Wykład 5
Mikrobiologia Przemysłowa
Doskonalenie cech produkcyjnych
mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym
1
Doskonalenie cech produkcyjnych
mikroorganizmów
Zysk w korelacji z wydajnością
bioproduktu z litra hodowli
5 etapów selekcji
Koszty
mikroorganizmu
na litr
producenckiego
hodowli
Izolaty A B C D
2
1
Wykład 5
Doskonalenie cech produkcyjnych
mikroorganizmów
Øð Procesy biotechnologiczne z zastosowaniem mikroorganizmów wyizolowanych
bezpośrednio ze środowiska naturalnego na ogół przebiegają z wydajnością
niewystarczającą, aby ich użycie na skalę przemysłową było opłacalne
ekonomicznie
Øð Aby wykorzystać potencjaÅ‚ biotechnologiczny tych mikroorganizmów, przeprowadza
się modyfikację ich genotypu prowadzącą do uzyskania szczepów
produkcyjnych mogÄ…cych znalez
ć zastosowanie w przemyśle
3
Założenie  natura nie wykorzystuje pełnego potencjału biotechnologicznego
organizmu producenckiego tak jak przeciętny  Kowalski nie wykorzystuje pełnego
potencjału własnego organizmu
Kowalski przed Kowalski po
TRENING
POTENCJAA
U
Analogia
Dziki izolat wybrany na Mikroorganizm
drodze selekcji udoskonalony in vitro
Doskonalenie cech
4 produkcyjnych mikroorganizmu
2
Wykład 5
Co ma przynieść doskonalenie?
Zysk w korelacji z wydajnością bioproduktu z litra hodowli
Koszty
na litr
hodowli
Szczep dziki Szczep zmodyfikowany
5
Którędy wiedzie droga?
Szczep Dziki = Szczep Natywny Mutant
Mutageneza
Doskonalenie cech
produkcyjnych mikroorganizmu
MODYFIKACJA INFORMACJI
GENETYCZNEJ ZAWARTEJ W DNA
6
3
Wykład 5
Doskonalenie cech produkcyjnych
mikroorganizmów  wybór metody
METODY
MODYFIKACJI DNA
Øð Metody klasyczne
" mutageneza indukowana in vivo,
" selekcja
" adaptacja
" hybrydyzacja naturalna
" fuzja protoplastów komórek szczepów pochodzących od genetycznie
różniących się przodków.
Øð Metody wykorzystujÄ…ce techniki inżynierii
genetycznej
7
Mutageneza.
4
Wykład 5
Mutageneza
Mutageneza - proces prowadzÄ…cy do powstania mutanta
Mutant  mikroorganizm różniący się genotypem od komórek szczepu
macierzystego
üð zmiany genotypowe w komórkach mutanta muszÄ… być trwaÅ‚e
üð dziedziczone przez komórki potomne
üð ich obecność musi nadawać szczepowi mutanta wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci fenotypowe różniÄ…ce go od
szczepu macierzystego
Mutacja  trwała zmiana w sekwencji DNA, która jest przekazywana komórkom
potomnym
Zmiana premutacyjna  zmiana w sekwencji DNA, która może być usunięta w
procesie replikacji
9
Typy mutacji
}ð Substytucje
}ð Delecje
}ð Insercje
}ð Modyfikacje zasad azotowych
10
5
Wykład 5
Typy mutacji
ØðSubstytucja  zmiana jednej pary zasad na innÄ…
}ð tranzycja (A"!G; T"!C)  zmiana jednej puryny na innÄ… purynÄ™ lub zmiana jednej
pirymidyny na innÄ… pirymidynÄ™
}ð transwersja (A"!T; C"!G)  zmiana pirymidyny na purynÄ™ lub puryny na pirymidynÄ™
5 ACGTAACG 3
3 TGCATTGC 5
5 ACGTAACG 3 5 ACGTAACG 3
3 TGCATTGC 5 3 TGCATCGC 5
3 TGCACTGC 5
5 ACGTGACG 3
zmiana premutacyjna
mutacja
11
Typy mutacji
ØðDelecja - usuniÄ™cie jednej lub wiÄ™kszej liczby par zasad
5 CCGAAAAACGC 3
3 GGCTTTTTGCG 5
A
5 CCGAAAAACGC 3 5 CCGA AAACGC 3
3 GGCTTTTTGCG 5 3 GGCT TTTGCG 5
3 GGCTTTTGCG 5
5 CCGAAAACGC 3
zmiana premutacyjna mutacja
12
6
Wykład 5
Typy mutacji
ØðInsercja  wstawienie jednej lub wiÄ™kszej liczby par zasad
5 CCGAAAAACGC 3
