CHEMIA ŻYWNOŚCI
BR
ZOWIENIE ENZYMATYCZNE I NIEENZYMATYCZNE
W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH
Prowadzący ćwiczenie  dr hab. Renata Zawirska-Wojtasiak, prof. nadzw.
Wprowadzenie
Brązowienie często pojawia się podczas przetwarzania, przechowywania oraz
przygotowywania żywności. Zasadniczo w żywności spotykamy cztery typy brązowienia:
reakcje Maillarda, karmelizacja, utlenianie kwasu askorbinowego i reakcje brązowienia
katalizowane przez enzymy. Te ostatnie zwykle dotyczą utleniania (oksydacji) składników
żywności. Wspomniana reakcja utleniania kwasu askorbinowego może zachodzić bez lub z
udziałem enzymów.
BR
ZOWIENIE NIEENZYMATYCZNE
Reakcje nieenzymatycznego brązowienia produktów spożywczych są bez wątpienia
najbardziej rozpowszechnionymi i najważniejszymi reakcjami, jakie mogą zachodzić w
różnych produktach spożywczych. W ich wyniku dochodzi do zmian wartości odżywczych
jak i własności organoleptycznych.
1. K a r m e l i z a c j a
Karmelizacja cukrów należy do grupy specjalnych reakcji nieenzymatycznego brunatnienia.
Zachodzi głównie w czasie ogrzewania cukrów w temperaturze 150 -190�C, najwyżej do
240�C. Cukry w roztworach są wytrzymałe na ogrzewanie przy pH w zakresie od 3 do 7.
Jednakże topienie suchych cukrów lub ogrzewanie ich roztworów w obecności kwasu lub
podstawowych katalizatorów powoduje karmelizację. A
atwiej karmelizują cukry redukujące
niż nieredukujące. Rezultatem karmelizacji jest powstanie brązowego koloru, którego
intensywność zależy od warunków reakcji. Kolor  karmelowy jest szeroko stosowany do
barwienia żywności np. napoju  cola . Karmelizacja wiąże się też z powstaniem
specyficznego, aromatu, nieraz bardzo pożądanego.
Karmel jest mieszaniną kompleksową związków o różnych ciężarach cząsteczkowych. Są one
często klasyfikowane w trzech grupach:
Karmelan (C24H36O18)
Karmelen (C38H50O25)
Karmelin (C125H188O80)
2. R e a k c j a M a i l l a r d a
Reakcje między cukrami i aminami są znane jako reakcje Maillarda - od nazwiska
francuskiego chemika, który prowadził badania nad wyjaśnieniem ich mechanizmu. Inicjującą
jest reakcja pomiędzy grupami aldehydowymi lub ketonowymi cukrów i wolnymi grupami
aminowymi białek lub aminokwasów. Barwa brązowa wytwarzana w tych reakcjach jest
spowodowana powstawaniem melanoidów, które są kompleksowymi cząsteczkami o dużym
ciężarze molowym. Reakcje Maillarda odgrywają także istotną rolę w tworzeniu się związków
aromatycznych w czasie termicznej obróbki żywności. Warunki tej obróbki wpływają na
rodzaj formowanych związków zapachowych. Chemiczny charakter tych związków jest
często trudny do przewidzenia. Są to tak zwane aromaty wtórne.
1
2
Reakcje Maillarda mogą być pożądane (np. aromat czekolady powstający podczas prażenia
ziarna kakowego jest rezultatem reakcji Maillarda) lub niepożądany (np. ciemnobrązowy
kolor, który czasem powstaje w czipsach ziemniaczanych, podczas smażenia, brunatnienie
mleka w proszku i mleka zagęszczonego). W produktach wysoko białkowych reakcje
Maillarda powodują pewną utratę wartości odżywczej.
Schemat reakcji Maillarda przedstawia rycina 1.
Początkowy produkt reakcji Maillarda między cukrem i aminą podlega przemianie
 Amadori , której wynikiem jest amino-deoksy- ketoza. Produkt Amadori jest niestabilny i
podlega kompleksowej serii reakcji, które produkują ostatecznie związki aromatyczne i
barwniki melanoidowe.
