biochemiczne okreÅ›la siÄ™ na podstawie reakcji chemicznych
zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych
Øð wyniki testów biochemicznych odczytuje siÄ™ makroskopowo
}ð wzrost lub jego brak
}ð zmiana zabarwienia pożywki
}ð reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagujÄ…cego z wytwarzanym metabolitem
}ð wytworzenie gazu
16
8
Wykład 4
Metody biochemiczne
}ð Poszczególne taksony
mikroorganizmów posiadają
charakterystyczne dla nich szlaki
enzymatyczne
17
Metody biochemiczne
}ð Obecnie stosuje siÄ™ zestawy miniprobówek lub pÅ‚ytek zawierajÄ…cych odwodnione
podłoża z ewentualnym indykatorem.
}ð Czysta kultura o okreÅ›lonej gÄ™stoÅ›ci jest zawieszana w rozcieÅ„czalniku, a nastÄ™pnie
taka sama objętość mieszana jest z podłożem.
18
9
Wykład 4
Testy biochemiczne
Zawieszenie Naniesienie
INKUBACJA
(18  48 h)
Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)
Identyfikacja ponad 550 gatunków bakterii (głównie
chorobotwórczych) oraz drożdży
19
Testy biochemiczne
}ð IstniejÄ… również wersje zautomatyzowane, gdzie wynik w postaci odczytu
densytometrycznego zawiesiny jest analizowany przez odpowiedni program.
}ð Wynik testu może być również wprowadzany w postaci numerycznej do programu,
który analizuje dane i generuje listę możliwych gatunków wraz z %
prawdopodobieństwa identyfikacji.
20
10
Wykład 4
Testy biochemiczne
}ð PrzykÅ‚adem takiego uniwersalnego testu biochemicznego do identyfikacji
mikroorganizmów (bakterii, drożdży i grzybów) jest system  Biolog" firmy  Biolog
Inc", który służy do identyfikacji ponad 2500 gatunków drobnoustrojów.
}ð 96 studzienek
}ð Forma mikropÅ‚ytki umożliwia uzyskanie charakterystycznego obrazu testu
unikatowego dla gatunku drobnoustroju
21
II. Metody biofizyczne
Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie
produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład
struktur komórkowych
Øð Techniki elektroforetyczne
Øð Techniki oparte na chromatografii gazowej
22
11
Wykład 4
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych oparta jest
na analizie profili białkowych
}ð skÅ‚ad iloÅ›ciowy i jakoÅ›ciowy wszystkich biaÅ‚ek komórkowych, który jest
charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej
Sposób postępowania:
Øð izolacja biaÅ‚ek komórkowych
Øð rozdziaÅ‚ elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym
Øð barwienie rozdzielonych biaÅ‚ek, co umożliwia uzyskanie obrazu profili
polipeptydowych charakterystycznych dla danego gatunku mikroorganizmu
Øð porównanie z profilami biaÅ‚kowymi bazy danych
Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu
23
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych
Przed identyfikacją białek często stosuje
się inkubację hodowli w pożywce
zawierajÄ…cej marker metaboliczny, np.
znakowaną radioaktywnie siarkę, która
zostaje wbudowana do białek komórek
badanego szczepu.
Po rozdziale obraz żelu jest odczytywany
(skaner promieniowania ² lub
densytometr), a następnie porównywany
przez odpowiedni program z bazÄ… danych.
Elektroforeza dwukierunkowa
24
12
Wykład 4
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu
o chromatografiÄ™ gazowÄ…
Øð Analiza profili kwasów tÅ‚uszczowych pochodzÄ…cych z lipidów Å›ciany
komórkowej
}ð skÅ‚ad kwasów tÅ‚uszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku
mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli
}ð zarówno iloÅ›ciowy, jak i jakoÅ›ciowy skÅ‚ad Å›ciany komórkowej bakterii kodowany jest przez
DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach
Kwasy tłuszczowe ściany komórkowej mogą być analizowane:
üð jakoÅ›ciowo  obecność specyficznych kwasów tÅ‚uszczowych
üð iloÅ›ciowo  okreÅ›lenie zawartoÅ›ci poszczególnych kwasów tÅ‚uszczowych
25
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu
o chromatografiÄ™ gazowÄ…
Sposób postępowania:
}ð Komórki czystej kultury identyfikowanych bakterii poddaje siÄ™ saponifikacji (hydroliza
triglicerydów) i uwolnieniu kwasów tłuszczowych
}ð NastÄ™pnie prowadzi siÄ™ metylowanie kwasów oraz ich ekstrakcjÄ™ z fazy wodnej w celu
zwiększenia lotności, po czym przeprowadza rozdział metodą chromatografii gazowej
}ð Wyniki sÄ… analizowane przez komputer i porównywane z bazÄ… profili chromatograficznych
charakterystycznych dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów
Metoda pozwalająca określić
przynależność gatunkową mikroorganizmu
26
13
Wykład 4
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
chromatografiÄ™ gazowÄ…
Poszczególne piki są identyfikowane w oparciu o wzorce kwasów tłuszczowych.
