WYKA
AD 10: 11.05.2010r. WIRUSY I WEKTORY WIRUSOWE cd.
Struktura genomu HIV-1
Geny strukturalne: gag, pol, env
Geny pomocnicze: vif, vpr, vpu, nef
Geny regulatorowe: tat, rev
Regulacja genów wirusa HIV zależy od czynników wirusowych i komórkowych i regulowana jest na
poziomie transkrypcji i translacji (zmiany potranslacyjne).
Geny wczesne: tat, rev i nef.
Geny póz
ne: gag, pol, en, vpr, vpu, vif (transkrypcja tych genów zależna jest od Rev).
Geny/białka tat i rev
Tat jest wielofunkcyjnym białkiem, krytycznym dla procesu transkrypcji wirusowego DNA. Tat jest
trans aktywatorem modulującym ekspresję wirusowych genów. Tat oddziałuje z fragmentem
wirusowego RNA nazywanym Tar.
RRE (rev response element) fragment RNA wirusa HIV znajdujący się w obrębie sekwencji kodującej
białko env.
Sekwencja ta jest sygnałem powodującym eksport wirusowego RNA z jądra do cytoplazmy. Dotyczy
to zarówno pełnej formy DNA jak i fragmentów powstałych w wyniku potranskrypcyjnej obróbki.
Funkcjonalność sekwencji RRE nadawana jest przez jej oddziaływanie z regulatorowym białkiem
wirusa nazywanym rev.
Struktura regionu promotora wirusa HIV-1
LTR (long terminal repeat) składa się z 3 regionów:
" U3 (unique 3 sequence),
" R (repeated sequence),
" U5 (unique 5 sequence).
W podregionie U3 znajduje się większość sekwencji regulatorowych, do których wiążą się czynniki
transkrypcji komórek gospodarza.
Miejsce inicjacji transkrypcji to pierwsza zasada po ostatniej zasadzie podregionu R.
Region U5 koduje strukturę TAR, region RNA stanowiący miejsce wiązania białka regulatorowego
Tat.
Koniec 3 podregionu U5 zawiera miejsce wiązania lys-tRNA stanowiącego sekwencję starterową dla
odwrotnej transkryptazy.
Cykl produkcji wirusa HIV-1
Istota konstruowania wektorów retrowirusowych-lentivirusowych
Celem jest wprowadzenie genu kodującego terapeutyczne białko (lub RNA) do genomu komórek
gospodarza w sposób trwały.
Jednocześnie, wprowadzany materiał genetyczny nie powinien zawierać elementów wirusowych,
które mogłyby doporadzić do rekonstrukcji infekcyjnego, patogennego wirusa.
Zatem, wektory powinny być konstruowane tak, aby egzogenny materiał genetyczny wprowadzany do
komórek poprzez cząsteczki wirusa nie zawierał elementów umożliwiających replikację wirusowego
materiału genetycznego.
Idealną strategią jest, aby wektor wprowadzany poprzez retrowirusa zawierał jedynie niezbędny gen
wirusa konieczny do transkrypcji RNA wirusa i integracji DNA z genomem gospodarza.
W celu zminimalizowania niebezpieczeństwa odtworzenia się patogennej struktury wirusa w czasie
procesu przygotowywania wektorów i w czasie zabiegów terapeutycznych stosowana jest strategia
oddzielnego dostarczania poszczególnych fragmentów budujących terapeutyczną cząsteczkę
retrowirusa/lentivirusa.
Wektory retrowirusowe-lentivirusowe.
Wektory retrowirusowe mają szereg bieżących i potencjalnych zastosowań:
Nowe strategie terapeutyczne
Modyfikowanie genetyczne komórek macierzystych
Otrzymywanie zwierząt transgenicznych
Otrzymywanie rekombinowanych szczepionek
Otrzymywanie rekombinowanych białek terapeutycznych
Narzędzie badawcze.
