WIADOMOÅšCI LEKARSKIE 2007, LX, 7 8
Nr 7 8 305
PRACE ORYGINALNE
ORIGINAL PAPERS
Małgorzata Barańska, Jadwiga Skrętkowicz
PERSPEKTYWY TERAPII GENOWEJ
Z Zakładu Farmakogenetyki Uniwersytetu Medycznego w A
odzi
W ciągu ostatnich lat obserwuje się znaczący rozwój strategii terapii genowej. Badania nad terapią genową prowadzone są dwukierunkowo
i polegają na: 1) zastąpieniu w komórkach somatycznych organizmu wadliwie działających genów ich sprawnymi kopiami oraz 2) blokowaniu
biosyntezy wadliwych produktów białkowych poprzez zmiany ekspresji genów. Terapeutyczne geny dostarczane są do komórek za pomocą
swoistych nośników, zwanych wektorami. Obecnie wykorzystuje się głównie wektory retrowirusowe i adenowirusowe, choć zastosowanie
znajduje również plazmidowy DNA. Liczba protokołów badań klinicznych terapii genowej wciąż rośnie. Dotyczą one przede wszystkim
chorób nowotworowych, wrodzonych defektów genetycznych oraz chorób układu sercowo-naczyniowego. Duże nadzieje wiąże się z zasto-
sowaniem terapii genowej w leczeniu chorób o podłożu autoimmunologicznym, głównie za pomocą blokowania ekspresji cytokin biorących
udział w procesach zapalnych lub neutralizowaniu ich receptorów. Odkryte ostatnio zjawisko interferencji RNA (RNA interference  RNAi)
zapoczątkowało badania nad hamowaniem ekspresji wybranych genów przez małe interferujące RNA (small interfering RNA  siRNA).
Mimo znaczącego postępu metodologicznego, zapewnienie pełnego bezpieczeństwa terapii genowej jest wciąż wyzwaniem wymagającym
dalszych intensywnych badań. [Wiad Lek 2007; 60(7 8): 305 311]
Słowa kluczowe: terapia genowa, nowotwory, choroby układu sercowo-naczyniowego, choroby autoimmunologiczne.
W każdej z komórek organizmu człowieka znajduje genetycznego poprzez zmianę ekspresji  uzupełnienie
się kilkadziesiąt tysięcy genów. Zapisana w nich infor- brakującej lub wadliwej ekspresji.
macja odczytana przez komórkę decyduje o działaniu Terapia genowa narodziła się na początku lat 90.
całego organizmu. Produktem, który kodują geny, są XX wieku. W 1990 r. w Stanach Zjednoczonych za-
najczęściej białka odpowiadające za poprawną budowę twierdzono jako pierwszą terapię genową ex vivo, próbę
i funkcjonowanie komórek. Jeśli białko nie działa prawi- wyznakowania genetycznego limfocytów wydzielanych
dłowo, zwykle winny jest wadliwy gen, który przekazał z guza litego (tumor infiltrating lymphocytes  TIL).
złą instrukcję jego wytwarzania. Dokonany w ostatnich Wprowadzony do limfocytów gen  marker, nadający
latach postęp techniczny w genetyce molekularnej umoż- limfocytom oporność na neomycynę, pozwolił na śle-
liwia izolację, klonowanie i sekwencjonowanie genów dzenie losów komórek po powtórnym wstrzyknięciu
pochodzących z organizmu człowieka. Umiejętność do organizmu chorego. W następnym etapie rozwoju tej
mapowania ludzkich genów, zwłaszcza tych, które są samej terapii, TIL wyizolowane od 30 pacjentów chorych
odpowiedzialne za zaburzenia dziedziczne, w przypad- na czerniaka, transfekowano in vitro genami kodujÄ…cymi
ku wielu chorób pozwala dokładnie i niedwuznacznie czynnik martwicy nowotworów (tumor necrosis factor
identyfikować genetyczne przyczyny chorób. Nasuwa  TNF) i interleukinę 2. Uzyskano statystycznie istotne
się pytanie o możliwość i wykorzystanie metod gene- zmniejszenie guzów. Historycznie drugą terapią genową
tycznych do leczenia lub poprawienia jakości życia osób była próba leczenia dzieci chorych na ciężki złożony
ze zdiagnozowaną chorobą dziedziczną. Jedną z metod zespół niedoboru odporności (severe combined immu-
dających takie możliwości jest przeprowadzenie terapii nodeficiency  SCID) związany z brakiem deaminazy
genowej, czyli izolowania potrzebnego genu i wprowa- adenozyny (adenosine deaminase  ADA)  enzymu
dzenia go do komórek osób dotkniętych chorobą. Warto uczestniczącego w katabolizmie puryn. Do krwiobiegu
zwrócić uwagę, że nie jest to leczenie samych tylko tych pacjentów wprowadzono limfocyty transfekowane
objawów  terapia genowa usuwa bowiem z
ródło proble- wektorem retrowirusowym z genem ADA. Uzyskano
mu. Genoterapia polega na wprowadzeniu syntetycznie odporność na antygeny, normalizację limfocytów i po-
otrzymanego genu, zwanego transgenem, do wnętrza jawienie się przeciwciał. Ze względu na ograniczoną
komórki w celu uzyskania jego ekspresji. Gen ten może żywotność limfocytów T, skuteczność terapii jest więk-
powodować zablokowanie nadmiernej ekspresji danego sza, jeśli pacjenci poddawani są zabiegowi wszczepiania
genu, zwiększenie jego ekspresji lub modyfikację błędu modyfikowanych limfocytów co kilka miesięcy [1].