Istnieje kilka czynników, które ograniczają zasięg reakcji Maillarda w żywności:
- muszą być jednocześnie obecne aldehydy lub ketony (cukry redukujące, występujące w
systemie żywnościowym ) i aminy (białko - bardzo ważny składnik pożywienia),
- temperatura,
- stężenie cukrów i amin,
- pH,
- rodzaj cukru.
Temperatura: 37�C - reakcja bardzo wolna
100�C - reakcja szybka
150�C - reakcja gwałtowna
Stężenie: reakcja bardzo wolna w suchym i mocno rozcieńczonym produkcie, a najszybsza
przy wilgotności 10-15%.
pH: przy niskich pH większość grup aminowych jest zprotonowana i niewiele pozostaje grup
dostępnych do reakcji.
Cukry:zarówno konfiguracja i rozmiar molekuły cukru ma wpływ na tempo reakcji Maillarda.
Zasadniczo im mniejsza cząsteczka tym szybsze tempo reakcji, dla przykładu pentozy
reagują szybciej niż heksozy. Nie wszystkie heksozy reagują z tym samym tempem -
spośród hekzos najbardziej reaktywna jest galaktoza.
Reakcje Maillarda są powszechnym problemem w przechowywanym odtłuszczonym
sproszkowanym mleku, z uwagi na wysoką koncentrację laktozy i reaktywne białko.
Przechowywanie mleka w proszku w nieodpowiednich warunkach powoduje znaczną utratę
jakości (Tabela 1).
Tabela 1. Wpływ przechowywania na odtłuszczone mleko w proszku.
Charakterystyka Świeży proszek Przechowywany proszek
pH 6.73 6.50
zdolność redukowania 0.9 16.0
zawartość wolnego N (%) 100 36
wartość biologiczna (białko) 84.5 67.5
zapach prawidłowy, typowy mdły, odstręczający
3
BR
ZOWIENIE ENZYMATYCZNE: KINETYKA POLIFENOLOKSYDAZY
Brązowienie enzymatyczne ma ogromne znaczenie handlowe, szczególnie w owocach i
warzywach, w których powszechnie występują odpowiedzialne za te reakcje enzymy.
Brązowa barwa, która pojawia się po nacięciu lub zeskrobaniu powierzchni owoców, warzyw,
wystawionej na działanie powietrza, jest wynikiem działania enzymów, a samo zjawisko
nazywa się brązowieniem enzymatycznym. Enzymy odpowiedzialne za inicjację reakcji
brązowienia mają kilka nazw zwyczajowych jak fenolaza, fenoloksydaza, tyrozynaza,
polifenolooksydaza i katecholaza. Te oksydazy są obecne zarówno w roślinach jak i w
organizmach zwierzęcych. U zwierząt enzym jest zazwyczaj nazywany tyrozynazą, gdyż
tyrozyna jest jednym z jego substratów. Ważną funkcją tyrozynazy jest katalizowanie
powstawania brązowych barwników melaninowych, które wpływają na kolor skóry, włosów i
oczu. W roślinach enzym najczęściej nazywa się polifenolooksydazą (PPO), co sugeruje, że
jego głównym substratem są polifenole. Funkcja tego enzymu w organiz
mie rośliny jest
nieznana, ale jest on odpowiedzialny za istotne zmiany koloru (pożądane jak i niepożądane) w
żywności. W nienaruszonej tkance rośliny enzym i jego substraty są oddzielone przez
strukturę komórki i brązowienie nie zachodzi. Cięcie, tłuczenie lub inne uszkodzenie
integralności tkanki pozwala enzymom i substratom na wejście w kontakt. Enzymatyczne
brązowienie łatwo zaobserwować na powierzchni przeciętych owoców i warzyw o jasnej
barwie jak: jabłka, banany i ziemniaki. Wystawienie tych powierzchni na działanie tlenu
powoduje gwałtowną reakcję brązowienia.
Schemat reakcji brązowienia przedstawia rycina 2.
Polifenoloksydaza (PPO) katalizuje dwa typy reakcji: hydroksylację i oksydację. Typowymi
substratami dla PPO w tkankach roślin są : aminokwas tyrozyna, polifenole jak katechina,
kwas kawowy i kwas chlorogenowy. Tyrozyna i kwas chlorogenowy sa najbardziej
rozpowszechnione. Jeżeli substratem jest tyrozyna, która jest monofenolem, to jest ona
najpierw hydroksylowana do 3,4-dwuhydroksyfenyloalaniny ( w skrócie  dopa ) i potem
oksydowana do quinonu - rycina 2.