3 GGCTTTTTGCG 5
5 CCGAAAAACGC 3 5 CCGAA AAACGC 3
3 GGCTTTTTGCG 5 3 GGCTT TTTGCG 5
T
3 GGCTTTTTTGCG 5
zmiana premutacyjna
5 CCGAAAAAACGC 3
mutacja
13
Typy mutacji
Modyfikacje zasad azotowych w DNA:
Øð Deaminacja cytozyny  powoduje powstanie uracylu, nie zwiÄ™ksza poziomu
mutacji spontanicznych
Øð Metylacja cytozyny  powoduje powstanie 5-metylocytozyny, nie zwiÄ™ksza
poziomu mutacji spontanicznych
Øð Deaminacja 5-metylocytozyny  powoduje powstanie tyminy i po replikacji
mutacjÄ™ GC AT
14
7
Wykład 5
Skutki mutacji
Mutacje punktowe
Øð zmiana pojedynczego aminokwasu w sekwencji
białka
Øð brak zmian sekwencji aminokwasowej biaÅ‚ka
Øð przedwczesna terminacja translacji
Delecje lub insercje
Øð przesuniÄ™cie ramki odczytu
Øð wstawienie lub usuniÄ™cie pojedynczego
aminokwasu w sekwencji białka
15
Mutageneza
ØðMutageneza spontaniczna (samorzutna)  proces powstawania mutacji
zachodzący niezależnie od określonych czynników zewnętrznych
}ð bÅ‚Ä™dy popeÅ‚niane w czasie replikacji DNA
}ð bÅ‚Ä™dy powstajÄ…ce w wyniku samorzutnych modyfikacji chemicznych zasad DNA
Błędy takie nie są częste ze względu na zdolności korekcyjne polimeraz, jak również
dzięki działającemu po replikacji systemowi naprawy niedopasowanych
nukleotydów (MMR  mismatch repair).
Częstość mutagenezy spontanicznej
üð bakteriofag T4  10-7
üð Escherichia coli  10-9
üð Drosophila melanogaster  10-10
16
8
Wykład 5
Mutageneza indukowana
}ð W praktyce czÄ™stość mutagenezy spontanicznej jest zbyt maÅ‚a
żeby wykorzystywać to zjawisko do kreowania mutantów in vitro
}ð StÄ…d w laboratorium przeprowadzamy tak zwanÄ… mutagenezÄ™
indukowanÄ…
17
Mutageneza indukowana
ØðMutageneza indukowana  proces powstawania mutacji na skutek
działania zewnętrznych czynników fizycznych lub chemicznych
(mutagenów)
ØðTypy mutacji indukowanych
}ð mutacje punktowe (substytucje, modyfikacje zasad azotowych)
}ð delecje
}ð insercje
Powstałe komórki mutantów różnią się genotypowo i fenotypowo
od komórek szczepu macierzystego oraz wzajemnie od siebie
18
9
Wykład 5
Mutageneza indukowana
CZYNNIKI MUTAGENNE
Fizyczne
Chemiczne
19
Czyniki chemiczne i fizyczne wykorzystywane w
doskonaleniu mikroorganizmów na drodze mutagenezy
Czynnik mutagenny Sposób działania
Promieniowanie UV powstanie dimerów pirymidynowych
Promieniowanie X pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA
5-bromouracyl analog tyminy, tworzy pary z guaninÄ…  tranzycje pary AT"!GC
2-aminopuryna analog adeniny, tworzy pary z cytozynÄ…
Hydroksyloamina hydroksylacja cytozyny, pochodna tworzy pary z adeninÄ…
N-metylo-N -nitro-N-nitrozoguanidyna synteza metyloguaniny podczas replikacji, powoduje tranzycje i
inne typy mutacji
Metanosulfonian metylowy alkilacja puryn i pirymidyn
Metanosulfonian etylowy
Oranż akrydyny interkalacja pomiędzy zasady w DNA, powoduje błędy replikacji i
mutacje typu insercja lub delecja
Kwas azotowy (III) deaminacja adeniny, hipoksantyna tworzy pary z cytozynÄ…
deaminacja guaniny, ksantyna tworzy pary z cytozynÄ…
deaminacja cytozyny, uracyl tworzy pary z adeninÄ…
20
10
Wykład 5
Promieniowanie UV
}ð DÅ‚ugość fali ok. 260 nm  najbardziej absorbowane przez kwasy nukleinowe
}ð powstawanie dimerów pirymidynowych tj. głównie TT, ale też TC i CC, w
jednoniciowym DNA oraz w RNA dochodzi też do hydratacji cytozyny i uracylu.
