Mikrobiologia przemysłowa ćw. 4
ANTYBIOTYKI
Badanie z zamrożonej brzeczki.
Hodowla produkcyjna = podłoże + zabity szczep + grupa ryfamycyn
Okresy badań antybiotyków:
- okres wstępny (Alexander Fleming, na zdj.)
- złota era badań nad antybiotykami
- era antybiotyków półsyntetycznych (narastająca oporność
związków chorobotwórczych zmusza do modyfikacji już
istniejących i poszukiwań innych, lepszych)
Antybiotyki są metabolitami wtórnymi (związki nie pełniące podstawowych funkcji w
życiu producenta, ale w określonych warunkach mogą sprzyjać ich rozwojowi = ograniczają
innych organizmów w danej niszy ekologicznej). Antybiotyki są substancjami naturalnymi,
najczęściej pochodzą od drobnoustrojów, ale to też i półsyntetyczne modyfikanty czy
syntetyczne analogi. Mogą działaś bakteriobójczo (grzybobójczo) czyli zabijać bezpośrednio
komórki bakterii czy grzybów chorobotwórczych lub bakteriostatycznie (fungistatycznie) 
hamując rozmnażanie. Działają w małym stężeniu, wybiórczo na struktury i procesy
biologiczne hamując wzrost lub namnażania komórek.
Produkowane sÄ… :
- najczęściej przez promieniowce = grupa wielkości > 600 tyś (rodzaj Streptomyces > 5 tyś)
- Bacillus  koło 200 gat. wytwarzających antybiotyki
- Pseudomonas - około 100
- Grzyby : w tym Penicillium 200, Aspergillus 150
Można je podzielić na różne klasy:
Podział ze względu na budowę chemiczną :
- pochodne aminokwasów
o beta  laktamowe (penicyliny)
o polipeptydowe (polimycyna)
- pochodne cukrów
o aminoglikozydy (streptomycyna, pentamycyna, neomycyna)
- makrocykliczne
o erytromycyna, ryfamycyna (rodzina ansamycyn)
- chinony i pochodne
o tetracyklina
- różne związki, pochodne cykloalkanów, poliestry, zw. aromatyczne (np.
chlorafenikol)
Podział ze względu na mechanizm działania :
- hamowanie syntezy kwasów nukleinowych, uszkadzające materiał genetyczny
drobnoustrojów (syntezy RNA np. ryfamycyna  przez połączenie z podjednostka
polimerazy)
o zaburzenie syntezy białek (chlorafenikol, tetracyklina)
- Uszkadzające strukturę ściany i (lub) błony komórkowej oraz zaburzające czynności
w nich odbywajÄ…ce siÄ™ (cefalosporyny, penicyliny, polimiksyny, colistyna,
wankomycyna).
o zaburzenie funkcjonowania błon biologicznych
Mikrobiologia przemysłowa ćw. 4
o zakłócenia syntezy składników ściany komórkowej
- Hamujące syntezę białek strukturalnych i enzymatycznych cytozolu (erytromycyna,
linkosamidy, neomycyna, streptymycyna, tetracykliny).
o zaburzenia procesów oddechowych i energetycznych
Mechanizm przeciwbakteryjnego działania antybiotyków można również przedstawić
następująco:
- Uszkadzanie struktury i czynności ściany komórkowej organizmu patogennego, np.
bacytracyna, cykloseryna, penicyliny, cefalosporyny, rystocetyna, wankomycyna
- Uszkadzanie struktury i czynności błony komórkowej organizmu patogennego, np.
nystatyna, gramicydyna, nowobiocyna, polimiksyny
- Hamowanie translacji, czyli syntezy białek, np. erytrymycyna, chloramfenikol,
aminoglikozydy, tetracykliny
MIC (minimal inhibitory concentration)  minimalne stężenie hamujące (uniemożliwiające
wzrost). Jest to najmniejsze stężenie antybiotyku które w określonych warunkach
doświadczalnych wywołuje efekt zahamowania wzrostu dla danego drobnoustroju w podłożu
MBC (minimal bactericidal concentration)  odpowiada najmniejszemu stężeniu antybiotyku
działającemu bakteriobójczo
MOC antybiotyku  mikrogramy czystej substancji antybiotycznej zawartej w 1 mg
preparatu, może być podawana także w jednostkach umownych
Mikrobiologia przemysłowa ćw. 4
- np. penicylina  1 jednostka historyczna (międzynarodowa) odpowiada sile działania
0,6 mikrogramów czystej soli benzelowej
- w 1mg soli  1667 jednostek międzynarodowych
METODY BADAC

1 .Do najczęściej stosowanych metod rozcieńczeniowych :
- metoda próbówkowa
W metodzie probówkowej antybiotyk rozcieńcza się w dowolnym stosunku  podłożem
bulionowym o specjalnym składzie, podczas gdy w metodzie płytkowej używa się do tego celu
upłynnionego podłoża agarowego lub innego. Badane szczepy posiewa się do odpowiedniego
podłoża bulionowego. Wyrosłą hodowlę rozcieńcza się 1:1000 i w określonych ilościach dodaje
do każdej probówki lub posiewa na powierzchni serii płytek z agarem, zawierających malejące
stężenia antybiotyku. Posiane próbki sÄ… inkubowane przez 18 godzin w temp. 37°C (nie dla
wszystkich drobnoustrojów), po czym dokonuje się odczytu. Zmętnienie lub osad w bulionie
świadczy o wzroście bakterii, bulion przejrzysty oznacza zahamowanie rozwoju drobnoustrojów.