M. Barańska, J. Skrętkowicz
306 Nr 7 8
Obecnie badania nad terapią genową prowadzone są tu genowego. Wektory konstruowane na bazie wirusów
dwukierunkowo i polegają na: 1) zastąpieniu w komór- związanych z adenowirusami są zdolne do przenoszenia
kach somatycznych organizmu wadliwie działających genów terapeutycznych zarówno do komórek somatycz-
genów ich sprawnymi kopiami; w ten sposób mogą być nych dzielących się, jak i będących w fazie spoczynku.
leczone choroby genetyczne będące wynikiem mutacji Wirusy adenosatelitarne wbudowują się w określone
jednego genu, takie jak: mukowiscydoza, hemofilie A miejsce na chromosomie 19, nie wywołując objawów
i B, dystrofia mięśniowa Duchenne a, SCID, rodzinna hi- niepożądanych. W celu przenoszenia leczniczych genów
percholesterolemia, fenyloketonuria, anemia sierpowata; wykorzystywane są również wirusy z rodziny Herpesvi-
2) wprowadzaniu prawidłowych genów terapeutycznych ridae (opryszczki). Wirusy te przenoszą duże fragmenty
w chorobach powstałych w wyniku mutacji wielu genów, genów do nie dzielących się komórek, co znalazło za-
takich jak miażdżyca, choroba Parkinsona, choroby stosowanie w leczeniu chorób nowotworowych. W tym
tkanki łącznej oraz choroby nowotworowe, które mogą celu próbuje się również wykorzystać wirusy krowianki,
powstawać na skutek nagromadzenia się uszkodzeń polio czy lentiwirusy. Lentiwirusy to podrodzina retro-
materiału genetycznego [2]. wirusów o cylindrycznym kształcie; mają one zdolność
Transfer genów do komórki odbywa się w systemie in wnikania do jądra komórki i nie są onkogenne. Wirusy
vitro, in vivo i ex vivo za pomocą nośników wirusowych HIV-1 oraz HIV-2 są najczęściej wykorzystywane jako
i niewirusowych. Terapia in vivo polega na wprowadza- wektory lentiwirusowe [3].
niu genów bezpośrednio do organizmu pacjenta, terapia Innym typem wektorów są wektory plazmidowe.
ex vivo zaś na pobraniu komórek od pacjenta, dodaniu Plazmidy są kolistymi cząsteczkami DNA zdolnymi do
do nich odpowiedniego genu w hodowli komórkowej replikacji w komórkach gospodarza niezależnej od repli-
i wprowadzeniu do organizmu chorego. Terapeutyczne kacji chromosomów. Preparaty plazmidowe uzyskuje się
geny dostarczane są do komórek za pomocą swoistych najczęściej metodą lizy zasadowej stransformowanych
nośników zwanych wektorami. Dobry wektor stosowa- bakterii Escherichia coli, a do oczyszczania wykorzy-
ny w terapii genowej powinien skutecznie przenosić stuje się metody chromatograficzne. Pozwalają one na
DNA do docelowych komórek i chronić leczniczy gen otrzymanie dużych ilości mRNA kodującego białko
przed zniszczeniem. Ważnym zagadnieniem związanym terapeutyczne [4]. Poza wymienionymi rodzajami wekto-
z nośnikami genów jest celowana ekspresja genów rów terapii genowej prowadzone są badania z wykorzy-
w wybranych tkankach docelowych. Wektor stosowany staniem transpozonów oraz sztucznych chromosomów.
w celowanej terapii powinien być trwały, nieimmu- Transpozony to ruchome elementy genetyczne zdolne
nogenny oraz posiadać zdolność pokonania bariery do zmiany miejsca położenia w genomie. Wykorzysty-
krew guz. Spośród wielu koncepcji przenoszenia wane są do otrzymywania organizmów transgenicznych,
terapeutycznych genów do uszkodzonych komórek z których wycina się zbędne geny i na ich miejsce
najbardziej obiecująca jest metoda przenoszenia za wprowadza się geny terapeutyczne. Istnieje możliwość,
pomocą wektorów wirusowych. Wirusy wykorzysty- że tak zmodyfikowane transpozony będą zdolne do
wane jako wektory są zmodyfikowane, tak aby miały przenoszenia terapeutycznych genów i ich integracji
zdolność infekowania komórek, ale pozbawione były z genomem uszkodzonej komórki, w której zajdzie eks-
własności chorobotwórczych i możliwości replikacji. presja leczniczego genu. Otrzymane niedawno sztuczne
Pozbawiane są także możliwie największej liczby włas- chromosomy ze wstawionym leczniczym genem mogą
nych genów kodujących białka wirusowe, które mogą przenosić długie sekwencje nukleotydowe bez wytwa-
wywoływać odpowiedz
immunologicznÄ… organizmu rzania bariery immunologicznej, zjawiska cechujÄ…cego
gospodarza. Najczęściej wykorzystywane są wirusy wielokrotne podawanie wektorów wirusowych [3].
