L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9 LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE
|
Applied Biosystems Polska Sp. z o.o.
00-203 Warszawa, ul. Bonifraterska 17
tel. [phone], e-mail: [e-mail]
www.appliedbiosystems.com
Real-Time PCR
w mikrobiologii żywności
Detekcja patogenów metodami molekularnymi
Ewa Podogrodzka
MGR BIOTECHNOLOGII
SPECJALISTA DS. SPRZEDAŻY APPLIED BIOSYSTEMS POLSKA SP. Z O.O.
branży kontroli jakości mikro- jest w urządzaniu zwanym termocyklerem. z analizowanej próbki (do 30 minut) całość
biologicznej niewiele zmieniło się Zazwyczaj w jednej reakcji PCR przeprowa- oznaczenia obecności bądz
braku patoge-
Ww ciągu ostatnich kilkunastu lat. dza się 35-40 cykli, których rezultatem jest nu trwa 2 godziny (przy użyciu systemu
Co prawda automatyzacja powoli wkrada powstanie kilku miliardów kopii pojedyn- Applied Biosystems TaqMan® Pathogen
się do laboratoriów, tym niemniej metody czej cząsteczki DNA (w każdym cyklu ilość Detection System). Próby do oznaczenia
tradycyjne  hodowle szalkowe  nadal sta- produktu przyrasta logarytmicznie). pobiera się z hodowli przednamnażających
nowią podstawę oceny jakości produktów. selektywnie daną bakterię (np. dla szczepów
Przy zastosowaniu metod fenotypowych, REAL-TIME PCR Salmonella woda peptonowa, ok. 18 go-
niezależnie od tego, czy są to metody Ulepszeniem klasycznej metody PCR jest dzin inkubacji), tak więc sumarycznie czas
manualne, czy też częściowo zautomaty- real-time PCR, czyli reakcja PCR obserwowa- od pobrania próbki do gotowego wyniku
zowane, wynik uzależniony jest w dużym na w czasie rzeczywistym. Termocykler real- zamyka się w 24 godzinach.
stopniu od subiektywnej oceny laboranta. time PCR posiada system optyczny, który Reasumując, można stwierdzić, że reakcja
Tymczasem zarówno w akademickiej, cykl po cyklu zbiera informacje o przebiegu real-time PCR jest właściwym podejściem
jak i medycznej mikrobiologii fenotypo- reakcji. Dodatkowym składnikiem reakcji do analizowania jakości żywności. Metody
we metody odchodzÄ… w cieÅ„, ustÄ™pujÄ…c real-time PCR sÄ… sondy TaqMan® wyznako- molekularne cechujÄ… przede wszystkim:
miejsca genetyce. Techniki biologii mo- wane barwnikami fluorescencyjnymi. Sonda obiektywizm, niedościgniona czułość (de-
lekularnej, takie jak PCR czy też real-time to oligonukleotyd zaprojektowany tak, aby tekcja od 1 cfu w 25 g żywności) i szybkość.
PCR, pozwalają w sposób obiektywny wiązał się wysoce specyficznie z powielanym Ostatnia z wymienionych cech jest szcze-
i  co ważniejsze  niedoścignienie czuły fragmentem DNA, a więc  w przypadku gólnie ważna dla producentów żywności,
ocenić czystość mikrobiologiczną próbki, omawianego zastosowania w mikrobiologii która jest materiałem bardzo wrażliwym
a takiego obiektywizmu i czułości brakuje żywności   wykrywał charakterystyczną na upływ czasu, a możliwość wcześniejszego
powszechnie stosowanym metodom kla- dla szukanego patogenu sekwencjÄ™. Sonda wypuszczenia jej na rynek daje producentom
sycznym czy immunochemicznym. powinna wiązać się specyficznie i silnie, wymierne korzyści ekonomiczne.