Najwyższe rozcieńczenie antybiotyku, w którym nie wystąpił wzrost, przyjmujemy za wartość
MIC. Określona wartość jest tym bardziej zbliżona do rzeczywistej, im stosunek rozcieńczeń jest
mniejszy.
- metoda płytkowa
W metodzie płytkowej wartości MIC ustalamy analogicznie na podstawie określenia
najmniejszego stężenia hamującego rozwój drobnoustrojów na agarze. Metoda płytkowa ma
pewne zalety. Posługując się tą samą serią płytek, można oznaczyć jednocześnie wrażliwość
kilkunastu szczepów, a dodanie krwi (drobnoustroje bardziej wymagające) nie utrudnia odczytu.
Metody rozcieńczeniowe nie należą jednak do metod najczęściej stosowanych. Przyczyną jest brak
standardów antybiotyków, znaczna pracochłonność, konieczność posiadania
dokładnych wag i sporej ilości szkła.
2. Dlatego w laboratoriach bakteriologicznych powszechnie stosuje siÄ™ metody dyfuzyjne :
- metoda krążkowa.
Zasada metody krążkowej polega
na dyfuzji antybiotyku z krążka
wysycanego znaną ilością
antybiotyku do żelu agarowego i
działaniu na komórki wysianego
szczepu. DyfundujÄ…cy antybiotyk
powoduje powstanie dookoła
krążka strefy zahamowania
wzrostu proporcjonalnej do
stopnia wrażliwości szczepu.
Przygotowuje się rozcieńczenia 18/24-godzinnej hodowli bulionowej badanego szczepu Jeden ml
tak przygotowanej zawiesiny przenosi się na powierzchnię podsuszonego podłoża, zbierając
nadmiar płynu pipetką. Jeżeli płyn z powierzchni podłoża został dokładnie usunięty, krążki układa
siÄ™ po 4 lub 5 na każdej pÅ‚ytce i po 30 minutach wstawia do cieplarki o temp. 37°C. WstÄ™pny
okres 30 minut preinkubacji w temperaturze pokojowej jest zbyt krótki dla antybiotyków wolno
dyfundujących. Dlatego przy oznaczaniu tą metodą wrażliwości na polimiksynę B i kolimycynę
okres preinkubacji prowadzonej w temperaturze 4°C powinien trwać 18 godzin. Czas inkubacji w
cieplarce zazwyczaj wynosi 18 24 godziny. WyjÄ…tek stanowiÄ… drobnoustroje rosnÄ…ce powoli, dla
których konieczna jest dłuższa inkubacja. Po zakończeniu inkubacji mierzy się średnicą stref
zahamowania (np. za pomocą cyrkla) i podaje w milimetrach. Równolegle należy zawsze
prowadzić oznaczenie wrażliwości szczepu wzorcowego.
Mikrobiologia przemysłowa ćw. 4
Pomimo prostoty oznaczania wrażliwości metodą krążkową wymaga ona bardzo starannego
wykonania i przestrzegania przepisów.
Użycie niewłaściwego podłoża, zmiana wielkości posiewu, pominięcie okresu preinkubacji,
inne pH, pominięcie kontroli ze szczepem wzorcowym są często przyczynami zmiany wielkości
strefy i tym samym mogą być powodem fałszywego określenia wrażliwości. Ważny element
uzyskania właściwego wyniku w metodzie krążkowej stanowi odpowiednia zawartość
antybiotyków w krążkach.