Kinetyka enzymu
Szybkość reakcji katalizowanych przez specyficzne enzymy nazywa się aktywnością enzymu.
Może być ona określana przez pomiar czasu zaniku substratów lub czasu powstawania
produktów. Aktywność PPO może być także określana przez pomiar zużycia tlenu, zanik
związków fenolowych, tworzenie się barwy brązowej lub produktów pośrednich jak
specyficzne quinony. Indol-5,6-quinon, produkt katalizowanego przez PPO utleniania
tyrozyny i dwuhydroksyfenyloalaniny, jest wygodnym produktem do śledzenia, gdyż
absorbuje światło przy długości fali, przy której inne obecne substancje nie interferują.
W wielu sytuacjach rzeczywista zawartość enzymu jest nieznana. Jednakże nie tyle stężenie,
co aktywność enzymu stosuje się do określania jego zawartości. Aktywność zazwyczaj jest
wyrażana szybkością reakcji katalizowanej przez enzym. Szybkość tę określa się najczęściej
jako zmianę absorbancji w czasie. W tym celu miesza się enzym i jego substraty i monitoruje
się przebieg reakcji w czasie. Jeżeli substrat jest obecny w nadmiarze, a temperatura i pH są
właściwie kontrolowane, prędkość jest proporcjonalna do stężenia enzymu, lub inaczej im
wyższa koncentracja enzymu tym szybsza reakcja.
Tempo reakcji ( rate ) określane jako zmiana absorbancji w jednostce czasu jest
jednoznaczne z liniową zależnością absorbancji i czasu.
4
5
Bardzo istotny jest pomiar początkowej prędkości reakcji, gdyż spada ona wraz postępem
reakcji, ponieważ prędkość ta zależy od stężenia substratu, które zmniejsza się wraz z
przebiegiem reakcji. Dodatkowo w niektórych przypadkach produkty reakcji są jej
inhibitorami.
Szybkość reakcji ( velocity ) jest rozumiana też jako zmiana koncentracji reaktantów lub
produktów w czasie. W przypadku, w którym dopa jest utleniana w reakcjach katalizowanych
przez PPO, absorbancja A jest wprost proporcjonalna do koncentracji indol-5,6-chinonu (IQ)
- czyli produktu reakcji. Wtedy szybkość  velocity obliczamy korzystając z tempa reakcji
 rate , jeżeli znamy zależność między absorbancją i koncentracją.
Absorbancję odnosimy do koncentracji z prawa Lampert a-Beera:
A = "bc
gdzie:
" jest współczynnikiem absorbancji (5.012 L x mmol-1 x cm-1 dla IQ)
b jest długością drogi światła (szerokość kuwety 1.0cm)
c jest stężeniem (mmol/L).
Szybkość reakcji  velocity V wyrażamy jako:
" c
V = ------- (mmol) (L-1) (min-1)
" t
podstawiając z wzoru Lamperta-Beera, otrzymujemy:
" A Tempo (Rate) Tempo (Rate)
V= ---------- = ------------------- =-------------------- = (mmol)(L-1)(min-1)
"b"t "b 5.012
Szybkość wielu katalizowanych przez enzym reakcji wykazuje zależność hiperboliczną od
stężenia substratu (rycina 3 ). Enzymy, które wykazują taką zależność, nie podlegają prawu
kinetyki Michaelisa-Mentena. Należy zauważyć, iż przy niskich koncentracjach substratu,
prędkość jest prawie liniowo skorelowana ze stężeniem substratu, podczas gdy dla wysokich
stężeń substratu prędkość jest prawie od nich niezależna. Michaelis i Menton proponują
model, który wyjaśnia zależność hiperboliczną. Sugerują oni, że enzymy tworzą kompleksy z
substratem S, a substrat w kompleksie może rozdzielić się od enzymu E w postaci
niezmienionej jak i po przejściu w produkt. Model taki można podsumować jako:
k1 k3
E + S �! ES E + P
k
2
Prędkość powyższej reakcji jest równa iloczynowi stałego tempa (rate) i koncentracji
kompleksu enzym-substrat:
V = k3[ES]
6
Oczywiście, jeżeli stężenie substratu jest wystarczająco wysokie do wysycenia wszystkich
centrów aktywnych enzymu, dalszy przyrost stężenia substratu nie będzie wpływał na
prędkość, gdyż przy wysokich stężeniach substratu stężenie kompleksu substrat-enzym ES
jest limitowany przez stężenie enzymu, a nie substratu.