co mogą zapewnić jej specjalne cząstecz- Applied Biosystems, jako producent
REAKCJA A
AC
CUCHOWA ki białkowe (cząsteczka MGB w sondach gotowych rozwiązań dla laboratoriów, dla
POLIMERAZY TaqMan® Applied Biosystems). Polimeraza, których priorytetami sÄ… jakość i wiarygod-
PCR  łańcuchowa reakcja polimerazy syntetyzując nową nić, przesuwa się po ma- ność uzyskiwanych wyników, proponuje
(ang. polimerase chain reaction)  to enzy- trycy, napotykając na swojej drodze sondę. kompletny system do detekcji patogenów
matyczna reakcja powielania cząsteczki Dzięki aktywności egzonukleolitycznej metodami molekularnymi. W definicji sło-
DNA. Warunkiem krytycznym przebiegu enzym zaczyna  odlepiać sondę od ma- wa  system mieszczą się instrumenty (naj-
PCR jest obecność enzymu, termostabil- trycy, a następnie ją niszczyć, uwalniając wyższej klasy termocyklery real-time PCR),
nej polimerazy DNA. Substratami reakcji barwnik fluorescencyjny. System optyczny odczynniki (gotowe zestawy do detekcji
są deoksyrybonukleotydy (cegiełki budujące termocyklera wzbudza, a następnie odbiera patogenów, takich jak: E. coli O157:H7,
nowo syntetyzowane cząsteczki DNA) oraz świecenie barwnika, które z każdym cyklem Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus,
oligonukleotydy (startery), które komple- staje się coraz intensywniejsze (logarytmicz- Cronobacter sakazakii, Pseudomonas aerugi-
mentarnie przyłączają się do powielanej ny przyrost ilości produktu oznacza loga- nosa, Listeria monocytogenes, Legionella spp.
nici DNA. Reakcja łańcuchowa polimera- rytmiczny przyrost stężenia uwalnianego i Legionella pneumohila), oprogramowanie,
zy jest procesem termicznym, z cyklicznie barwnika). W efekcie jesteśmy w stanie jak również wykwalifikowane wsparcie tech-
zmieniającymi się temperaturami. Na jeden w czasie rzeczywistym monitorować, czy niczne i aplikacyjne. Wszystkie elementy
cykl prowadzÄ…cy do syntezy jednej kopii mamy produkt reakcji. systemu posiadajÄ… odpowiednie certyfikaty,
DNA z jednej cząsteczki matrycowej skła- poświadczające ich wysoką jakość; oprogra-
dajÄ… siÄ™ etapy: denaturacji DNA (90-95°C), DETEKCJA PATOGENÓW mowanie stosuje siÄ™ do reagulacji 21 CFR,
przyÅ‚Ä…czenia starterów (tzw. annealingu, Czterdziestocyklowa reakcja real-time PCR zaÅ› zestaw do detekcji Salmonella TaqMan®
50-65°C) i wydÅ‚użania nici. Reakcja w wa- trwa okoÅ‚o 1,5 godziny, po dodaniu do tego Detection Kit posiada certyfikacjÄ™ AOAC
runkach laboratoryjnych przeprowadzana czasu potrzebnego na wyizolowanie DNA oraz AFNOR. qð
34
Artykuł promocyjny
Szybka detekcja:
·ð ð Salmonella spp.
·ð ð Listeria monocytogenes
·ð ð E. coli O157:H7
·ð ð Pseudomonas aeruginosa
·ð ð Staphylococcus aureus
·ð ð Campylobacter jejuni
·ð ð Cronobacter sakazakii
·ð ð Legionella
Nieprawdopodobnie szybkie wyniki
Szybka, specyficzna detekcja
Tradycyjna metoda detekcji patogenów
System detekcji patogenów TaqMan®
takich jak Salmonella może zająć do 5 dni;
Applied Biosystems zapewnia wiarygodne
metody immunochemiczne to wciąż do 2 dni
i szybkie wyniki przy wykorzystaniu metod
oczekiwania na wynik. Zastosowanie reakcji
molekularnych  reakcji łańcuchowej
Real-Time PCR i systemu TaqMan® Applied
polimerazy (PCR), w której powielany jest
Biosystems umożliwia otrzymanie wyniku
specyficzny dla szukanego patogenu fragment
po 4 godzinach od wzbogacenia próbki, czyli
genomu.
w mniej niż 20 godzin od jej pobrania.
Certyfikat AFNOR i AOAC
Zestaw do detekcji Salmonella otrzymał
certyfikat Instytutu Badawczego AOAC
i walidację zgodności z ISO AFNOR (ISO 16140)
od AFAQ AFNOR.
Kompleksowe rozwiÄ…zanie
Zestawy odczynników do detekcji patogenów
stanowią część zintegrowanego rozwiązania,
na które składają się: termocykler (szeroki wybór
dopasowany do przepustowości laboratorium:
System 7300, 7500, 7500 Fast, StepOne"!),
oprogramowanie RapidFinder"! oraz odczynnik
do izolacji DNA.