}ð wysokie dawki (tysiÄ…ce ergów na milimetr kwadratowy) prowadzÄ… do powstania
wiązań - krzyżowych połączeń (cross-links) między dwiema nićmi DNA.
}ð przy naÅ›wietlaniu promieniami o nieco dÅ‚uższej fali (280 nm), pochÅ‚anianymi głównie
przez białka, dochodzi do tworzenia wiązań pomiędzy tymi ostatnimi a DNA.
21
Promieniowanie UV
}ð powstanie dimerów uniemożliwia replikacjÄ™ i transkrypcjÄ™ mRNA
}ð zmiany te powodujÄ… mutacje typu transwersje i tranzycje
}ð powstajÄ… w podÅ‚ożu duże zmiany, w wyniku których pojawiajÄ… siÄ™ wolne rodniki (np.
[OH] itd.) oraz związki niestałe o charakterze nadtlenków. Związki te działają
utleniająco na inne składniki zawarte w środowisku, a ponadto i przede wszystkim,
podobnie jak wszelkie substancje utleniające, wywierają wpływ toksyczny na
komórki.
22
11
Wykład 5
Promieniowanie UV
}ð naprawie podlegajÄ… tylko pewne typy uszkodzeÅ„, np. dimery pirymidyn. Ponieważ
są one jednak odpowiedzialne za większość śmiertelnych efektów promieniowania,
te mechanizmy naprawy uszkodzeń odgrywają dużą rolę.
}ð fotoreaktywacja usuwa u Escherichia coli najwyżej 50-80% uszkodzeÅ„. PozostaÅ‚e,
nie usuwane przez fotoreaktywacjÄ™, sÄ… przypuszczalnie zwiÄ…zane z innymi
zmianami w komórce niż dimeryzacja pirymidyn.
}ð promienie UV wykazujÄ… wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci bójcze w stosunku do mikroorganizmów,
które nie są zdolne do usuwania uszkodzeń, bądz
ilość zmian jest zbyt duża.
23
Promieniowanie jonizujÄ…ce
}ð Promieniowanie X lub gamma
}ð Wysoka energia powodujÄ…ca jonizacjÄ™ czÄ…steczek przez wybicie elektronów
}ð PowstajÄ…ce wolne rodniki reagujÄ… z zasadami azotowymi prowadzÄ…c do rozerwania
nici DNA jednej (uszkodzenia możliwe do naprawienia) lub obu (uszkodzenia
letalne)
24
12
Wykład 5
Analogi zasad
}ð Antymetabolity przypominajÄ…ce puryny i pirymidyny
}ð Po wÅ‚Ä…czeniu do Å‚aÅ„cucha wykazujÄ… skÅ‚onność do tworzenia pary z bÅ‚Ä™dnie
dobranÄ… zasadÄ… purynowÄ… lub pirymidynowÄ…
}ð 5-bromouracyl, 5-bromodeoksyurydyna, 2-aminopuryna
25
Czynniki chemiczne
}ð ModyfikujÄ… zasady azotowe w DNA
}ð PowstajÄ… bÅ‚Ä™dy podczas replikacji w wyniku bÅ‚Ä™dnego parowania zasad
}ð Mutacje punktowe
26
13
Wykład 5
ZwiÄ…zki alkilujÄ…ce
}ð Alkilacja zasad azotowych wywoÅ‚ana obecnoÅ›ciÄ… grup metylowych, etylowych i
innych występujących w tych związkach
}ð Podstawienie wÅ‚aÅ›ciwej zasady innÄ…, opuszczenie lub dodanie nukleotydu
}ð Metylo- i etylometanosulfonian (MMS i EMS)
}ð Dietylo i dimetylosiarczan (DES i DMS)
}ð Iperyt
}ð N-metylo-N -nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG)
27
Barwniki akrydynowe
}ð Interkalacja pomiÄ™dzy sÄ…siednie pary zasad w dwuniciowym DNA
}ð Podczas replikacji nastÄ™puje wstawienie lub utrata dodatkowego nukleotydu
}ð Oranż akrydyny
28
14
Wykład 5
Etapy mutagenizacji
}ð Dodanie mutagenu do hodowli i jego penetracja do komórki
}ð OddziaÅ‚ywanie na DNA (niestabilne zmiany pierwotne)