z grupy adenowirusów, retrowirusów oraz wirusów Obecnie prowadzone są liczne badania nad możli-
adenosatelitarnych (adeno-associated virus  AAV). wością wykorzystania zastępczej terapii genowej do
Z wektorów adenowirusowych usuwa się geny odpowie- leczenia chorób uwarunkowanych genetycznie. Proto-
dzialne za ich właściwości chorobotwórcze, a następnie koły terapii genowej komórek somatycznych obejmują
przyłącza się geny terapeutyczne. Tak zmodyfikowany m.in.:
wirus wnika do jądra komórki, nie wbudowując się  ciężki złożony zespół niedoboru odporności (SCID)
jednak w chromosomy gospodarza, więc skutki jego  do limfocytów krążących oraz komórek pnia szpiku
działania nie utrzymują się po kolejnych podziałach kostnego wszczepiany jest gen deaminazy [5];
komórkowych. Proces przekształcania retrowirusów  hemofilia B  do limfocytów i fibroblastów skórnych
polega na usunięciu genów niosących informację o jego wszczepiany jest gen czynnika IX [6];
własnych białkach i enzymach oraz na wprowadzeniu na  rodzinna hipercholesterolemia  do hepatocytów
to miejsce genu leczniczego. Po zintegrowaniu z DNA wszczepiany jest gen receptora LDL [7];
komórki gospodarza wszczepiony gen replikuje wraz  mukowiscydoza  do komórek nabłonka dróg odde-
z nim, co skutkuje wytwarzaniem prawidłowego produk- chowych wszczepiany jest gen kodujący błonowe
Nr 7 8 Terapia genowa 307
białko  regulator przezbłonowego przewodzenia blokowanie procesu translacji i ekspresji określonego
(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator genu. Interferencja RNA wykorzystywana jest w komór-
 CFTR) [8]; kach jako naturalny mechanizm obrony przed wirusami
 dystrofia mięśniowa Duchenne a  do mioblastów wykorzystującymi komórkowe rybosomy do produkcji
wszczepiany jest gen kodujący dystrofinę [9]. własnych białek. W odróżnieniu od leków opartych na
Drugi rodzaj terapii genowej, na którym skupiona jest cząsteczkach antysensownego RNA, działanie siRNA
obecnie uwaga wielu grup badawczych, to terapia pole- polega na degradacji wielu czÄ…steczek mRNA, ma
gająca na blokowaniu biosyntezy wadliwych produktów znacznie efektywniejsze i bardziej selektywne działanie
białkowych. Hamowanie ekspresji zmutowanych genów wobec mRNA [10]. Zjawisko to zostało odkryte u roślin,
możliwe jest dzięki zastosowaniu technik wykorzystują- a dokładnie zbadane i opisane u nicieni. Wyniki badań
cych antysensowne oligonukleotydy, struktury tripleks, okazały się przełomowe w poznaniu regulacji ekspresji
Z-DNA czy aktywność rybozymów. Terapia antysensu genów, a naukowcy, Fire i Mello, którzy dokonali tych
polega na zablokowaniu ekspresji zmutowanego genu odkryć, zostali w 2006 r. uhonorowani Nagrodą Nobla
za pomocą krótkich, syntetycznych odcinków komple- w dziedzinie fizjologii i medycyny. Dzięki temu odkryciu
mentarnych oligonukleotydów. Wprowadzony odcinek możliwe jest selektywne wyłączanie genów kodujących
antysensownego (komplementarnego) oligo-DNA lub białka biorące udział w procesach doprowadzających
oligo-RNA ma zdolność łączenia się z cząsteczkami do różnego rodzaju patologii i powstawania komórek
zmutowanego mRNA będącego produktem transkrypcji nowotworowych.
uszkodzonych genów. Skutkiem tych procesów jest blo- Z wykorzystaniem nowoczesnych strategii w terapii
kowanie translacji białek, a co za tym idzie hamowanie genowej przeprowadzono już wiele badań przedklinicz-
ekspresji zmutowanego genu. Czynniki antysensowne nych oraz prób klinicznych w chorobach zakaz
nych,
dostarczane są do komórek albo poprzez wprowadzenie nowotworowych, neurologicznych, a także w chorobach
krótkiego odcinka oligo-DNA lub oligo-RNA komple- układu krążenia i autoimmunologicznych. Techniki
mentarnego do sekwencji, której ekspresja ma zostać antysensu stosowane są m.in.:
zablokowana, albo za pomocą wektora zawierającego  w leczeniu chorób wątroby  w ten sposób hamowana
sekwencję antysensowną, która w wyniku ekspresji jest replikacja wirusa żółtaczki typu B, a zastosowanie
produkuje odpowiednie krótkie odcinki antysensownego antysensownego czynnika wobec mRNA dla czynni-
RNA. Terapia genowa z wykorzystaniem struktur tri- ka wzrostowego transformujÄ…cego ² (transforming
pleksu polega na hamowaniu aktywnoÅ›ci genomowego growth factor ²  TGF-²) powoduje hamowanie
DNA, na którym zlokalizowane są zmutowane geny, rozwoju raka wątroby [11];
poprzez łączenie się wprowadzonych oligonukleotydów  blokowanie techniką antysensu mRNA produkcji
z tym dwuniciowym DNA w struktury tripleksowe. Ry- cząsteczek międzykomórkowej adhezji komórkowej
bozymy to krótkie odcinki RNA o specyficznej sekwencji (intracellular adhesion molecule 1  ICAM-1) oraz
zasad, mające zdolność do samotrawienia i enzyma- nabłonkowego czynnika wzrostu naczyń (vascular
tycznego cięcia innych cząsteczek mRNA. Proces ten endothelial growth factor  VEGF) może zahamować
zachodzi podczas dojrzewania mRNA i polega na wyci- procesy odrzucania przeszczepu [12];
naniu z pierwotnego traskryptu intronów. Ta aktywność  w leczeniu raka trzustki  powodują spadek aktyw-
skierowana przeciw odpowiednim cząsteczkom RNA ności lipooksygenazy i cyklooksygenazy, co hamuje
może być stosowana w terapii genowej. Specyficzne proliferację komórek nowotworowych [13];
cięcie mRNA przez te cząsteczki osłabia lub zapobiega  w terapii raka piersi  antysens mRNA dla katepsyny
translacji odpowiednich białek. Rybozymy przenoszone powoduje spadek poziomu katepsyny D, co hamuje
są do komórek za pomocą wektorów chemicznych (li- procesy nowotworowe [14].
