FERMENTACJA MLEKOWA
UWAGA: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz na kontakt z materiałem biologicznym, studenci
zobowiązani są używać fartuchów i rękawiczek jednorazowych.
Fermentacja mlekowa jest mikrobiologicznym, beztlenowym procesem przemiany
cukrów do kwasu mlekowego. Wywoływana jest przez bakterie fermentacji mlekowej w
mleku i jego przetworach oraz w kiszonych warzywach. Substratem dla tej fermentacji jest
glukoza i inne heksozy oraz laktoza jako główny węglowodan mleka.
Bakterie fermentacji mlekowej zaliczane są do rodzajów: Lactobacillus, Lactococcus,
Bifidobacterium, Propionibacterium. Są to Gram-dodatnie nie przetrwalnikujące ziarniaki lub
pałeczki bez zdolności do ruchu. Biorąc pod uwagę zdolność bakterii mlekowych do
przeprowadzania fermentacji różnych cukrów i wytwarzania różnych produktów końcowych,
można podzielić je na trzy grupy:
•BAKTERIE HOMOFERMENTACYJNE – bakterie właściwej
fermentacji mlekowej. Wykorzystują cukry proste i dwucukry. Wytwarzają
niemal wyłącznie kwas mlekowy jako końcowy produkt przemiany materii.
Przedstawicielami tej grupy są:
- Lactococcus lactis subsp. lactis - występuje w mleku surowym
- Lactococcus lactis subsp. cremoris - występuje w ukwaszonej śmietanie
- Lactobacillus casei – obecny w mleku i dojrzewających serach
- Lactobabacillus plantarum- czynny podczas zakiszania kapusty i ogórków
•BAKTERIE HETEROFERMENTACYJNE – bakterie właściwej
fermentacji mlekowej. Oprócz heksoz, przeprowadzają fermentację pentoz,
wytwarzają obok kwasu mlekowego (50% końcowych produktów
metabolizmu) kwas octowy, etanol, CO2, glicerol, mannitol. Są to bakterie z
rodzaju Leuconostoc.
- Leuconostoc mesenteroides – powoduje śluzowacenie słodkich napojów i
fermentujących warzyw
- Leuconostoc cremoris – wytwarza kwas octowy i CO2, stosowany do
ukwaszania śmietany
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt obję ty prawem autorskim. Zakaz
1
modyfikowania
- Lactobacillus brevis – występuje w mleku, serach i kiszonkach
- Lactobacillus fermenti – występuje w zalewie kiszonych ogórków i kapusty
- Bifidobacterium bifidum – ściśle beztlenowa bakteria, stanowiąca większość
mikroflory jelita grubego niemowląt karmionych mlekiem matki oraz do 50%
tejże mikroflory u dzieci i dorosłych. Wytwarza kwas L(+)-mlekowy, dzięki
czemu ma duży wpływ na prawidłowe funkcjonowanie przewodu
pokarmowego
•BAKTERIE PSEUDOMLEKOWE – są to bakterie zakażające różne
produkty (wino, piwo). Mogą powodować np. obniżenie zawartości kwasu
jabłkowego w winach, zamieniając go w kwas mlekowy z wydzieleniem CO2
(tzw. odkwaszanie win). Należą tu m.in. Bacterium gracile i Bacterium
mannitopem.
Bakterii mlekowych używa się w przemyśle owocowo - warzywnym do kiszenia
ogórków, kapusty i innych warzyw; w rolnictwie do otrzymywania kiszonek paszowych. W
mleczarstwie w produkcji masła, serów i napojów mlecznych; zsiadłe mleko zawiera 0,8-2%
kwasu mlekowego, stosuje się tu bakterie kwaszące i aromatyzujące: L. lactis, L. cremoris;
jogurt – szczepionka jogurtowa zawierająca w proporcji 1:1 lub 1:2 Lactobacillus bulgaricus i
Streptococcus termophilus; kefir – napój lekko musujący zawierający 0,1-0,8% alkoholu. Do
jego otrzymywania stosuje się „grzybki kefirowe”, w skład wchodzą liczne bakterie: L. lactis,
L. cremoris, L. diacetilactis, L. brevis, L. casei oraz Candida kefir, Saccharomyces
florentinum, Torula kefir. Należy zauważyć, że kwas mlekowy jest właściwie jedynym
kwasem powstającym fermentacji mlekowej znajdującym się w wyżej wymienionych
produktach.
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt obję ty prawem autorskim. Zakaz
2
modyfikowania
1. Oznaczanie ogólnej liczby bakterii w mleku metodą próby reduktazowej
Metoda ta stosowana jest w mleczarstwie do oznaczanie ogólnego zakażenia mleka.