27
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
FTIR
}ð Spektroskopia w podczerwieni z transformacjÄ… Fouriera (FTIR)
}ð Uzyskuje siÄ™ widma w podczerwieni komórek poddanych
dezintegracji, które są odzwierciedleniem ich składu chemicznego 
obraz zależny od:
}ð rodzaju biaÅ‚ek,
}ð kwasów nukleinowych,
}ð elementów bÅ‚ony plazmatycznej i Å›ciany komórkowej
}ð Unikatowy rozkÅ‚ad widma dla gatunku jest porównywany z bazÄ…
szczepów wzorcowych o znanej przynależności systematycznej.
28
14
Wykład 4
III. Metody biologii molekularnej
}ð Oparte na analizie kwasów nukleinowych
}ð iloÅ›ciowej (% molowy GC)
}ð jakoÅ›ciowej (homologia)
}ð Kariotypowanie elektroforetyczne
}ð Analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych RFLP
}ð Techniki wykorzystujÄ…ce Å‚aÅ„cuchowÄ… reakcjÄ™ polimerazy PCR
}ð Analiza polimorfizmu fragmentów zamplifikowanych AFLP
}ð Metody analizy porównawczej rRNA (16S i 18S)
}ð Sekwencjonowanie fragmentów lub caÅ‚ych genomów
29
DNA  cel molekularny
vð Molekularna miara stopnia pokrewieÅ„stwa  sekwencja DNA wspólnych
genów  genów kodujących rybosomalny RNA
(Carl Woese)
Jako standardowy cel molekularny wykorzystywany w metodach biologii molekularnej,
które służą identyfikacji rodzajowej mikroorganizmów, wykorzystuje się geny
należące do tzw. rDNA:
}ð 16S rDNA dla organizmów prokariotycznych
}ð 18S rDNA dla organizmów eukariotycznych
30
15
Wykład 4
Molekularna miara stopnia pokrewieństwa
Porównanie sekwencji genów rRNA z różnych organizmów
Organizm I ACTGCATTACGCCTTAAGAGGCTCT
Organizm II ACTGCATTAGGCCTTAAGAGGCTCT
Organizm III ACTGCATAATGCACAATGAGGCTCT
Sekwencja Sekwencja Sekwencja
zakonserwowana zmienna zakonserwowana
Organizm I
Organizm II
Organizm III
31
Metody biologii molekularnej
Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów
kwasów nukleinowych
Ponieważ sekwencja nukleotydów w łańcuchu kwasu nukleinowego jest
specyficzna, charakterystyczna dla danego gatunku organizmu, określenie
stopnia podobieństwa fragmentu DNA lub RNA badanego mikroorganizmu, w
odniesieniu do wzorca wiadomego pochodzenia, umożliwia jego identyfikację
taksonomicznÄ…
Øð Metody hybrydyzacyjne
Øð Metody oparte o technikÄ™ PCR i jej modyfikacje
32
16
Wykład 4
Metody hybrydyzacyjne
PolegajÄ… na zastosowaniu tzw. sond genetycznych
Øð sondy sÄ… to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, zawierajÄ…ce sekwencje unikalne
dla danego organizmu
Øð kwas nukleinowy peÅ‚niÄ…cy rolÄ™ sondy genetycznej jest znakowany
}ð radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H]
}ð barwnikiem fluorescencyjnym
}ð Enzymem (peroksydaza)
Øð Pozwala to na okreÅ›lenie stopnia hybrydyzacji sondy z badanym DNA lub RNA
33
Metody hybrydyzacyjne
}ð Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystujÄ… sondy DNA komplementarne do
charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego
RNA (rRNA)
}ð Wykorzystanie rRNA zwiÄ™ksza czuÅ‚ość oznaczenia, gdyż wystÄ™puje on w komórce
bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od 1 000 do 10 000)
}ð InnÄ… zaletÄ… tego rozwiÄ…zania jest dostÄ™pność informacji odnoÅ›nie sekwencji rRNA
pochodzących od różnych, często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych
mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej
specyficzności
34
17
Wykład 4
Metody hybrydyzacyjne
Dot blot
35
Metody hybrydyzacyjne
Southern blotting
36
18
Wykład 4
Metody hybrydyzacyjne
}ð homologia kwasów nukleinowych powyżej 70% Å›wiadczy o przynależnoÅ›ci
organizmu do określonego gatunku