- metoda cylinderkowa
Do oznaczeń używa się metalowych,
szklanych lub porcelanowych
cylinderków (bez dna) wykonanych
ze srebrnej stali, szkła pyreksowego
lub porcelany glazurowanej. Badania
przeprowadza się na płytkach
Petriego, zazwyczaj o średnicy 100
mm i wysokości 20 mm. Do płytek
nalewa siÄ™ najpierw po 21 ml
upłynnionego podłoża agarowego, a
po zestaleniu nawarstwia siÄ™ po 4 ml
podłoża agarowego, do którego
dodano odpowiednią ilość komórek
szczepu wzorcowego. Po zestaleniu drugiej warstwy agaru, na każdej płytce ustawia się pięć
cylinderków, które napełnia się roztworami antybiotyku o znanych odpowiednich stężeniach i
właściwie rozcieńczone roztwory badanego antybiotyku. Następnie płytki z cylinderkami inkubuje
się w odpowiedniej temperaturze. Antybiotyk, dyfundując poprzez żel agarowy, powoduje
zahamowanie wzrostu wzorcowego drobnoustroju dookoła cylinderków. Wielkość strefy
zahamowania wzrostu jest zależna od stężenia antybiotyku w próbce. Porównanie średnicy stref
zahamowania wzrostu dookoła cylinderków, zawierających roztwory antybiotyku o znanych
stężeniach, ze strefami zahamowania wzrostu próbek badanych pozwala obliczyć (z krzywej
wzorcowej) zawartość antybiotyku w próbce. Czas i temperatura inkubacji płytek z cylinderkami
zależą od właściwości antybiotyku i intensywności wzrostu szczepów. Oznaczając moc
antybiotyków szybko dyfundujących, można płytki umieścić w cieplarce natychmiast po
napełnieniu cylinderków. Jeżeli antybiotyk dyfunduje powoli, to próbki przed wstawieniem do
cieplarki powinny pozostać przez określony czas w temperaturze niskiej. W przypadku dro-
bnoustrojów szybko rosnących wystarcza 18-godzinny czas inkubacji, podczas gdy wolniej
rosnące, np. grzyby, należy inkubować odpowiednio dłużej.
3. Metoda seryjnych rozcieńczeń
W tej metodzie w dwóch szeregach pro-
bówek sporządza się wzrastające
rozcieńczenia antybiotyku wzorcowego i
badanego. Jako rozcieńczalnika używa się
specjalnego podłoża bulionowego,
umożliwiającego wzrost używanego w
badaniach szczepu wskaz
nikowego
(wzorcowego). Schemat przygotowania
seryjnych rozcieńczeń przedstawiono na
rycinie 11. Do wszystkich probówek z wy-
jÄ…tkiem kontroli dodaje siÄ™ zawiesiny
wrażliwego szczepu wzorcowego i próbki
inkubuje przez odpowiedni czas. W probówkach, w których stężenie antybiotyku jest odpowiednio
małe, występuje wzrost drobnoustrojów, natomiast tam gdzie stężenie antybiotyku było odpowiednio
duże, następuje zahamowanie wzrostu. Przykład interpretacji i zapisu wyników przedstawiono w
tabeli 4. Po wstępnym badaniu, dla obu roztworów przeprowadza się oznaczenia dokładniejsze,
Mikrobiologia przemysłowa ćw. 4
zawężając rozcieńczenia do np. 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12 ........ Takie postępowanie zmniejsza błąd
metod. Znając najmniejsze stężenie hamujące wzrost szczepu wskaz
nikowego przez antybiotyk
wzorcowy możemy określić, ile antybiotyku znajdowało się w l ml badanej próbki.
Zakres działania antybiotyków wobec drobnoustrojów
patogennych
Zakres działania Mikroorganizmy Antybiotyk
przeciwbakteryjnego
Antybiotyki o wÄ…skim zakresie Gram + penicyliny, makrolidy,
działania nowobiocyna, linkomycyna,
ryfampicyna, wankomycyna,
rystocetyna, kw. fusydowy
Gram - aminoglikozydy, polimiksyny
Riketsje chloramfenikol, tetracykliny
PrÄ…tki tbc cykloseryna wiomycyna,
streptomycyna
Grzyby gryzeofulwina, nystatyna,
amfoterycyna B, saramycetyna,
hamamycyna
Pierwotniaki fumagilina, trichomycyna
paromomycyna, tetracykliny
Antybiotyki o szerokim zakresie tetracykliny, chloramfenikol,
działania ampicylina, karbenicylina,
cefalosporyny
PRODUKACJA ANTYBIOTYKÓW(na przykładzie erytromycyny)
1. uzyskanie szczepu produkujÄ…cego interesujÄ…cy nas zwiÄ…zek
a. tzw. screening  poszukiwanie w środowisku naturalnym
2. udoskonalenie (np. mutageneza) cech szczepu
a. np. w celu zwiększenia produkcji interesującego nas związku
3. ustalenie warunków hodowli
a. tlenowiec czy beztlenowiec?
b. Hetero czy autotrof?
c. Czego wymaga do rozwoju?