Drobnoustroje obecne w mleku zużywają zawarty w nim tlen, w skutek czego obserwuje się
stopniowy spadek potencjału oksydoredukcyjnego. Wzrasta jednocześnie zapotrzebowanie na
akceptor wodoru, jakim jest tlen rozpuszczony w mleku. Dodany do mleka błękit metylenowy
stanowi akceptor wodoru. Po wyczerpaniu tlenu zawartego w mleku związki te zmieniają
barwę wraz ze zmiana potencjału. Błękit metylenowy w postaci zredukowanej przechodzi w
bezbarwna postać leukozwiązku. Szybkość zużycia tlenu, związana z odbarwieniem błękitu
metylenowego, zależy od liczby drobnoustrojów w mleku, ich rodzaju, zdolności
redukujących, stanu fizjologicznego i obecności w mleku substancji hamujących np.
antybiotyków. Próby te pozwalają na wykrywanie bakterii mlekowych i E. coli. Ocena mleka:
mleko surowe nie może zawierać więcej niż 1,2·105 bakterii w jednym ml. Miano coli nie
może być niższe od 0,1. Ogólna liczba bakterii w mleku pasteryzowanym butelkowym nie
może przekroczyć 2·105 w 1 ml.
Wykonanie:
a) Do 10 ml kefiru, zsiadłego mleka, świeżego mleka oraz jogurtu naturalnego dodać 0,5 ml
wodno-etanolowego roztworu błękitu metylenowego
b) Próby inkubować w temp. 37oC bez dostępu światła i zanotować czas odbarwienia.
c) Odczyt wyników wg Jensena: jeżeli w 1ml mleka znajduje się:
< 105 – czas odbarwienia trwa ponad 7 godzin
5·105 – czas odbarwienia: ponad 5 godzin
5-40·105 – odbarwienie w ciągu 2-5 godzin
40-200·105 – czas odbarwienia: od 20 minut do 2 godzin
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt obję ty prawem autorskim. Zakaz
3
modyfikowania
2. Przygotowanie hodowli fermentacyjnej oraz wyznaczanie stężenia kwasu mlekowego
a) Przygotować pożywkę hodowlaną:
Do kolby miarowej o pojemności 1000ml dodać:
• Ekstrakt drożdżowy 5.0 g;
• Pepton: 10.0 g;
• Glukoza: 20.0 g;
• KH2PO4: 0.5 g;
• K2HPO4: 0.5 g;
• FeSO4·7H2O: 10.0 mg;
• MgSO4·7H2O 200.0 mg;
• MnSO4·H2O: 7.5 mg;
• Octan sodu: 20.0 g;
• Laktoza 10.0 g;
Doprowadzić pH pożywki do 5,2 za pomocą H2SO4 lub NaOH i zautoklawować
(temp. 121oC, czas ok. 45Min)
b) Do dwóch kolb płaskodennych o pojemności 250ml wprowadzić po 100ml pożywki.
Medium w kolbie pierwszej inokulować 1ml przygotowanych kultur bakteryjnych
( Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus,
zawiesina A ), natomiast do drugiej dodać 1ml zawiesiny kultur bakteryjnych B
( Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus kefyr, Klyveromyces
marxianus, Saccaromyces unisporus, zawiesina B ).
c) Hodowlę prowadzić w temp. 30oC; po 24, 48 i 96h pobrać po 22ml mieszaniny,
uzyskane próbki odwirować (10 min, 5000 rpm), a supernatant pozostawić do dalszej
analizy.
d) 10ml supernatantu miareczkować 0,2 M NaOH wobec fenoloftaleiny. Wszystkie
miareczkowania wykonać dwukrotnie.
e) Oznaczona kwasowość ogólna przeliczyć na ogólną ilość kwasu mlekowego i jego
stężenie, wykonać wykres zależności stężenia kwasu mlekowego od czasu i uzasadnić
wyniki.
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt obję ty prawem autorskim. Zakaz
4
modyfikowania
Odczynniki:
-
Wodno-etanolowy roztwór błękitu metylenowego (5ml nasyconego alkoholowego roztworu błękitu
metylenowego w zmieszanego z 195ml wody destylowanej)
-
Pożywka hodowlana: w 1000ml roztworu znajduje się: ekstrakt drożdżowy: 5.0 g; pepton: 10.0 g;
glukoza: 20.0 g; KH2PO4: 0.5 g; K2HPO4: 0.5 g; FeSO4·7H2O: 10.0 mg; MgSO4·7H2O 200.0 mg;
MnSO4·H2O: 7.5 mg; octan sodu: 20.0 g; laktoza 10g
-
Próbki kefiru, zsiadłego mleka, świeżego mleka oraz jogurtu naturalnego
-
Zawiesina A: kultury Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus;
-
Zawiesina B: kultury Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus kefyr, Klyveromyces marxianus, Saccaromyces unisporus.
-
0,2M NaOH
-
0,2M H2SO4
-
Fenoloftaleina (roztwór 2% w etanolu)
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt obję ty prawem autorskim. Zakaz
5
modyfikowania