posomów) lub adenowirusowych [2]. Innym rodzajem Rybozymy wykorzystywane są w genoterapii cho-
struktury wykorzystywanej w blokującej terapii genowej rób wirusowych; blokuje się w ten sposób namnażanie
jest lewoskrętna struktura Z-DNA o nietypowej zygzako- wirusa brodawczaka ludzkiego (human papilloma virus
watej budowie, powstajÄ…ca podczas transkrypcji RNA.  HPV), czynnika prowadzÄ…cego do transformacji nowo-
W USA opracowano przeciwnowotworowy lek, który tworowej, w wyniku której dochodzi do powstania raka
łącząc się ze strukturą Z-DNA w rejonie genów kodu- skóry, sromu i ust [15]. Obecnie trwają badania kliniczne
jących kinazy białkowe hamuje ich aktywność, co ma I oraz II fazy nad wykorzystaniem metody wyciszania
wpływ na procesy nowotworowe. Najnowszą techniką genów [10]: w okulistyce w leczeniu starczego zwyrod-
blokującej terapii genowej jest interferencja RNA (RNA nienia plamki żółtej (age-related macular degeneration
interference  RNAi), nazywana potranskrypcyjnym  AMD), w leczeniu wirusowych infekcji górnych dróg
wyłączaniem genów. Jest to zjawisko, w którym mała oddechowych, w chorobach nowotworowych i meta-
dwuniciowa cząsteczka RNA (small interfering RNA bolicznych oraz w przezwyciężeniu oporności wielo-
 siRNA) indukuje degradację mRNA, co powoduje lekowej poprzez zahamowanie ekspresji białka MDR1
M. Barańska, J. Skrętkowicz
308 Nr 7 8
(multidrug resistance) lub wyciszenie genu kodujÄ…cego ZaletÄ… antyangiogennej terapii genowej jest jej uni-
surwiwinę. wersalność, polegająca na możliwości zastosowania tych
Wiele badań nad blokującą terapią genową dotyczy samych genów terapeutycznych dla różnych guzów, brak
zespołu nabytego upośledzenia odporności (acquired efektów ubocznych i objawów klasycznej oporności na
immune deficiency syndrome  AIDS). Wykazano, że cytostatyki [17,18]. Prowadzone są również badania
hamowanie replikacji wirusa HIV-1 atakujÄ…cego lim- nad genami proapoptotycznymi. Strategia ta polega na
focyty CD4+ polega na inaktywacji RNA kodującego niszczeniu komórek nowotworowych poprzez induko-
białka wirusa, jak też ważnych dla cyklu życiowego wanie w nich śmierci mającej cechy apoptozy. Apoptoza
wirusa białek komórki. Stosuje się w tym celu strategie  programowana śmierć komórki, jest podstawowym
antysensu, rybozymów i wyciszania przez interferen- procesem eliminowania uszkodzonych komórek, nie-
cyjny RNA [16]. zdolnych do naprawienia różnego rodzaju defektów.
Ponad 60% prób klinicznych terapii genowej dotyczy Komórki nowotworowe są oporne na większość sygna-
leczenia chorób nowotworowych. Opierają się one na łów indukujących apoptozę i nie wchodzą w nią pomimo
ingerencji w proces rozwoju nowotworu, polegający uszkodzeń DNA i sygnałów otrzymywanych od innych
na aktywacji onkogenów i inaktywacji genów przeciw- komórek. Przyczyną tego zjawiska mogą być mutacje ge-
nowotworowych. Docelowymi komórkami w terapii nów kodujących białka biorące udział w regulacji apop-
genowej nowotworów mogą być: komórki nowotworo- tozy. Zmniejszeniu ekspresji genów proapoptotycznych
we, limfocyty (dla wywołania cytotoksyczności w sto- towarzyszy zazwyczaj nadekspresja genów kodujących
sunku do komórek guza), fibroblasty (indukcja produkcji inhibitory apoptozy. Najczęściej stosowanymi genami
czynników toksycznych dla komórek guza oraz dla proapoptotycznymi są geny kodujące białka indukują-
wywołania cytotoksyczności) oraz komórki śródbłonka ce apoptozę: bax, Blc-Xs, Bim, Bak. Strategia genów
naczyniowego (terapia antyangiogenna). i białek proapoptotycznych umożliwia zastosowanie
Niszczenie bezpośrednie komórek nowotworo- terapii skojarzonej z radioterapią lub chemioterapią, co
wych polega na zastosowaniu genów samobójczych może polepszyć efekty terapeutyczne tych metod [19].
kodujących enzymy umożliwiające przekształcenie Ostatnie doniesienia mówią o wykorzystaniu genów
nieaktywnego związku chemicznego w substancję ak- w leczeniu czerniaka złośliwego. Zespół naukowców
tywną, powodującą śmierć komórki lub prowadzącą do z USA opracował metodę modyfikacji receptorów rozpo-
uwrażliwienia komórki na chemioterapię lub radioterapię znających komórki nowotworowe, znajdujących się na
[17]. Zastosowanie genów immunomodulujących polega powierzchni limfocytów T. Od chorych z zaawansowaną
na wprowadzeniu genów kodujących cytokiny mobili- postacią czerniaka izolowano limfocyty T, następnie
zujące układ immunologiczny do swoistego niszczenia transfekowano je za pomocą nośnika retrowirusowego
komórek nowotworowych. Prowadzone są badania nad genem wzbudzającym ekspresję białka receptorowego
wprowadzeniem lokalnie do komórek rakowych lub MART-1 (melanoma antigen recognized by T cells) na
do limfocytów naciekających guz genów kodujących ich powierzchni. Dzięki temu receptorowi limfocyty T
interleukinę 2 (IL-2), IL-12, IL-4 oraz czynnik mart- są zdolne do rozpoznania komórek rakowych i ich zabi-
wicy nowotworu Ä… (tumor necrosis factor Ä…  TNF-Ä…). cia. Po tej modyfikacji limfocyty podawano chorym. Po
Cytokiny te działają przeciwnowotworowo poprzez kilku miesiącach u 2 chorych zaobserwowano regresję
aktywację cytotoksycznych limfocytów i makrofagów nowotworu i osoby te uznano za zdrowe. U 15 chorych
[12]. Za pomocÄ… inhibicji ekspresji genu dla TGF-² udaÅ‚o regresja nie nastÄ…piÅ‚a, 10% komórek nowotworowych
się zahamować rozwój raka wątroby [11]. Trzeci rodzaj z nieznanych przyczyn nie zostało zniszczonych przez
genów stosowanych w próbach terapii nowotworów zmodyfikowane limfocyty T [20]. Zespół naukowców
to geny hamujące powstawanie naczyń krwionośnych pracujących nad tym rodzajem terapii genowej ma jed-
w guzach pierwotnych i przerzutach, co prowadzi do nak nadzieję, że uda się opracować podobną modyfikację
zahamowania ich wzrostu. Przyjmuje się, że guzy lite bez limfocytów T zdolną do niszczenia innych rodzajów
sieci powstających naczyń krwionośnych nie są w stanie nowotworów. W Polsce najbardziej zaawansowane
przekroczyć kilku milimetrów sześciennych. Proces an- prace nad terapią genową nowotworów również doty-
giogenezy jest wieloetapowy i składa się na niego wiele czą czerniaka. W Zakładzie Immunologii Nowotworów
czynników pobudzających oraz hamujących unaczynie- w Poznaniu od kilku lat prowadzi się badania kliniczne
nie. W antyangiogennej terapii genowej stosuje siÄ™: geny II fazy, polegajÄ…ce na podawaniu chorym na czerniaka
wpływające na zahamowanie ekspresji genu VEGF (ko- złośliwego z przerzutami modyfikowanych genetycznie,
dujące białko p53, antysens mRNA), geny powodujące allogenicznych komórek czerniaka. U około 20% chorych
wiÄ…zanie VEGF (kodujÄ…ce zmodyfikowane receptory obserwuje siÄ™ obiektywnÄ… odpowiedz
klinicznÄ…, u dodat-
czynników wzrostu) oraz geny powodujące hamowanie kowych 30% zahamowanie rozwoju choroby [21].
