IMMUNOLOGIA  PRELEKCJA 6
[e-mail]
Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników
Służą one oznaczaniu substancji o charakterze białkowym w płynach ustrojowych.
Poszukiwany związek może być zarówno przeciwciałem jak i antygenem. Ogólna zasada wszystkich
metod polega na tym, że jeden ze składników kompleksu Ag-Ab wyznakowany jest znacznikiem
(markerem). Rodzaj tego znacznika dzieli metody na:
�� Immunoenzymatyczne (EIA)  znacznikiem jest enzym
�� Fluorymetryczne  znacznikiem jest fluorochrom  barwnik fluoryzujący w świetle o krótkiej
fali (zielony, żółty, czerwony)
�� Radioimmunometryczne (RIA)  znacznikiem jest pierwiastek promieniotwórczy
�� Chemiluminescenscyjne  znacznikami są określone substancje organiczne
Dodatkowo możemy wyróżnić metody
I generacji: aglutynacja, precypitacja, odczyn wiązania dopełniacza
II generacji: ELISA
III generacji: reakcja wykrywana jest nie metodą enzymatyczną, której czułość jest
ograniczona, lecz przy pomocy znaczników fluorescencyjnych i luminescencyjnych
(np. DELFIA  dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay, używamy
pierwiastków z rodziny lantanowców (Europ, Samar, Dyspros, Terb)
EIA  metody immunoenzymatyczne
Zasada metod immunoenzymatycznych:
ETAP 1) Reakcja antygen-przeciwciao
ETAP 2) Reakcja enzymatyczna wykrywająca kompleksy powstałe w etapie I
Etap pierwszy może przebiegać w roztworze (metody homogenne, np. EMIT), lub jeden ze
składników ulega wcześniejszemu związaniu z fazą stałą, np. powierzchnią polistyrenową płytki
serologicznej (metody heterogenne  ELISA)
Produkt reakcji katalizowanej przez enzym jest barwny, oznaczamy go metodami
spektrofotometrycznymi. Metody te charakteryzują się wysoką czułością oraz brakiem konieczności
stosowania pierwiastków promieniotwórczych co daje im przewagę nad metodami RIA.
Stosowane enzymy muszą spełniać takie warunki jak:
�� Rozpuszczalność
�� Stabilność
�� A
atwe i trwałe wiązanie się z białkiem
�� Nieobecność (lub występowanie w śladowych ilościach) w płynach ustrojowych
�� A
atwo dostępne substraty
�� Barwne produkty reakcji
Enzymy i substraty w metodach ELISA
Enzym y
ródło Substrat
Peroksydaza Chrzan OPD  o-fenylodiamina
TMB  tetrametylobenzydyna
5-AS  kwas 5-aminosalicylowy
Fosfataza Alkaliczna E.Coli p-nitrofenylofosforan
D-galaktozydaza E.coli Nitrofenylo-D-galaktozyd
METODY BEZPOŚREDNIE ELISA
- nie używamy surowicy antyglobulinowej
WYKRYWANIE ANTYGENU
1) TECHNIKA SANDWICH
przeciwciała przeciwko poszukiwanemu antygenowi ulegają zaadsorbowaniu na powierzchni polistyrenowej
płytki serologicznej. Po dodaniu próbki zawierającej antygeny powstaje kompleks. Wykrywa się go za pomocą
przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanemu antygenowi, które sprzężone jest z enzymem
przeciwciało znakowane enzymem
szukany antygen
przeciwciało opłaszczone na płytce
2) TECHNIKA KOMPETYCYJNA
reakcja zachodzi w 2 etapach:
1) reakcja przeciwciała zaadsorbowanego na polistyrenie a poszukiwanym antygenem
2) Do pozostałych, wolnych przeciwciał przyłącza się dodany antygen kontrolny, znakowany enzymem.
Im więcej poszukiwanego antygenu jest w badanej próbce, tym mniej antygenu kontrolnego przyłącza się w
drugim etapie
ETAP 1 ETAP 2 antygen kontrolny + enzym
E
antygen szukany
E
WYKRYWANIE PRZECIWCIAA
A
1) TECHNIKA KOMPETYCYJNA
Do probówki z opłaszczonym antygenem dodajemy badaną surowicę (z szukanymi przeciwciałami). Następnie
dodajemy znakowane przeciwciała. Następuje zjawisko współzawodnictwa o miejsca wiązania przeciwciała
szukanego i znakowanego enzymem.