Vmax jest największym tempem reakcji osiąganym, gdy wszystkie centra aktywne enzymu są
wysycone substratem. Obrazuje to liczbę cząsteczek substratu zamienionych na produkt w
jednostce czasu.
Michaelis i Menten podają także inną stałą, którą nazywają KM:
k2 + k3
KM = ----------
k1
KM równa jest koncentracji substratu, przy której tempo reakcji jest połową wartości
maksymalnej. Jest to miarą powinowactwa enzymu do substratu. Duża wartość KM wskazuje
na słabe powiązanie, a mała na silne.
KM i Vmax mogą być wyznaczone z prędkości reakcji mierzonej przy różnych stężeniach
substratu, wskazując na podległość kinetyki ezymów prawu Michaelisa-Mentena:
[S]
V = Vmax -------------------
[S] + KM
Odwrócone równanie Michaelisa-Mentena opisuje linia prosta:
1 1 KM 1
-------- = -------- + -------- . --------
V Vmax Vmax [S]
Wtedy można się spodziewać, że wykres 1/V w odniesieniu do 1/[S] będzie linią prostą
(rycina 3).
Kontrola brązowienia enzymatycznego
Enzymatyczne brązowienie żywności jest zwykle uznawane jako niepożądana zmiana,
ponieważ obniża akceptację pożywienia. Dlatego w badaniach naukowych poszukuje się
metod zapobiegania temu procesowi.
Istnieją trzy składniki niezbędne dla przebiegu brązowienia enzymatycznego: aktywna
polifenolooksydaza, tlen i odpowiedni substrat. Eliminacja jednego z nich może zapobiec
reakcji brązowienia. Dodatkowo, obecność czynnika redukującego zdolnego do zamiany o-
quinonów z powrotem do związków fenolowych może efektywnie hamować brązowienie.
7
8
Kilka metod opartych na powyższych zależnościach jest stosowanych do kontroli
enzymatycznego brązowienia żywności. Metody te wymieniono poniżej :
1. Inaktywacja PPO przez temperaturę.
Często stosowana w przypadku warzyw wymagających gotowania przed konsumpcją
Ogrzewanie do temperatur wymaganych dla inaktywacji PPO może nie być wskazane dla
owoców, gdyż wywołuje niepożądany aromat i/lub zbyt miękką konsystencję.
2. Chemiczna inhibicja PPO.
Stosowanych jest kilka strategii. Silnymi inhibitorami PPO są siarczki, ale ich stosowanie jest
najczęściej zabronione, gdyż wywołują groz
ne dla zdrowia alergie u niektórych ludzi. Kwas
cytrynowy jest inhibitorem enzymu przez obniżenie pH poniżej poziomu optymalnego, lub
poprzez wiązanie miedzi, jako głównego kofaktora.
3. Czynniki redukujące.
Czynniki, które redukują o-quinony do związków fenolowych hamują brązowienie
enzymatyczne. Kwas askorbinowy i D-izoaskorbinowy są stosowane dla zabezpieczania
brązowieniu świeżo-krajanych owoców od blisko 50-ciu lat. Redukujące właściwości w
stosunku do PPO wykazują także wspomniane wyżej siarczki, ktorych stosowanie jest jednak
limitowane.
4. Wyeliminowanie tlenu.
Niektóre owoce mrożone są pakowane w opakowania próżniowe dla zabezpieczenia przed
oddziaływaniem tlenu. Często z tych samych względów owoce przechowuje się w syropie
cukrowym, lub powleka ich powierzchnię nieprzepuszczalnym dla tlenu filmem z ksantanu
lub innych gum.
5. Enzymy proteolityczne.
Enzymy proteolityczne, które inaktywują PPO są proponowane, ale rzadko stosowane.
6. Traktowanie miodem.
Miód zawiera inhibitory PPO, a badania wykazują jego dużą efektywność w stosunku do
krajanych owoców. Nie jest często stosowany.