proliferacji komórek śródbłonkowych (kodujące czynnik Terapia genowa znalazła szerokie zastosowanie w le-
płytkowy 4, angiostatynę, endostatynę). czeniu chorób układu sercowo-naczyniowego. Najwięcej
Nr 7 8 Terapia genowa 309
badań klinicznych dotyczy terapeutycznej angiogenezy wiążące fragment Fc immunoglobuliny G  Fcł. Wy-
wykorzystującej geny kodujące białka o charakterze kazano również, że jedną z przyczyn immunologicznej
dysregulacji w przebiegu SLE jest nieprawidłowa eks-
proangiogennym. Genami, które wprowadza się jako
dodatkowe do komórek niedokrwionego mięśnia ser- presja genów dla niektórych cytokin: IL-1, IL-6, IL-10,
TNF-ą i receptora wiążącego TNF-ą oraz interferonu ł
cowego w celu pobudzenia tworzenia nowych naczyń,
(IFN-Å‚) [27]. W przypadku SLE przeprowadzenie terapii
są geny kodujące naczyniowy śródbłonkowy czynnik
genowej jest szczególnie trudne ze względu na różno-
wzrostu (VEGF) oraz fibroblastyczny czynnik wzrostu
rodność czynników środowiskowych i genetycznych,
(fibroblast growth factor  FGF). Geny te wprowadza siÄ™
biorących udział w patogenezie choroby. Za pomocą
głównie za pomocą wektorów plazmidowych lub wiru-
wektorów wirusowych oraz plazmidowych wprowadza
sowych AAV do serca poprzez naczynia wieńcowe lub
się do organizmu transgeny, które modyfikują ekspresję
bezpośrednimi wstrzyknięciami do mięśnia sercowego.
następujących genów:
Zakłada się, że powstające naczynia krwionośne wezmą
 IFN-Å‚, blokowanie ekspresji, poprawa funkcji nerek
udział w tworzeniu krążenia obocznego w niedokrwionej
oraz wydłużenie czasu przeżycia;
tkance. W chorobie niedokrwiennej serca genoterapiÄ™
 TNF-², zwiÄ™kszenie ekspresji, zÅ‚agodzenie procesów
stosuje się również w zapobieganiu restenozie poprzez
zapalnych zachodzÄ…cych w nerkach w przebiegu
wprowadzenie genu kodującego śródbłonkową syntazę
tocznia oraz wydłużenie czasu przeżycia;
tlenku azotu (endothelial nitric oxide synthase  eNOS)
 IL-2, zwiększenie ekspresji, złagodzenie przebiegu
[22], w zapobieganiu niewydolności aortalno-wieńcowej
zapalenia nerek oraz zahamowanie procesu prolife-
za pomocÄ… genu kodujÄ…cego tkankowy inhibitor metelo-
racji limfocytów;
proteaz (tissue inhibitor of metalloproteinase  TIMP)
 IL-12, zwiększenie ekspresji, poprawa funkcji nerek
[23] oraz w stabilizacji blaszki miażdżycowej poprzez
oraz wydłużenie czasu przeżycia;
wprowadzenie genu kodujÄ…cego rozpuszczalnÄ… czÄ…stecz-
 CTLA-4Ig  rekombinowane białko blokujące
kę adhezyjną komórek naczyniowych (soluble vascular
kostymulację limfocytów T (CTLA-4  cytotoxic
cell adhesion molecule  sVCAM) [24].