}ð stopieÅ„ hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego
drobnoustroju z danym rodzajem
}ð hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić miÄ™dzy DNA lub RNA organizmów
niespokrewnionych
37
FISH  hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem
38
19
Wykład 4
FISH  hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Wynik FISH dla mikroorganizmów z
domen Archaea (czerwone) i
Bacteria (zielone)
Wynik FISH dla
mieszaniny wybranych
Wyznaczone bakterie (żółte/pomarańczowe) i
bakterii z rodzaju
mikroorganizmy nie będące bakteriami (zielone)
Bacillus, Escherichia,
pobrane z powierzchni glonów Ulva sp. Pseudomanas, Shigella
39
Metody wykorzystujÄ…ce technikÄ™ PCR
Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) - enzymatyczna amplifikacja
(zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów
Sposób postępowania:
Øð amplifikacja fragmentu DNA
Øð sekwencjonowanie
Øð porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów
}ð 5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrÄ™bnienia gatunku
}ð Specyficzne fragmenty uzyskane w wyniku reakcji PCR mogÄ… być również
wykorzystane w metodzie hybrydyzacji.
40
20
Wykład 4
Metody wykorzystujÄ…ce technikÄ™ PCR
badanie mieszanej populacji mikroorganizmów
41
Izolacja DNA
P
C
R
Sekwencjonowanie
DNA
agctgatcgtagtctgt
aggctggtgtaccctg
Analiza
atgcttgtatgttaaaag
Sekwencji
ctagatgctgagtgagt
cgtagtggatcgatgct
gagtcgtaggctggct
42
21
Wykład 4
sekwencjonowanie
}ð Nowe metody sekwencjonowania typu Next-Generation Sequencing (NGS)
umożliwiają odczyt do kilku mld pz
}ð Rozwój metod bioinformatycznych umożliwia coraz szybszÄ… i efektywniejszÄ… analizÄ™
takiej ilości danych, dzięki czemu możliwe jest porównywanie coraz większej ilości
fragmentów DNA, a nawet całych genomów badanych mikroorganizmów
43
Analiza sekwencji
44
22
Wykład 4
Metody wykorzystujÄ…ce technikÄ™ PCR
ØðGeny kodujÄ…ce biaÅ‚ka bakteryjne
}ð biaÅ‚ko szoku termicznego Hsp 70
}ð biaÅ‚ko szoku termicznego Hsp 60
}ð syntaza asparaginylo-tRNA
}ð syntaza alanylo-tRNA
}ð dehydrogenaza glutaminianowa
}ð hydrolaza pirofosforanu
}ð podjednostka ² polimerazy RNA (RpoB)
}ð podjednostka ² polimerazy RNA (RpoC)
}ð czynniki elongacyjne: EF 1Ä…/Tu, EF-Tu, Ef-G/2
}ð biaÅ‚ka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12
}ð gyrazy
45
IV. Metody immunochemiczne
}ð Stosowane do szybkiego wykrywania mikroorganizmów patogennych w
- Medycynie
- Przemyśle spożywczym (Sanepid) i farmaceutycznym
Oparte są na specyficznej reakcji zachodzącej pomiędzy przeciwciałem i
antygenem
46
23
Wykład 4
Metody immunochemiczne
}ð Antygenem mogÄ… być:
}ð Komórki mikroorganizmów lub ich elementy  antygen czÄ…stkowy
}ð Specyficzne metabolity mikroorganizmów, np. toksyny
}ð PrzeciwciaÅ‚a:
}ð BiaÅ‚ka z grupy immunoglobulin biorÄ…ce udziaÅ‚ w reakcjach odpornoÅ›ciowych
wyższych organizmów eukariotycznych
47
Przeciwciało
Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie  łańcuchy ciężkie
żółte  łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/ciemnożółte  regiony zmienne
jasnoniebieskie/jasnożółte  regiony stałe
szare  mostki disiarczkowe
48
24
Wykład 4
Metody immunochemiczne
W identyfikacji mikroorganizmów najczęściej stosuje się:
}ð Testy aglutynacji
}ð Metody radioimmunologiczne (RIA)
}ð Metody immunoenzymatyczne (EIA)
}ð Metody immunofluorescencyjne (FIA)
49
Test aglutynacji
Umożliwia identyfikację gatunków bakterii i grzybów strzępkowych na podstawie analizy antygenów
ścian komórkowych, komórek lub specyficznych toksyn wytwarzanych przez komórki.