9
Wykonanie doświadczeń
BR
ZOWIENIE NIEENZYMATYCZNE
S p r z ę t
kolorymetr
kuwety
pH-metr
pipety 10ml
kolbki objętościowe 50, 100 ml
zlewki 50, 100, 250, 600 ml
probówki
płyta grzejna
pipety Pasteura
wstrząsarka Vortex
bagietki
łaz
nia wodna
naczyńka wagowe aluminiowe
termostat 125�C
O d c z y n n i k i
" bufor fosforanowy 1/15M pH 8.0
" glukoza 0.5M w buforze
" glicyna 0.5M w buforze
" glukoza krystaliczna
" glicyna krystaliczna
HCl 0.1N HCl 2N NaOH 2N
KH2PO4 1/15M Na2HPO4 1/15M
Mleko w proszku.
W y k o n a n i e
Celem ćwiczenia jest prześledzenie na prostym przykładzie czynników wpływajacych na
przebieg reakcji Maillarda.
I. Sporządzenie modelowego roztworu glukoza-glicyna.
Należy sporządzić buforowany roztwór glukoza-glicyna o identycznym stężeniu, ale różnych
wartościach pH, postępując kolejno:
1. Przygotować 100 mL 1/15M buforu fosforanowego pH 8.0, stosując 1/15 M KH2PO4 ,
1/15M Na2HPO4
2. Przygotować 50 mL 0.5M roztworu glukozy w buforze fosforanowym. Masa cząsteczkowa
glukozy wynosi 180,16. Dodać glukozę do 30mL buforu w zlewce i wymieszać, przenieść do
kolby miarowej i uzupełnić objętość buforem.
10
3. Przygotować 50 mL roztworu glicyny 0.5M w buforze fosforanowym. Masa cząsteczkowa
glicyny wynosi 75 g/mol.
4. Zmieszać 50 mL roztworu glukozy z 50 mL roztworu glicyny. Jakie jest molarne stężenie
glukozy i glicyny w uzyskanym roztworze ?
5. Przenieść po 20 mL roztworu glukoza-glicyna do dwóch 50 mL zlewek i postępować dalej
jak następuje:
a. Doprowadzić pH do 5.0 i dodać tyle wody, aby uzupełnić objętość roztworu do 40 mL.
Sprawdzić pH.
b. Doprowadzić pH do 8.0 i dodać tyle wody, aby uzupełnić objętość roztworu do 40 mL.
Sprawdzić pH.
Uwaga: Stosuj 2N HCl lub NaOH przy regulowaniu pH. Zanotuj wartość, ale nie reguluj pH
po doprowadzeniu do objętości końcowej.
II. Reakcja termiczna
1. Przenieść 10 mL roztworów wymienionych poniżej do probówek. Oznacz probówki.
a. Glukoza-glicyna, pH 5
b. Glukoza-glicyna, pH 8
c. Glukoza, pH 5
d. Glukoza, pH 8
e. Glicyna, pH 5
f. Glicyna, pH 8
2. Umieścić probówki w łaz
ni z wrzącą wodą na 30 minut, po czym ochłodzić je w zlewce z
zimną wodą.
III. Pomiar barwy (brązowienie)
1. Zmierzyć pH w probówkach po ochłodzeniu roztworów.
2. Ustawić kolorymetr na długość fali 430 nm. Stosować wodę do ustawienia  0 absorbancji
(próba odnośna).
3. Zmierzyć absorbancję (ekstynkcję) każdego roztworu. Najciemniejsze roztwory należy
rozcieńczyć wodą - pomiar absorbancji jest dokładny dla wartości pomiędzy 0.20-0.80. Aby
ustalić wartość absorbancji wyjściowego, nierozcieńczonego roztworu, należy pomnożyć
absorbancję odczytaną dla rozcieńczonego roztworu przez krotność rozcieńczenia.