T-lymphocyte-associated antigen  antygen 4 zwiÄ…zany
Na eksperymentalnych modelach niewydolności
z limfocytem cytotoksycznym), zwiększenie ekspre-
serca prowadzone sÄ… badania nad modyfikacjÄ… ekspre-
sji, zahamowanie procesów zapalnych zachodzących
sji genów kodujących białka regulujące gospodarkę
w nerkach;
wapniową w mięśniu sercowym oraz genów, których
 potrójna terapia genowa modyfikująca ekspresję
funkcjonowanie jest istotne dla przekaz
nictwa adrener-
CTLA-4Ig, TCR-Ä… (T-cell receptor Ä…) i TCR-²
gicznego w niewydolnym mięśniu sercowym [25,26].
 zahamowanie procesów zapalnych zachodzących
Duże nadzieje wiąże się z zastosowaniem terapii
w nerkach [28,29].
genowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych,
W dostępnej literaturze brak danych dotyczących
głównie za pomocą blokowania ekspresji cytokin biorą-
badań nad zastosowaniem terapii genowej w leczeniu
cych udział w procesach zapalnych lub neutralizowaniu
SLE u ludzi. Wymaga to udoskonalenia metod integracji
ich receptorów. W piśmiennictwie spotyka się już prace
genów kodujących pożądane białka z genomem ludzkich
dotyczące eksperymentów w tym zakresie. Wszystkie
komórek.
badania prowadzone sÄ… na eksperymentalnych modelach
Kolejnym złożonym schorzeniem, w którego lecze-
zwierzęcych tych chorób. Otrzymane wyniki mogą być
niu podejmowane są próby zastosowania genów, jest
przenoszone na patofizjologię ludzką, z pewną ostroż-
reumatoidalne zapalenie stawów (rheumatoid arthritis
nością po uwzględnieniu różnic międzygatunkowych.
 RA)  choroba autoimmunologiczna, o niewyjaśnionej
Dopiero po długotrwałym i pracochłonnym procesie
do końca etiologii oraz patogenezie. Przypuszcza się,
potwierdzającym skuteczność terapii modyfikującej
że istotną rolę w patogenezie RA odgrywają czynniki
ekspresję danego genu możliwe jest podjęcie prób
genetyczne oraz środowiskowe. Doświadczenia mające
klinicznych.
na celu zastosowanie terapii genowej prowadzone sÄ… na
Jednym ze schorzeń autoimmunologicznych jest
modelu zwierzęcym RA. Stwierdzono, że indukcja lokal-
toczeń rumieniowaty układowy (systemic lupus ery- nej ekspresji genu dla antagonisty receptora interleuki-
thematosus  SLE)  układowa choroba tkanki łącznej, ny 1 (IL-1Ra) powoduje zahamowanie lokalnego pro-
która charakteryzuje się wytwarzaniem autoprzeciwciał, cesu zapalnego zachodzącego w stawie [28,30].
aktywacją dopełniacza oraz odkładaniem się komplek- Twardzina układowa (skleroderma) należy do ukła-
sów immunologicznych w narządach. Wiadomo już, że dowych chorób tkanki łącznej, które cechuje przewlek-
za występowanie SLE odpowiedzialna jest kombinacja ły proces zapalny o podłożu autoimmunologicznym.
różnych genów. W patogenezie tocznia mogą odgrywać Charakteryzuje się ona uogólnionym zwłóknieniem
rolę geny mające związek z głównym układem zgod- skóry oraz narządów wewnętrznych, co jest efektem
ności tkankowej (human leukocyte antigen  HLA), m.in. nadmiernej syntezy i dojrzewania kolagenu [31].
geny kodujące składowe dopełniacza oraz receptory Wyodrębniono 2 postacie twardziny  ograniczoną
M. Barańska, J. Skrętkowicz
310 Nr 7 8
oraz układową. W przebiegu twardziny układowej Mimo prowadzonych intensywnie badań nad terapią
stwierdza się różnego rodzaju zaburzenia odpowiedzi genową, wprowadzenie tej metody do leczenia wymaga
immunologicznej, zarówno typu komórkowego, jak jeszcze wielu wysiłków. Stosowane obecnie wektory
i humoralnego. Ich przejawem jest m.in. obecność prze- nie są doskonałe: niektóre z nich przenoszą geny nie
ciwciał przeciwjądrowych (antinuclear antibody  ANA)
tylko do komórek docelowych, inne niezbyt wydajnie
w surowicy krwi i płynach ustrojowych. Chociaż mecha- transportują DNA, jeszcze inne pobudzają niepożądaną
nizmy indukcji ANA nie są w pełni poznane, zjawisko
odpowiedz
układu odpornościowego. Idealny wektor
autoimmunizacji uważane jest za czynnik biorący istotny
wirusowy powinien mieć wystarczająco dużą zdolność
udział w etiologii i patogenezie twardziny układowej.
infekowania komórek, a jego materiał genetyczny
Wynika to z faktu, że ANA nieomal zawsze (w ponad
powinien integrować się z DNA gospodarza w ściśle
95%) stwierdza się u chorych na twardzinę układową
określonym miejscu, co zapobiegałoby procesom no-
oraz że obserwuje się swoiste dla choroby autoprzeciw-
wotworzenia. Działanie transgenów nie jest długotrwałe
ciała, których nie stwierdza się w zdrowej populacji.
i wymaga częstego powtarzania. Do tej pory około 1000
W przeciwieństwie do tocznia układowego oraz innych
pacjentów objęto próbami z wykorzystaniem terapii ge-
układowych chorób tkanki łącznej, ANA skierowane są
nowej [34]. Oceniana jest toksyczność i bezpieczeństwo
przeciwko jednemu antygenowi. W przebiegu twardziny
stosowanych metod oraz wyniki kliniczne w postaci
dochodzi do masywnego zwłóknienia narządów wewnętrz-
oceny obiektywnych odpowiedzi klinicznych w małych
nych oraz zapalenia naczyń. W ostatnich latach podejmo-
grupach chorych. Większość stanowią przypadki doty-
wane są próby leczenia sklerodermy za pomocą genów.
czące schorzeń nowotworowych lub chorób wywołanych
Badania prowadzone sÄ… na modelu mysim. Po wprowa-
mutacjÄ… pojedynczego genu. NiewÄ…tpliwie sukcesem
dzeniu genu kodujÄ…cego HGF (hepatocyte growth factor
jest zastosowanie genów w leczeniu hemofilii B [34],
 czynnik wzrostu hepatocytów) do mięśni szkieletowych
w której udało się osiągnąć 10% normalnej aktywności
obserwowano zmniejszenie ekspresji mRNA dla TGF-²1
czynnika IX, czy zastosowanie angiogennej terapii
oraz złagodzenie objawów skórnych twardziny [32].