W celu wzmocnienia efektu stosowane sÄ…
cząsteczki lateksu, które opłaszczane są
przeciwciałem. W obecności specyficznego
antygenu zachodzi reakcja immunologiczna
wynikiem czego jest aglutynacja (zlepianie
się) cząstek lateksu opłaszczonych
przeciwciałem.
50
25
Wykład 4
Metody immunochemiczne
}ð Reakcja immunologiczna wykrywana jest poprzez specyficzne
znakowanie samego przeciwciała:
}ð fluorochromami (np. fluoresceinÄ…, rodaminÄ…, fikoerytrynÄ…, fikocyjaninÄ…),
}ð radioizotopem
}ð enzymem (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, ²-galaktozydaza)
51
Metody immunochemiczne
}ð Znakowanie przeciwciaÅ‚a enzymem umożliwia wykrycie reakcji immunologicznej po
dodaniu kompleksu chromogenu z substratem enzymu.
}ð Zmiana barwy Å›rodowiska na skutek utworzenia barwnego produktu pozwala na
detekcję nawet bardzo małych ilości antygenu.
52
26
Wykład 4
Metody immunofluorescencyjne - FACS
}ð Komórki znakowane markerem
fluorescencyjnym
}ð RozdziaÅ‚ przy użyciu cytometru
przepływowego (fluorescence-activated cell
sorter)  aktywacja fluorescencji
przeciwciała przy użyciu lasera
}ð Sortowanie w polu elektrycznym komórek z
różnym znacznikiem
}ð Istotny jest dobór odpowiedniego
przeciwciała
53
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
}ð ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay
}ð Wyróżnia siÄ™ 3 odmiany:
}ð BezpoÅ›rednia współzawodniczÄ…ca
}ð PoÅ›rednia współzawodniczÄ…ca
}ð Kanapkowa
54
27
Wykład 4
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
}ð Metoda współzawodniczÄ…ca:
}ð Specyficzne przeciwciaÅ‚o wiÄ…zane jest ze staÅ‚Ä… fazÄ… (np. powierzchnia mikropÅ‚ytki
}ð Dodanie okreÅ›lonej iloÅ›ci antygenu oznakowanego enzymem oraz próba badana
(antygen nieoznakowany - nie połączony z enzymem)
}ð Współzawodnictwo (kompetycja) o miejsce wiÄ…zania pomiÄ™dzy antygenem
oznakowanym i nieoznakowanym
Ilość oznakowanego antygenu związanego z przeciwciałem jest odwrotnie proporcjonalna do
zawartości antygenu w próbie badanej.
Odmiana bezpośrednia  stosowane są oczyszczone, oznakowane przeciwciała
specyficzne dla antygenu  wykrywany jest antygen
Odmiana pośrednia  nieoznakowane przeciwciało specyficzne dla antygenu, a następnie
użycie wtórnego przeciwciała, połączonego z enzymem
55
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
}ð Metoda kanapkowa:
}ð Antygen z badanej próby jest unieruchomiony pomiÄ™dzy dwoma warstwami przeciwciaÅ‚
}ð PrzeciwciaÅ‚o specyficzne dla antygenu zwiÄ…zane jest z fazÄ… staÅ‚Ä…
}ð Jeżeli w badanej próbie jest antygen  wiąże siÄ™ on z przeciwciaÅ‚em i zostaje
unieruchomiony na nośniku. Niezwiązane antygeny są wymywane.
}ð Druga porcja specyficznych przeciwciaÅ‚ jest wyznakowana enzymatycznie.
}ð Barwny kompleks powstaje w wyniku reakcji immunoenzymatycznej
56
28
Wykład 4
Metody immunoenzymatyczne - ELISA
57
Metody immunochromatograficzne
Test kanapkowy ELISA
Zabarwione cząstki lateksu opłaszczone przeciwciałem po wprowadzeniu antygenu z badanym
materiałem migrują wzdłuż membrany.
Kompleks antygen-przeciwciał jest unieruchamiany na pewnej wysokości wskutek reakcji
antygenu z unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym tworząc barwny pasek.
Niezwiązany barwny lateks połączony z przeciwciałami migruje dalej, napotykając na linię
utworzonÄ… z IgG i tworzy pasek kontrolny.
58
29