Podstawowe genetyczne cechy wirusa HIV-1
Tabela 1. Opis głównych cech genetycznych HIV-1
Wyznacznik Rola w wektorze
Funkcja
molekularny lentiwirusa
1. Cis- acting
Zawiera sekwencje niezbędne dla ekspresji genomu wirusowego; Odwrotna
Niezbędny
LTRs
transkrypcja; integracja
PBS Wymagany dla inicjacji syntezy nici opóz
nionej Niezbędny
Psi Wymagany dla enkapsulacji wirusowego tRNA Korzystny
RRE Oddziałuje z Rev. Wymagany dla obróbki i transportu wirusowego sRNA Niezbędny
PPT Wymagany dla rozpoczęcia syntezy nici wiodącej Niezbędny
Miejsca att Wymagane dla integracji wirusowego DNA Niezbędny
2. Trans-acting
gag/pol Koduje białka strukturalne i enzymy niezbędne dla replikacji wirusowej Niezbędny
env Koduje otoczkę glikoproteinową Niezbędny
vif Oddziałuje na składanie wirusów i infekcyjność niektórych typów komórek Zbędny/nieprzydatny
Ujemna regulacja (blokowanie ekspresji) cząsteczek CD4 i MHC klasy I, stymuluje
Zbędny/nieprzydatny
vpu
uwalnianie wirionów
Umożliwia infekowanie niedzielących się komórek, zwiększa produkcje progenomu
Zbędny/nieprzydatny
vpr
wirusowego; Indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozę
tat Niezbędna dla wysokiego poziomu ekspresji z wirusowego LTR Zbędny/nieprzydatny
rev Niezbędny dla ekspresji nieskładanego i pojedynczo składanego mRNA in vivo Korzystny
nef Wymagany dla dużego  ładunku wirusa; blokowanie ekspresji CD4 Zbędny/nieprzydatny
Zasada działania systemu współczesnych wektorów lentivirusowych.
Najnowsza, trzecia generacja wektorów lentiwirusowych, w których wprowadzany jest transgen nie
koduje żadnych białek wirusa, zawiera natomiast działające  cis elementy strukturalne konieczne w
celu:
pakowania wirusowego RNA do kapsydu
zajścia odwrotnej transkrypcji
integracji materiału genetycznego wirusa (w postaci
dsDNA) do genomu gospodarza.
Geny wirusa konieczne do produkcji białek wirusa (gag/pol, rev,
env) dostarczane są poprzez plazmidy pomocnicze nazywane także
plazmidami pakującymi.
Wszystkie plazmidy są wtransfekowane do komórek linii
pakującej równocześnie.
Zasosowanie strategii transfekcji
komplementacyjnej znacząco
zwiększa bezpieczeństwo
posługiwania się wektorami
lentiwirusowymi.
Komplementarność wektorów lentivirusowych.
Plazmid  transportowy z wkodowanym trans genem zawiera także wirusową
sekwencję/element psi (�). Sekwencja ta zawiera informacje umożliwiające zajście procesu
integracji pakowania.
Plazmidy pomocnicze  pakujące (np. pLV-HELP) zawierają geny pol, gag i tag oraz
sekwencję RRE (rev-response element)
Plazmid  pseudotypujący (np. pLV-iVSV-G) zawierający gen kodujący białko G osłonki
wirusa pęcherzykowanego zapalenia jamy ustnej (vesicular stomatitis virus).
Pseudotypowanie polega na modyfikacji informacji genetycznej wirusa tak, że białka osłonki
wirusa mogą rozpoznawać receptory występujące na rozmaitych typach komórek
potencjalnych gospodarzy. Pseudotypowanie pozwala na poszerzenie rodzaju komórek, które
mogą być infekowane.
Komórki pakujące.
Wektory lentiwirusowe są najczęściej produkowane w komórkach HEK293T. Jest to tzw. linia
pakująca.