Im więcej poszukiwanego przeciwciała jest w badanej próbce, tym mniej przeciwciała kontrolnego przyłącza się
do opłaszczonego antygenu i tym mniejsza reakcja barwna
ETAP 1 ETAP 2 przeciwciało kontrolne + enzym
Przeciwciało szukane
antygen opłaszczony
2) TECHNIKA ZNAKOWANEGO ANTYGENU
Antygen wiążemy z płytką polistyrenową, następnie dodajemy surowicę z poszukiwanymi przeciwciałami.
Tworzy się kompleks immunologiczny, który wykrywamy przez antygen kontrolny sprzężony z enzymem
E
Antygen kontrolny + enzym
E
Szukane przeciwciało
Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  metoda heterogenna EIA
Zastosowanie testu:
�� Wykrywanie obecności w płynach biologicznych antygenów i przeciwciał w chorobach
zakaz
nych i pasożytniczych
�� Ocena ilościowego stężenia hormonów
�� Wykrywanie obecności autoantygenów
METODY POŚREDNIE ELISA
- używamy surowicy antyglobulinowej
WYKRYWANIE ANTYGENU
1) TECHNIKA IMMUNOLOGICZNA POŚREDNIA
w odróżnieniu od metod omówionych powyżej, enzym jest sprzężony z tzw. II przeciwciałem, którym jest
surowica antyglobulinowa uzyskana w wyniku immunizacji zwierzęcia. Surowica antyglobulinowa wykrywa
wszystkie przeciwciała, bez względu na to przeciwko jakiemu antygenowi są skierowane
Surowica antyglobulinowa + enzym
Przeciwciało wolne
Szukany antygen
Przeciwciało zaadsorbowane na polistyrenie
WYKRYWANIE PRZECIWCIAA

1) TECHNIKA IMMUNOLOGICZNA POŚREDNIA
Antygen zaadsorbowany jest na polistyrenie, przeciwciała których szukamy wiążą się z nim. Powstały kompleks
jest wykrywany przez surowicę antyglobulinową
FIA - Metody fluorymetryczne
Metoda fluorymetryczna opiera się na pomiarze natężenia emitowanego
promieniowania fluorescencyjnego powstałego po wzbudzeniu próbki. Intensywność
fluorescencji danej substancji jest proporcjonalna do jej stężenia, w pewnym przedziale
stężeń.
Emisję wzbudza wiązka światła o małej długości fali, aby ją uzyskać stosujemy:
�� Filtry przepuszczające promieniowanie indukujące fluorescencję
�� Filtry usuwające promieniowanie niepożądane
Metody oznaczania są analogiczne do EIA, różnicą jest znacznik
METODY BEZPOŚREDNIE FIA
-bez użycia surowicy antyglobulinowej
Oznaczanie Antygenu
1) Metoda Sandwich
2) Metoda Kompetycyjna
Oznaczanie Przeciwciała
1) Metoda Kompetycyjna
2) Metoda znakowanego antygenu
METODY BEZPOŚREDNIE FIA
-z użyciem surowicy antyglobulinowej
Zalety metod pośrednich to:
�� Większa czułość i swoistość w porównaniu do metod pośrednich
�� Uniknięcie możliwości zmian swoistości przeciwciała podczas znakowania
Oznaczanie Antygenu
Oznaczanie Przeciwciała
RIA - Metoda radioimmunologiczna
RIA = Metoda bezpośrednia homogenna
Szukamy: antygenu
Znakujemy: antygen
Polega na wykrywaniu reakcji antygen-przeciwciało poprzez pomiar promieniowania
izotopów promieniotwórczych związanych z jednym ze składników kompleksu. Najczęściej
stosowane znaczniki to izotop 125J (wykrywany licznikiem gamma) i tryt 3H (wykrywany ciekłym
licznikiem scyntylacyjnym).