genowej w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych
Najbardziej zaawansowane prace nad terapiÄ… genowÄ…
[22,24]. Oczekuje się, że terapie oparte na metodzie
w chorobach autoimmunologicznych dotyczÄ… cukrzycy
wyciszania genów (RNAi) okażą się skuteczniejsze
typu I. Badania polegają na wprowadzaniu do komórek
i bezpieczniejsze od terapii bazujÄ…cych na wprowadzaniu
genów lub ich fragmentów w celu blokowania rozwoju
nowych genów.
autoagresji, ochronie komórek ² przed apoptozÄ…, wczes-
Genoterapia może być przeprowadzana u ludzi
nej indukcji ekspresji autoantygenów oraz indukcji
jedynie w celach terapeutycznych. Badania mogą być
mechanizmów zabezpieczajÄ…cych komórki ² przed
wykonywane tylko na komórkach somatycznych i wy-
stresem oksydacyjnym. Próby te prowadzone są na
magają ścisłego przestrzegania zasad bezpieczeństwa
modelu zwierzęcym autoimmunologicznej cukrzycy.
obowiązujących dla protokołów dotyczących manipula-
Wykazano, że blokowanie autoagresji może odbywać
cji genetycznych. W większości krajów zostały powołane
się przez wpływ na funkcję komórek immunokompe-
zespoły naukowców kontrolujące tego typu eksperymen-
tentnych za pomocÄ… modyfikacji prezentacji antygenu.
ty. W Polsce terapiÄ… genowÄ… zajmuje siÄ™ Komisja Ety-
Lokalna ekspresja w wyspach trzustkowych IL-4, IL-
ki Polskiej Akademii Umiejętności oraz Komitet Etyki
-10 oraz podjednostek IL-12 chroni przed naciekaniem
w Nauce Polskiej Akademii Nauk.
zapalnym wysp, zmniejsza zachorowalność na cukrzycę
Potencjał badań nad terapią genową jest znaczny
i opóz
nia ujawnianie siÄ™ choroby u zwierzÄ…t z cukrzycÄ…
i obecne postępy wskazują wyraz
nie, że istnieje moż-
doświadczalną. Udowodniono, że hamowanie apoptozy
liwość opracowania skutecznego sposobu leczenia nie-
ludzkich komórek wysp trzustkowych in vitro może być
których chorób. Badania te dostarczają również wielu
osiągnięte dzięki wprowadzeniu genu antyapoptotyczne-
nowych informacji o istotnym znaczeniu biologicznym.
go bcl-2 lub genu antagonisty receptora IL-1². Wczesna
Zaawansowane prace prowadzone przez firmy farma-
indukcja ekspresji proinsuliny, fragmentów Å‚aÅ„cucha ²
ceutyczne, zwłaszcza nad techniką wyłączania genów,
insuliny oraz niektórych antygenów II klasy HLA w gra-
pozwolÄ… prawdopodobnie na opracowanie skutecznego
sicy powoduje eliminację limfocytów autoreaktywnych.
leku stosowanego w terapii wielu chorób. Terapia geno-
Aktywacja ekspresji dysmutazy ponadtlenkowej i perok-
wa będzie, być może, w nadchodzących latach szeroko
sydazy glutationu w trzustce znosi toksyczne działanie
dostępna, bezpieczna i skuteczna, stanowiąc uzupeł-
rodnika ponadtlenkowego i nadtlenku wodoru na wyspy
nienie w leczeniu chirurgicznym, radiologicznym oraz
trzustkowe, wprowadzenie zaÅ› genu kodujÄ…cego katalazÄ™
zapobiega uszkodzeniu komórek ² [33]. preparatami konwencjonalnymi.
Nr 7 8 Terapia genowa 311
Piśmiennictwo
[1] Fikus M. Nowy wspaniały świat biotechnologii. W: Genetyka molekularna. Red. Węgleński P. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2002, 438 474.
[2] Kazula A. Wykorzystywanie nowoczesnej strategii w terapii genowej. Farm Pol 2004; 60: 736 756. [3] Kazula A. Wektory terapii genowej. Część 2. Farm
Pol 2003; 59: 297 309. [4] Małecki M. Preparaty plazmidowe w terapii genowej. Współcz Onkol 2004; 8: 321 327. [5] Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S,
Yates F, de Villartay JP, Le Deist F, Fischer A. Gene therapy of severe combined immunodeficiencies. J Gene Med 2001; 3: 201 206. [6] VandenDriessche T,
Collen D, Chuah MK. Gene therapy for the hemophilias. J Thromb Haemost 2003; 1: 1550 1558. [7] Cheng SH, Smith AE. Gene therapy progress and prospects:
gene therapy of lysosomal storage disorders. Gene Ther 2003; 10: 1275 1281. [8] Moss RB, Rodman D, Spencer LT, Aitken M, Zeitlin PL, Waltz D, Milla C,
Brody AS, Clancy JP, Ramsey B i wsp. Repeated adeno-associated virus serotype 2 aerosol-mediated cystic fibrosis transmembrane regulator gene transfer to the
lungs of patients with cystic fibrosis: a multicenter double-blind, placebo-controlled trial. Chest 2004; 125: 509 521. [9] van Deutekom JC, van Ommen GJB.
Advances in Duchenne muscular dystrophy gene therapy. Nat Rev Genet 2003; 4: 774 783. [10] Majorek M, Guzenda P, Lamparska-Przybysz M, Wieczorek M.
Krótkie interferujące RNA w onkologii. Współcz Onkol 2006; 10: 367 372.