Komórki HEK 293 otrzymano na początku lat 70 ubiegłego wieku w wyniku transformacji
prawidłowych komórek nerki ludzkiego poronionego płodu w jednym z laboratoriów w Leidzie.
Do transformacji użyto adenowirusa. HEK  Human Embryonic Kidney. Komórki są łatwe w hodowli
in vitro oraz cechuje je wysoka wydajność transfekcji.
Istnieje szereg wariantów tych komórek, selekcjonowanych w celu uzyskania maksymalnej
wydajności transfekcji retrowirysowymi i lentiwirusowymi wektorami, oraz uzyskiwania
maksymalnej wydajności pakowania wirusów i ich sekrecji do środowiska zewnątrzkomórkowego.
Wektory samoinaktywujące się typu SIN
W komórkach 293T promotor (np. CMV) steruje transkrypcją jednostki transkrypcji włączonej w
wektor, który zawiera transgen.
RRE  umożliwia wydajny eksport transkryptów z jądra do cytoplazmy.
PSI  jest sygnałem inicjującym i umożliwiającym pakowanie wirusowego RNA w kapsyd
(cząsteczki białek kapsydu dostarczane są  trans w wyniku transkrypcji plazmidów pakujących).
PPT  tworzy strukturę wzmagającą wydajność importu dwuniciowego wirusowego DNA do jądra.
LTR  promuje integrację dsDNA do genomu gospodarza.
WPRE  (woodchuck hepatitis virus)  element regulatorowy zwiększa eksport mRNA genu
transkrybowanego z wewnętrznego promotora (transgenu) z jądra do cytoplazmy.
Po transfekcji plazmidami komórek 293T odwrotna transkryptaza syntetyzuje dwuniciowy DNA
zawierający po obu stronach struktury LTR. Należy zauważyć, że w wyniku delekcji ("U3) usuwane
są sekwencje promotorowe (TATA i inne). W związku z tym forma pro wirusa (zintegrowana z
genomowym DNA gospodarza) nie zawiera w tym regionie sekwencji koniecznych do inicjacji
transkrypcji (region jest nieaktywny, samoinaktywacja).
Przykładowa struktura samoinaktywującego się lentivirusowego wektora
opartego na strukturze HIV-1
Transgen znajduje się pod kontrolą egzogennego promotora (tu: genu PGK).
Trakt polipurynowy (PPT) wstawiono przed transgen.
Za trans genem wstawiono sekwencję WPRE (element z woodchuck hepatitis virus)
Zmodyfikowano region U3 w regionie 5 UTR, zastępując elementy regulacyjne promotora wirusa
HIV, regionem promotora wirusa RSV (Rous sarkoma virus)
SD  złącze donorowe (składanie RNA, splicing)
SA  złącze akceptorowe (składanie RNA, splicing)
"Gag  fragment regionu 5 kodującego gen gag (zawiera sekwencję zwiększają wydajność
pakowania)
RRE  Rev response element.
Wprowadzono delecję w regionie U3 ("U3) w 3 LTR. W czasie odwrotnej transkrypcji defektywny
region U3 w 3 LTR zostaje skopiowany i stanie się fragmentem regionu 5 LTR.
Tym samym znikną z regionu 5 LTR sekwencje promotorowe i wzmacniające transkrypcję. Region
staje się nieaktywny transkrypcyjnie. Możliwa jest jedynie transkrypcja z wewnętrznego
promotora, pod którego kontrolą jest transgen.
Operator TetR
U bakterii Gram-ujemnych oporność na
tetracykliny jest przez białko błony
cytoplazmatycznej TetA.
Ekspresja genu tetA kodujących białko
TetA znajduje się pod ścisłą
transkrypcyjną kontrolą represora Tet
(TetR).
W nieobecności induktora (tetracyklina) dimery represora TetR wiążą się z operatorami tetO1 i
tetO2 blokując transkrypcję zarówno genu tetR kodującego represor, jak i genu tetA kodującego
białko oporności.