4. optymalizacja procesu :
a. dobór składu pożywki
b. pH, temperatura, napowietrzenie, osmotyczność, uwodnienie
5. uruchomienie produkcji
a. sterylizacja (mycie urządzeń, aparatury, podłóż na których będziemy pracować
 zagrożenie np. infekcja fagową : może spowodować lizę nawet całej
hodowli)
b. namnożenie materiału podstawowego (etapowe!)
i. liofilizat (jako miejsce startu)
ii. skos (wysianie bakterii na skosie na 7 dni  etap wytwarzania
zarodników)
iii. zebranie zarodników, przeniesienie do kolby z podłożem płynnym na
24 h
Mikrobiologia przemysłowa ćw. 4
iv. zaszczepienie  petki (małego fermentora, całą hodowla płynną) na 48
h
v. petką szczepimy  matkę (większy fermentor)
vi. matką szczepimy tank fermentacyjny (duży zbiornik, kilkaset litrów),
musi mieć zapewnione dobre mieszanie, napowietrzenie, dodatkowe
mieszadła. Przy mieszaniu tworzy się piana  gaszona przez oleje
roślinne czy zwierzęce różnego rodzaju (dodawane)
c. na każdym etapie sprawdzenie czystości, jałowości (czy się nie pojawiły inne
bakterie), stężenia substratu, pojawienie się produktu końcowego,
napowietrznia
d. badanie aktywności antybiotyku (metodą cylinderkowo  płytkową lub
turbinymetrycznÄ…)
e. proces biosyntezy
i. w przypadku erytromycyny proces w temperaturze 30-32 st, 5-6 dni,
pH 7
6. zakończenie
a. wydzielenie produktu i oczyszczenie (oddzielenie biomasy przez np. izolacje
produktu z brzeczki pofermentacyjnej ), ekstrakcja , krystalizacja
i. erytromycyna  ekstrahowana octanem butylu, krystalizacja stężonym
acetonem
POŻYWKA PRODUKCYJNA
Musi zapewnić wzrost grzybni i biosyntezę produktu
- z
ródło C (węglowodory, kwasy organiczne, alkohole , tłuszcze)
- z
ródło N mineralnego (NH4SO4)
- węglan wapnia (do stabilizacji pH)
- z
ródło P (KPO4  fosforan potasu)
- mikroelementy (cynk, kobalt, magnez... wg. indywidualnych potrzeb)
- z
ródło N organicznego i C (mąki : żytnia, pszenna, arachidowa) = składniki kompleksowe
(trudno określić ich skład jakościowy i ilościowy  nie do końca wiadomo ile czego jest)
o WNK (wyciÄ…g z nanoku kukurydzianego)
Fabryka w Niechcicach. Ziarno kukurydzy, zabrana woda + kwas siarkowy  fermentacja
naturalnej mikroflory. Oddzielenie wyciÄ…gu od struktur statycznych. Zawiera peptydy,
wolne aminokwasy, sole mineralne, witaminy)
o Melasa
Produkt odpadowy przy produkcji cukru. Brązowa, gęsta ciecz o zapachu karmelu.
Zawiera głównie sacharozę.
o Serwatka
Też produkt odpadowy w przetwórniach produktów mlecznych. Zawiera głównie laktozę
- prekursorowe produkty końcowe : sprzyjają szybszej i wydajniejszej produkcji. Zapewniają
określona biosyntezę jednego produktu. np.
o propanol  prekursor erytromycyny
o jon fenylo  octowy : prekursor penicyliny benzylowej
o glicyna  prekursor seryny
SKRÓT Z METOD STOSOOWANYCH NA ĆWICZENIACH
- metoda cylinderkowo  płytkowa
Porównanie dyfuzji wzorca badanego antybiotyku do podłoża zaszczepionego odpowiednimi organizmami
wskaz
nikowymi. W miejscu działania antybiotyku następuje zahamowanie wzrostu drobnoustrojów. Pojawiają się tzw.
strefy zahamowania wzrostu. Granice stref są wprost proporcjonalne do logarytmu stężenia antybiotyków w roztworze.
Mikrobiologia przemysłowa ćw. 4
- metoda turbinymetryczna
zjawisko rozproszenia światła widzialnego przez cząstki oparta na liniowej zależności pomiędzy
zahamowaniem wzrostu drobnoustrojów hodowanych na podłożu stałym a stężeniem antybiotyku.
ZALETA : brak oczekiwania na dyfuzję antybiotyku do podłoża, czyli krótszy czas oznaczania.