WYKRYWANIE ANTYGENU
Etap pierwszy  przygotowanie kontrolnej probówki, względem której określimy radioaktywność
badanej surowicy
1) Dodajemy do probówki znakowany izotopowo antygen, a następnie dodajemy w niedoborze
przeciwciało
2) Odpłukujemy powstałe kompleksy a następnie badamy radioaktywność pozostałych, nie
związanych antygenów
Antygen znakowany izotopem (określona ilość, ale w nadmiarze w stosunku do przeciwciała)
Badamy radioaktywność
odpłukujemy
Przeciwciało
(również określona ilość, ale w niedoborze)
Etap drugi
1) Do drugiej probówki dodajemy najpierw przeciwciała (tyle samo co w etapie pierwszym)
2) Do tej samej probówki dodajemy badaną surowicę
3) Dodajemy radioaktywne antygeny (tyle samo co w etapie pierwszym)
4) Odpłukujemy kompleksy i badamy radioaktywność
* im większa radioaktywność tym więcej wolnych, znakowanych antygenów, co z kolei oznacza
że powstało dużo kompleksów przeciwciało-szukany antygen
Zastosowanie metod RIA
�� Ilościowe oznaczanie antygenów lub przeciwciał
�� Oznaczanie stężenia hormonów w płynach ustrojowych
�� Wykrywanie obecności białek towarzyszących nowotworom (np. antygenu rakowo-
płodowego i alfa-fetoproteiny)
�� Oznaczanie ilości swoistych przeciwciał klasy IgE w alergiach
�� Oznaczanie stężenia witamin i leków
�� Wykrywanie obecności autoprzeciwciał w schorzeniach autoimmunologicznych
W oparciu o techniki immunoradiometryczne opracowano dwa testy do oznaczania poziomu IgE o
danej swoistości w surowicy , oraz poziomu IgE w alergologii:
�� RAST (RadioAlergoSorbent Test)  oznaczanie konkretnych IgE
�� RIST (RadioImmunoSorbent Test)  ogólne stężenie IgE
IRMA  metoda immunoradiometryczna
Znakujemy przeciwciało, szukamy antygenu
IRMA = metoda bezpośrednia, heterogenna
Jeden ze składników reakcji związany jest z fazą stałą. Może to być plastikowa próbówka
bądz
mikropłytka którą opłaszczamy nie znakowanymi przeciwciałami, po czym dodajemy badanego
materiału (poszukujemy antygenu), a po inkubacji  znakowanego przeciwciała, uzyskanego przez
immunizację innego gatunku ludzkim poszukiwanym antygenem i inkubujemy ponownie. Nadmiar
nie związanych przeciwciał odpłukujemy, po czym mierzymy radioaktywność na płytce bądz
w
próbówce.
Etap I Etap II Etap III Etap IV
 dodanie surowicy badanej - płukanie - dodanie Ab znakowane - płukanie
- mierzenie radioaktywności
Metody chemiluminescencyjne
Są oparte na pomiarze emisji fotonów w przebiegu reakcji chemicznej. Jeden z
reagentów oznakowany jest substancją organiczną  lucyferyną lub estrem akrydyny. W
przebiegu znacznikowej reakcji chemicznej zachodzi emisja promieniowania w zakresie
światła widzialnego, które mierzymy za pomocą luminometru. Emisja fotonów trwająca kilka
sekund przetwarzana jest na liczbę impulsów na minutę. Technika ta stosowana jest do
ilościowego pomiaru tak antygenu jak i przeciwciała.
Metody immunomorfologiczne
Dzielą się one na:
�� Metody immunofluorescencyjne  znacznikiem są flurorchromy
�� Metody immunoenzymatyczne  znacznikiem są enzymy
�� Z użyciem metali szlachetnych jako znacznika  wykorzystujemy np. roztwór
koloidalny złota otrzymywany z kwasu chlorozłotawego za pomocą reduktorów
(aldehyd mrówkowy, kwasy organiczne)
Materiał do badań stanowią:
�� Wycinki tkanek (bioptaty)
�� Zawiesina żywych komórek (krew)
�� Zawiesina żywych bakterii
Preparaty ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (Metody immunofluorescencyjne) lub
świetlnym (Metody immunoenzymatyczne)
METODA IMMUNOFLUORESCENCYJNA BEZPOŚREDNIA
np. Wykrywanie antygenu chlamydia trachomatis w wymazach z kanału szyjki macicy.
1) Dwubarwna reakcja immunofluorescencji
Wykorzystujemy dwa fluorochromy emitujące światło o różnych barwach, co pozwala nam na ocenę w preparacie dwóch
różnych antygenów. Reakcja przebiega w kilku etapach:
�� Badany materiał inkubujemy ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla pierwszego antygenu (np. p/ciała
przeciw białku SpoIIAB znakowane FITC, dającym kolor zielony)
�� Następnie inkubujemy próbkę ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla drugiego antygenu (np. anty DNA
znakowane RITC, dającym kolor czerwony)
Wynikiem reakcji jest dwukolorowy preparat oceniany w mikroskopie fluorescencyjnym.