Jeśli w komórkach pojawi się tetracyklina wiąże się ona z TetR zmieniając jego konformację, co z
kolei powoduje oddysocjowanie represora z operatorów.
Pociąga to za sobą ekspresję TetA i TetR, co z kolei powoduje gwałtowne obniżenie się poziomu
tetracykliny. To z kolei powoduje zahamowanie ekspresji genów kodujących receptor i białko tetA.
Chimeryczny czynnik transkrypcji tTA
W celu wykorzystania oddziaływania represora tetR z tetracykliną (lub doksycykliną) do
modulowania transkrypcji genów eukariontów skonstruowano chimeryczny czynnik transkrypcji tTA
(trans aktywator tTA) poprzez połączenie cząsteczki tetR z domeną transaktywującą polimerazę
RNA. Domenę tę wyodrębniono z czynnika transkrypcji
VP16 wirusa Herpes simplex.
Aby wykorzystać otrzymany trans aktywator (tTA) do
aktywacji transkrypcji genów umieszcza się w regionie
promotora poprzedzającym sekwencję TATA kilka
(najczęściej 7) sekwencji operatorowych z operonu
tat.
Przyłączenie się trans aktywatora tTA (częścią TetR) do sekwencji operatorowych powoduje, że jego
domena trans aktywująca (część VP16) może uruchomić proces transkrypcji genu znajdującego się
pod kontrolą operatorów tetO.
Omawiany system może funkcjonować w dwóch układach nazywanych TET-ON i TET-OFF.
Transaktywacyjny system TET-OFF
System TET-OFF. Tetracyklina lub doksycyklina blokuje transkrypcję.
W nieobecności induktora (tetracykliny lub doksycykliny) trans aktywator tTA wiąże się z 7
operatorowymi miejscami tetO (tetO7) poprzedzającymi minimalny promotor CMV.
Obecność miejsc wiążących tTA w pobliżu miejsca wiążącego polimerazę powoduje, że jest ona
aktywowana przez domenę VP16 transaktywatora tTA.
Jeśli do systemu wprowadzi się tetracyklinę lub doksycyklinę wiążą się one z tTA. Oddziaływania te
zmieniają konformację tTA tak, że nie może wiązać się z sekwencjami operatorowymi, co hamuje
aktywność promotora i niemożliwia transkrypcję genu (brak oddziaływania fragmentu VP16 z
polimerazą RNA).
Transaktywacyjny system TET-ON
System TET-ON. Tetracyklina lub doksycyklina aktywuje transkrypcję.
W systemie TET-ON stosuje się zmutowaną cząsteczkę TetR (rTetR), która musi związać się z
doksycykliną (lub tetracykliną) i dopiero wtedy może oddziaływać z miejscami tetO7, co powoduje
aktywację transkrypcji genu.
Transaktywator, który powstał w wyniku przyłączenia domeny transaktywacyjnej Vp16 do
zmutowanego represora TetR jest nazywany rtTA.
W systemie TET-ON gen kontrolowany przez sekwencje operatorowe tetO transkrybowany jest
jedynie jeśli w komórce obecna jest doksycyklina (lub tetracyklina).
Przykład lentivirusowego wektora samo inaktywującego się z indukowalnym
promotorem wewnętrznym.
Stosowany system to wariant TET-ON. Transkrypcja zachodzi jedynie w obecności doksycykliny,
która wiąże się ze zmutowaną cząsteczką transaktywatora (rtTA).
Transgen znajduje się pod kontrolą minimalnego promotora CMV oraz sekwencji operatora operonu
tet.
WRE = WPRE  zwiększa eksport mRNA genu transkrybowanego z wewnętrznego promotora
(transgenu) z jądra do cytoplazmy.
HIV-1 flap = region zawierający sekwencje (w tym PPT) ułatwiające eksport wirusowego materiału
genetycznego do jądra.
Dox  doksycyklina.