}ð Procesy naprawcze (rewersja mutacji lub zmiany wtórne)
}ð Stabilizacja mutacji umożliwiajÄ…ca utrzymanie mutacji w kolejnych pokoleniach
}ð Zmiany biochemiczne i ujawnienie siÄ™ fenotypowe mutacji
1  mutacje pierwotne
2  mechanizm naprawczy;
odtworzenie stanu
pierwotnego
3  mechanizm naprawczy;
mutacje wtórne
4  śmierć komórki
5  śmierć komórki
6  namnażanie
zmutowanych komórek
Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy
29
Mutageneza indukowana
Dawka mutagenu
Øð zbyt duża dawka czynnika mutagennego prowadzić może do Å›mierci wszystkich
komórek szczepu macierzystego poddanych jego działaniu
Øð duże dawki czynnika mutagennego prowadzÄ… do uszkodzenia DNA w wielu
miejscach genomu
Øð mutacje pożądane mogÄ… być maskowane przez mutacje niekorzystne
optymalna dawka mutagenu powoduje efekt letalny u max 90% komórek
poddawanych mutagenezie
Wielkość dawki czynnika mutagennego zależy od:
}ð wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci szczepu poddawanego mutagenezie
}ð warunków hodowli
}ð wieku hodowli
30
15
Wykład 5
Mutageneza indukowana
Efekt letalny
- Dla każdego badanego szczepu mikroorganizmu dawkę czynnika mutagennego
należy wyznaczyć empirycznie
Np. Seryjne rozcieńczenia czynnika
mutagennego
31
Mutageneza indukowana
Rewersja mutacji - proces usunięcia mutacji powstałych w niektórych
komórkach mikroorganizmu pod wpływem działania czynnika mutagennego
Rewersja mutacji zachodzi na drodze działania mechanizmów
naprawczych takich jak np. fotoreaktywacja, reaktywacja rekombinacyjna.
Efektem rewersji mutacji jest przywrócenie wyjściowego genotypu
mikroorganizmu
Rewersja
mutacji
32
16
Wykład 5
Mutageneza indukowana
Mechanizmy naprawcze:
}ð Niemutagenne
}ð wolne od bÅ‚Ä™dów poreperacyjnych
}ð fotoreaktywacja, wycinanie uszkodzonych fragmentów, resynteza
DNA oraz rekombinacja
}ð Mutagenne
}ð pojawiajÄ… siÄ™ wtórne, trwaÅ‚e bÅ‚Ä™dy w DNA
}ð mechanizm SOS indukowany przy zatrzymaniu replikacji DNA
}ð uszkodzenia poreperacyjne sÄ… głównym z
ródłem mutantów
33
Rewersja mutacji
}ð Fotoreaktywacja - rozszczepienie dimerów poprzez fotoliazÄ™  enzym aktywny w
świetle widzialnym (320  370 nm), efektem jest przywrócenie do stanu pierwotnego
}ð Reaktywacja ciemna  przebiega bez udziaÅ‚u Å›wiatÅ‚a  kompleks specyficznych
nukleaz usuwa dimery powstałe podczas naświetlania, przerwa w łańcuchu
wypełniana jest przez polimerazę DNA I, a fragmenty są scalane przez ligazę
34
17
Wykład 5
Rewersja mutacji
}ð Reaktywacja rekombinacyjna lub poreplikacyjna  powstanie przerw w
miejscach wystąpienia dimerów podczas syntezy nowej nici, duża dawka
promieniowania doprowadza do powstania wielu przerw w nici DNA
W wyniku wielokrotnego procesu rekombinacji następuje usunięcie przerw, ale
reperacja DNA nie jest bezbłędna.
Uważa się, że naprawa rekombinacyjna jest głównym z
ródłem mutacji
indukowanych przez promieniowanie UV.
Najczęściej mutacje te są wynikiem podstawienia zasad lub delecji i
przesunięcia ramki odczytu.