IV. Demonstracja brązowienia mleka odtłuszczonego w proszku.
1. Nasypać na dno pięciu aluminiowych naczyniek wagowych mleko w proszku.
2. Umieścić cztery naczyńka w piecu 125�C.
3. Wyciągać po jednym naczyńku z pieca po 10, 20, 30, 60 min.
4. Porównać barwę mleka w naczyńkach i opisać.
V. Podsumowanie
1. Opisać dokładnie przygotowanie roztworu modelowego glukoza-glicyna.
2. Zestawić wyniki pomiarów absorbancji i wyjaśnić wpływ pH na reakcję Maillarda.
11
BR
ZOWIENIE ENZYMATYCZNE
S p r z ę t
kolorymetr
kuwety
pipety 2, 5 ml
pipeta automatyczna 250 - 1000�l
probówki
parafilm
mikser
bibuła
termos
kostki lodu
nóż
kolby stożkowe a 125ml
zlewki 100 i 600 ml
cylinder 50ml
ręcznik papierowy
szczypce
płyta grzejna
O d c z y n n i k i
" bufor A: bufor sodowo-fosforanowy 0.1M pH 6.8, zawierający 0.1M NaF
" bufor B: bufor sodowo-fosforanowy 0.1M pH 6.8
" 0.5% (w/v) NaHSO3 w buforze B
" 3,4 - dwuhydroksyfenyloalanina (dopa) w roztworze 4mg/mL buforu B
Dopa trudno rozpuszcza się w buforze pH 6.8. Dlatego należy rozpuścić najpierw 400mg
dopa w 10mL 0.1N HCl, dodać 80mL buforu B, doprowadzić pH do 6.8 za pomocą 1N KOH,
uzupełnić do 100mL buforem B. Może okazać się konieczne lekkie podgrzanie przy
rozpuszczaniu w 0.1N HCl. Podgrzewać na płytce mieszając, tylko do momentu
rozpuszczenia się dopa.
� Ziemniaki - do pozyskania enzymu.
W y k o n a n i e
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie reakcji enzymatycznego brązowienia z zastosowaniem
enzymu pozyskanego z ziemniaka oraz 3,4-dwuhydroksyfenyloalaniny (dopa) jako substratu i
ustalenie wpływu różnych czynników na jej przebieg.
I. Przygotowanie surowego ekstraktu enzymu
1. Obrać zimny, surowy ziemniak i pokrajać w małe kawałki.
2. Szybko odważyć około 10g ziemniaków i zmieszać z 50mL schłodzonego lodem buforu A.
3. Miksować mieszaninę przez 1 minutę.
12
4. Przefiltrować mieszaninę przez sączek do 125mL kolbki stożkowej i chłodzić lodem jak
długo potrzeba.
II. Próba enzymatyczna
1. Przenieść odpowiednie objętości buforu B, roztworu siarczynu i roztworu dopa
zamieszczone w tabeli, do oznakowanych probówek, dokładnie pipetując.
2. Ustawić kolorymetr na długość fali 475 nm i wyzerować stosując wodę jako próbę
referencyjną. Zerować po każdym pomiarze.
3. Kiedy wszystko jest gotowe zainicjować reakcję dodając ekstrakt enzymu. Dobrze
wymieszać i natychmiast mierzyć absorbancję. Dokonywać odczyty co 15 sekund przez 2
minuty i zapisywać. Jedna osoba dokonuje pomiarów, druga kontroluje czas.
III. Interpretacja wyników.
1. Sporządzić wykres absorbancji w stosunku do czasu. Ustalić tempo reakcji (rate) na
podstawie wykresu liniowej zależności absorbancji od czasu.
2. Wyznaczyć prędkość reakcji w probówkach 2-8, wyrażając ją w milimolach substratu (IQ-
indol-5,6-quinonu), na litr, na minutę. Sporządzć wykres zależności prędkości od stężenia
substratu dla prób 2-8. Określić KM i Vmax enzymu.
3. Określić aktywność enzymu (tempo) dla prób 9-11. Sporządzić wykres zależności
aktywności enzymu (tempa) od objętości użytego ekstraktu enzymu. Czy jest to wykres
liniowy?. Objaśnić otrzymaną zależność.
4. Porównać aktywność w próbie 12 z tą w próbie 7. Objaśnić spostrzeżenia.
Objętości buforu, substratu i ekstraktu enzymu w próbach na PPO
Tabela 2
Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
próby
Reagent
(mL)
Bufor B 2.5 2.4 2.35 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 0.8 0.7 0.6 -
pH 6.8
Siarczyn - - - - - - - - - - - 2.0
w buf.
Dopa w - 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 2.0 2.0 2.0 0.5
buforze
Ekstrakt 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5
enzymu
13