Zastosowanie  np. wykrywanie komórek Baccillus subtilis przekształcających się w przetrwalniki.
METODA IMMUNOFLUORESCENCYJNA POŚREDNIA
Charakteryzują się większą czułością.
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanych
fluorescencyjnie przeciwciał immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze swoistym
antygenem.
Wynik pozytywny: fluorescencja obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym
Wynik negatywny: brak przeciwciał = brak fluorescencji
Technologia BIOCHIP
Wycinki tkanek, hodowle komórek lub rozmazy bakterii są umieszczane na
cieniutkich płytkach szklanych, które są dzielone na milimetrowej wielkości fragmenty
(BIOCHIPy), które są przyklejane automatycznie do szkiełek mikroskopowych. Technologię
tą można wykorzystać do wykrywania w jednej próbce przeciwciał przeciwko kilku
antygenom.
Metoda ta znalazła zastosowanie w diagnostyce infekcji układu oddechowego:
bakteryjnych: wirusowych:
�� Botredella pertussis i parapertussis �� Herpes simplex virus 1
�� Haemophilus influenzae �� Wirusy oddechowe
�� Leginonella pneumoniae �� Adenovirus
�� Klebsiella pneumoniae �� Influenza A i B virus
�� Chlamydia trachomatis �� Parainfluenza virus 1-4
�� Chlamydophila pneumoniae �� Coxsackie (A7, A9, A16, A24, B1 do
B6)
1) Metody immunomorfologiczne EIA (immunohistochemiczne)
Analogicznie do w/w testów immunoenzymatycznych, w metodach tych do
znakowania przeciwciał stosuje się enzymy katalizujące reakcje dające barwne produkty.
Detekcji kompleksów dokonuje się za pomocą metod immunohistochemicznych. Są to
metody jakościowe. Stosowane enzymy muszą spełniać takie same kryteria jak w przypadku
testów immunoenzymatycznych, stąd też w metodach tych najczęściej stosuje się wyżej
wymienione enzymy (peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, oksydazę glukozową),
natomiast stosowane chromogeny to:
�� Tetrachlorowodorek 3,3-dwuaminobenzydyny (DAB)  daje ciemnobrązowy produkt
nierozpuszczalny w wodzie.
�� 3-amino-9-etylokarbazol (AEC)  daje czerwony produkt nierozpuszczalny w wodzie,
rozpuszczalny w alkoholu.
Reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP)
Składa się z dwóch etapów:
�� W pierwszym etapie wykrywamy antygen swoistym
przeciwciałem
�� W drugim etapie dodajemy p/ciał znakowanych
enzymem peroksydaza-antyperoksydaza związanych za
pomocą mostka  wiążą się one z kompleksem Ab-Ag
poprzez warstwę pośrednią nieznakowanych p/ciał
reagujących z przeciwciałem pierwotnym oraz
kompleksem enzym-antyenzym
�� W trzecim etapie dodajemy H2O2 i związek
chromogenny
�� W czwartym etapie odczytujemy wynik reakcji 
obecność poszukiwanego antygenu oceniamy na
podstawie wyniku badanej reakcji  obecności lub braku
brązowego (lub innego koloru) barwnika (zależy od
chromogenu).
Zastosowanie metody to wykrywanie markerów nowotworowych w tkankach:
Typ nowotworu Marker wykrywany immunoenzymatycznie
Mięsak gładkokomórkowy okrężnicy Przeciwciała przeciwaktynowe
A
agodny przerost gruczołu krokowego Receptory androgenowe
Rak przewodów żółciowych Receptory Bcl-X
Chłoniak pochodzący z limf. T CD3
Chłoniak Hodgkin a CD15
Rakowiak (nowotwór okresu płodowego) Chromogranina A
Chłoniak CPP32
Złośliwy międzybłoniak pochodzący z
Cytokeratyna 5/6
nowotworu błony surowiczej
Rak piersi Receptor estrogenowy
Czerniak złośliwy Kompleksy melaniny A
Reakcja fosfataza alkaliczna  antyfosfataza alkaliczna (APAAP)
Zasada metody jest podobna do reakcji PAP, różni się
jedynie wykorzystywanym kompleksem.
Zastosowanie metody jest bardzo podobne, służy ona
do wykrywania obecności antygenów w tkankach.
Barwne, czerwone produkty reakcji są dobrze
widoczne w mikroskopie świetlnym.