[11] Prosser CC, Yen RD, Wu J. Molecular therapy for hepatic injury and fibrosis: where are we? World J Gastroenterol 2006; 12: 509 515. [12] Wojda U. Terapia
genowa komórek układu krwiotwórczego: rozwój strategii i wektorów. Post Biol Kom 2004; 31: 245 258. [13] Ding XZ, Tong WG, Adrian TE. Cyclooxygenases
and lipoxygenases as potential tergets for treatment of pancreatic cancer. Pancreatology 2001; 1: 291 299. [14] Glondu M, Liaudet-Coopman E, Derocq D,
Platet N, Rochefort H, Garcia M. Down-regulation of cathepsin-D expression by antisense gene transfer inhibits tumor growth and experimental lung metastasis
of human breast cancer cells. Oncogene 2002; 21: 5127 5134. [15] Alvarez-Salas LM, Cullinan AE, Siwkowski A, Hampel A, DiPaolo JA. Inhibition of HPV-16
E6/E7 immortalization of normal keratinocytes by hairpin ribozymes. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 1189 1194. [16] Fanning G, Amado R, Symonds G.
Gene therapy for HIV/AIDS: the potential for a new therapeutic regimen. J Gene Med 2003; 5: 645 653. [17] Wilczyńska U, Szary J, Szala S. Antyangiogenna
terapia genowa. Współcz Onkol 1999; 4: 139 142. [18] Małecki M, Gromek K, Przybyszewska M, Janik P. Plazmidowy wektor ekspresyjny kodujący receptor
sFLT-1 (psFLT-1) ogranicza angiogenezę i wzrost guzów L1. Współcz Onkol 2006; 10: 145 151. [19] Mitrus I, Missol-Kolka E, Szala S. Geny proapoptotyczne
w terapii genowej nowotworów. Współcz Onkol 2001; 5: 242 249. [20] Kaiser J. Building a Better Tumor Killer. Science Now 2006; 283: p3-3.
[21] Nawrocki S, Mackiewicz A. Terapia genowa nowotworów wyzwaniem XXI wieku. Współcz Onkol 2000; 4: 190 194. [22] Dulak J, Zagórska A, Wegiel B,
Loboda A, Józkowicz A. New strategies for cardiovascular gene therapy: regulatable pre-emptive expression of pro-angiogenic and antioxidant genes. Cell Biochem
Biophys 2006; 44: 31 42. [23] Dzida G, Hanzlik J. O najbliższych perspektywach terapii genowej chorób układu krążenia. Kardiol Pol 2002; 56: 470 472. [24]
Kołust P, Małecki M, Żelazny P, Teresińska A, Firek B, Janik P, Religa Z. Terapia genowa choroby wieńcowej plazmidem phVEGF165. Wyniki wczesne. Kardiol
Pol 2003; 59: 378 383. [25] Leszek P. Terapia genowa w niewydolności serca  modyfikacja obiegu wapnia. Pol Przegl Kardiol 2004; 6: 319 328. [26] Leszek P.
Terapia genowa w niewydolności serca. Modyfikacja aktywacji adrenergicznej  rzeczywistość czy mit? Pol Przegl Kardiol 2004; 6: 15 22. [27] Skrętkowicz J,
Skrętkowicz-Szarmach K, Rychlik-Sych M. Genetyczne uwarunkowania w patogenezie tocznia rumieniowatego układowego. Reumatologia 2004; 42: 567 572.
[28] Piccirillo CA, Prud homme GJ. Immune modulation by plasmid DNA-mediated cytokine gene transfer. Curr Pharm Des 2003; 9: 83 94. [29] Fujio K,
Okamoto A, Tahara H, Abe M, Jiang Y, Kitamura T, Hirose S, Yamamoto K. Nukleosome-specific regulatory T cells engineered by triple gene transfer supress
a systemic autoimmune disease. J Immunol 2004; 173: 2118 2125. [30] Abramson SB, Amin A. Blocking the effects of IL-1 in rheumatoid arthitis protects bone
and cartilage. Rheumatology 2002; 41: 927 980.
[31] Puszczewicz M. Przeciwciała przeciwjądrowe w twardzinie układowej  charakterystyka antygenowa i znaczenie kliniczne. Reumatologia 2006; 44:
169 175. [32] Wu MH, Yokozeki H, Takagwa S, Yamamoto T, Satoh T, Kaneda Y, Katayama I, Nishioka K. Hepatocyte growth factor both prevents and ameliorates
the symptoms of dermal sclerosis in a mouse model of scleroderma. Gene Ther 2004; 11: 170 180. [33] Krętowski A. Perspektywy leczenia przyczynowego
cukrzycy typu 1. Diabetol Klin Dośw 2003; 3: 475 480. [34] Ponder KP. Gene therapy for hemophilia. Curr Opin Hematol 2006; 13: 301 307.
Adres autorów: Małgorzata Barańska, Zakład Farmakogenetyki UM, ul. Muszyńskiego 1, 90-151 A
ódz

M. Barańska, J. Skrętkowicz
PROSPECTS OF GENE THERAPY
Summary
In recent years extensive development of gene therapy strategies has been observed. The studies on gene therapy focus on two different
research methods. The first one concerns replacement of damaged genes in somatic cells of the organism by correcting genes. Application of
modern methods of gene therapy permits to treat a disease already at the molecular level. Therefore, the second method deals with modifi-
cation of gene expression or obstruction of pathogenic biosynthesis of proteins. Correct genes are introduced to cells by special vectors. The
retroviral and adenoviral vectors are most frequently used clinically but very often the plasmid DNA is also useful. The number of clinical
trials has been rapidly increasing. Cancer, monogenic diseases and cardiovascular diseases are the main targets of clinical gene therapy. Many
hopes are linked with the gene therapy of autoimmune diseases in particular by blocking expression of inflammatory cytokines or neutralising
cytokine s receptors. Recently discovered phenomenon of interference of RNA (RNAi) has initiated research on inhibition of selected gene
expression by using small interfering RNA (siRNA). Despite the significant methodological progress, allowing safe gene therapy still represents
a challenge and requires further intensive research.
Key words: gene therapy, cancer, cardiovascular diseases, autoimmune diseases.