35
Promieniowanie UV (254-265 nm)
Zalety
üð Wysoka czÄ™stotliwość powstawania mutacji w stosunku do efektu letalnego
üð DostÄ™pność i Å‚atwość użycia z
ródła promieniowania
üð A
atwość dozowania dawek
}ð moc lampy
}ð odlegÅ‚ość od zawiesiny komórek
}ð czas dziaÅ‚ania
Øð A
atwość odtwarzania warunków mutagenezy
Øð Możliwość wywoÅ‚ania mutacji w rosnÄ…cych komórkach wegetatywnych i
sporach
36
18
Wykład 5
Promieniowanie UV (254-265 nm)
Sposób postępowania
Øð przygotować zawiesinÄ™ komórek w soli fizjologicznej lub pożywce wzrostowej (105 
106 komórek /ml); wysokość warstwy zawiesiny nie powinna przekraczać kilku mm
Øð lampÄ™ UV umieÅ›cić kilkadziesiÄ…t cm nad zawiesinÄ… komórek
Øð prowadzić mutagenezÄ™ przez kilka minut
Øð wysiać zawiesinÄ™ w postaci murawy na szalki Petriego z podÅ‚ożem wzrostowym
Øð inkubować w ciemnoÅ›ci
37
Selekcja mutantów
Szczep dziki z
aktywnością
proteolitycznÄ…
Mutageneza indukowana
PÅ‚ytki z agarem
mlecznym
38
19
Wykład 5
Typy mutantów
}ð OpornoÅ›ciowe
}ð Auksotroficzne
}ð Kataboliczne
}ð Temperaturozależne
}ð Regulatorowe
39
Selekcja mutantów
Øð Mutanty opornoÅ›ciowe
}ð oporne na inhibitory, antybiotyki lub bakteriofagi
}ð bezpoÅ›redni posiew na podÅ‚oże zawierajÄ…ce czynnik toksyczny
}ð metoda replik
}ð metoda pÅ‚ytek gradientowych
Øð Mutanty auksotroficzne
}ð Niezdolne do syntezy witamin, aminokwasów, kwasów nukleinowych lub innych
składników budulcowych komórki
}ð bezpoÅ›redni posiew na podÅ‚oże zawierajÄ…ce Å›ladowe iloÅ›ci skÅ‚adników, których
komórki nie potrafią syntetyzować
}ð metoda poÅ›rednia  metoda replik
40
20
Wykład 5
Selekcja mutantów auksotroficznych
- metoda replik
1, 3  podłoże kompleksowe; 2  podłoże minimalne
41
Selekcja mutantów
Øð Mutanty kataboliczne
}ð defekt w enzymatycznych szlakach metabolicznych
}ð bezpoÅ›redni posiew na podÅ‚oże z dodatkiem wskaz
nika
Øð Mutanty temperaturozależne
}ð Temperaturooporne i temperaturowrażliwe
}ð Inkubacja w odpowiedniej temperaturze
Øð Mutanty regulatorowe
}ð Zmienna szybkość syntezy jednego lub kilku enzymów metabolicznych
}ð Hodowla ciÄ…gÅ‚Ä… w warunkach ograniczania wzrostu z maÅ‚ym stężeniem
substratu, selekcja w obecności antymetabolitów hamujących wzrost komórek
niezmienionych
42
21
Wykład 5
Mutageneza indukowana =  Genetycy
strzelają Pan Bóg kule nosi
CEL
Efekt uboczny nalotu CEL NALOTU Efekt uboczny nalotu
43
Mutageneza indukowana =  Genetycy
strzelają Pan Bóg kule nosi
DNA
Produkcja Produkcja Mechanizmy
energii białek naprawcze
komórkowej DNA
44
MUTACJE
22
Wykład 5
Selekcja mutantów dla zawansowanych
Proteaza [aktywność]
Hodowla
Mutant Szczep Dziki
Testy produkcyjne w bioreaktorze na podłożu hodowlanym wskazują na sukces.
Tyle czy na pewno?
45
Selekcja mutantów dla zawansowanych
Wzrost hodowli [liczba komórek]
Hodowla
Czas
Mutant Szczep Dziki
Niekoniecznie sukces - mutant adaptuje się trudniej niż szczep dziki na podłożu
wzrostowym
46
23
Wykład 5
Wniosek JðLð
Zysk = Strata
47
Mutageneza indukowana dla zawansowanych
Mutageneza
indukowana 2
Mutageneza
cykl
indukowana 1
cykl
PÅ‚ytki z agarem
Testy
mlecznym
Produkcyjne
" Z reguły wykonuje się 3 cykle MI i TP
" Więcej nie ma sensu bo występuje nasilenie efektu letalnego wskutek
gromadzenia siÄ™ w genomie  szkodliwych mutacji
48
24
Wykład 5
Selekcja mutantów dla zawansowanych
Wzrost hodowli [liczba komórek]
Hodowla
Czas
Szczep Mutant 1 Mutant 2
dziki generacja generacja
49
Selekcja mutantów dla zawansowanych
Wzrost hodowli [liczba komórek]
No dobrze ale jak uzyskać
szczep który z jednej
strony produkuje więcej
proteazy niż szczep dziki
ale zachowuje jego
parametry wzrostowe na
pożywce hodowlanej?
Czas
Szczep Mutant 1 Mutant 2
dziki generacja generacja
50
25