Zastosowanie metody:
Typ nowotworu Marker wykrywany
immunoenzymatycznie
Anaplasyczny chłoniak CD30
olbrzymiokomórkowy
A
uskowaty rak skóry Nabłonkowy cz. wzrostu
EGFR
Chłoniak obwodowy Granzym B
wyw. z limfocytów T
Reakcje z układem biotyna-awidyna
W metodzie tej wykorzystuje się wysokie
powinowactwo biotyny (nisko cząsteczkowej wit.
H) do zasadowej glikoproteiny białka jaja kurzego
 awidyny. Czasem zamiast awidyny wykorzystuje
się streptawidynę, izolowaną z bakterii
Streptomyces avidini.
Cytometria przepływowa
Jest to nowoczesna metoda badawcza służąca do wieloparametrowej oceny komórek układu
krwiotwórczego. Pozwala ona na jednoczesne określenie:
�� Komórek krwi na podstawie ich wielkości i granularności (populacje erytrocytów, granulocytów,
limfocytów, monocytów i trombocytów)
�� Różnych rodzajów antygenów różnicowania (CD) i innych poprzez użycie przeciwciał monoklonalnych
znakowanych różnymi fluorochromami.
Warunkiem wykonania analizy cytometrycznej jest doprowadzenie posiadanego materiału do zawiesiny
pojedynczych komórek. Przy pobieraniu krwi do badań cytometrycznych stosujemy odpowiedni antykoagulant:
�� EDTA i heparyna  dla pełnej krwi
�� Hirudyna  dla szpiku kostnego
Po dokonaniu analizy można komórki sortować na poszczególne frakcje stosując odpowiednie urządzenie
pomiarowe, tzw. sorter komórek.
Zasada metody polega na tym, że komórki kierowane są do kanału w strumieniu cieczy pojedynczo, po
czym wiązka niebieskiego bądz
ultrafioletowego światła oświetla przepływające komórki, ulegając ugięciu i
rozproszeniu, a jeśli komórki zostały wyznakowane znacznikiem fluorescencyjnym, także wzbudzając
fluorescencję. y
ródłem światła są lasery lub rtęciowe lampy wysokociśnieniowe. Światło ugięte i rozproszone, a
także fluorescencyjne zbierane jest przez odpowiednio dopasowany układ optyczny, przesyłający je poprzez
filtry zaporowe do detektorów. Następnie dołączony system automatyki, sterowania oraz komputer zbiera i
przetwarza uzyskane dane, co pozwala na ocenę parametrów co najmniej 100 komórek na sekundę. Liczba
mierzonych parametrów zależy od rodzaju przyrządu.
Wykorzystywane w tej metodzie barwniki to fikobiliproteiny:
�� Fikoerytryna B, fikoerytryna R (światło czerwone)
�� Fikocyjanina C, fikocyjanina R (światło fioletowe)
�� Allofikocyjanina (światło zielone)
Do oznaczania DNA w komórce stosowany jest jodek propidyny.
Techniką cytometrii przepływowej możemy:
�� Określić liczebność populacji komórek w badanym materiale
�� Określić cechy morfologiczne (fenotyp) badanych komórek
�� Ocenić stan czynnościowy komórek
�� Oznaczyć stopień ekspresji antygenu na powierzchni komórek
�� Oznaczać ilościowo niektóre białka (cytokiny)
Wyznaczanie powyższych parametrów jest przydatne w diagnostyce klinicznej  umożliwia monitorowanie stanu
immunologicznego w trakcie choroby i leczenia.
�� Określić fenotyp komórek blastycznych w białaczkach ostrych
�� Diagnozować:
- chłoniaki
- białaczki przewlekłe
- zespoły mielodysplastyczne (MDS)
�� Oceniać DNA w komórkach białaczkowych
�� Poszukiwać choroby resztkowej (MRD)
�� Oceniać molekułę lekooporności (MDR)
�� Monitorować pacjentów po przeszczepach allogenicznych i szpiku
�� Badać komórki krwiotwórcze, retikulocyty i erytrocyty
�� Oceniać morfologicznie i czynnościowo płytki krwi
�� Diagnozować AIDS przez ocenę limfocytów CD4
�� Wykrywać erytrocyty płodu we krwi matki
�� Oznaczać ilościowo cytokiny
Najczęściej stosowane markery to:
�� CD45 leukocytów
�� CD3 limfocytów
�� CD19 i CD20 limfocytów B
�� CD15 neutrofili
�� CD16 i CD56 komórek NK