Wykład 1 (22.02.2012r.)
Biotechnologia  złożenie 3 greckich słów bio-życie technos-rzemiosło logos-nauka.
Definicje podkreślają
1. Charakter interdyscyplinarny
2. Praktyczne wykorzystanie
Biotechnologia  dziedzina integrująca nauki przyrodnicze i inżynieryjne, a także społeczno-
ekonomiczne w celu wykorzystania organizmów, komórek, ich składników, a także analogów
molekularnych w produkcji i w usługach.
Jakie nauki biologiczne są podstawą biotechnologii? - biologia komórki, fizjologia,
biochemia, biofizyka, fizjologia roślin, genetyka.
Aby produkować na dużą skalę, np. enzymy, trzeba mieć odpowiednie urządzenie, które
projektuje inżynier.
Nauki techniczne (inżynieryjne)  reologia, mechanika, matematyka, inżynieria bioprocesowa
 to właśnie druga grupa nauk, z której korzystają biotechnologowie.
Ekonomia  biotechnolodzy w praktyce produkują to co jest opłacalne i na co jest zbyt, do
praktyki przechodzi tylko to co znajdzie nabywców.
Aspekty ekonomiczne
1. Produkty zdolne do ekonomicznej konkurencji na rynku
2. Zasady technologiczne: proces nie w warunkach optymalnych, ale opłacalnych
3. Koszt produktu  bardzo ważne kryterium
4. Opłacalność: max wykorzystania substratów, min zużycie energii
5. Czynniki  rodzaj produktu, rynku
Kierunki wykorzystania biotechnologii :
üð produkcja leków (np. antybiotyki, steroidy, szczepionki, leki rekombinowane, testy
diagnostyczne)
üð rolnictwo (roÅ›liny modyfikowane)
üð analityka
üð ochrona Å›rodowiska
üð przemysÅ‚ spożywczy
üð inne zastosowanie
üð noÅ›niki energii
üð przemysÅ‚ chemiczny
üð ochrona zdrowia
Etapy rozwoju biotechnologii
1. Intuicyjny  ok. 8 tys. lat temu p.n.e. (Sumerowie)- XIX w. (L. Pasteur)
Choroby zakaz
ne (wścieklizna, gruz
lica, trÄ…d), uprawa roli, hodowla zwierzÄ…t 
nadprodukcja żywności, psucie się żywności, żyzność i wyjałowienie gleby, procesy
fermentacji [Drożdże  piwo, chleb, wino]  bakterie fermentacji lekowej 
fermentacja mleka i warzyw
1
Stosowane techniki - dawniej:warunki domowe, mała skala, nie znano podłoża
procesu, nie znano oceny przebiegu procesu  procesy te miały charakter okresowy,
rozpoczynano je po zmiażdżeniu owoców, a kończono po uzyskaniu wina, czyli brak
ciągłości.
2. Pasterowski
3. Przemysłowy
4. Naukowy
Drobnoustroje? IDEA = metoda i narzędzia
üð XIII w. Bacon  okulary
üð XVI w. Jan i Zachariusz Jensenowie  pierwowzór mikroskopu
üð 1663r. Robert Hook opisuje komórki
üð 1675r. Antoni van Leeuwenhoek opisuje bakterie
üð XIX w. Abbe i Zeiss, zdolność rozdzielcza mikroskopu  0,2 mikrometra
üð XX w. Ernest Ruska  mikroskop elektronowy
Zdolność rozdzielcza mikroskopu  najmniejsza odległość między 2 punktami, które widzimy
jako swa oddzielne.
Okres pasteurowski
1857r. Pasteur wyjaśnił zasadę fermentacji etanolowej  rola drożdży
Saccharomycescerevisiae w produkcji wina
1940-42r. uruchomienie przemysłowej produkcji penicyliny
üð studia chemiczne (Paryż) zjawisko izomerii optycznej
üð fermentacja etanolowa  proces zastÄ™pujÄ…cy drożdżom oddychanie
üð obalenie teorii samorództwa
üð diagnostyka i zapobieganie pebrynie
üð szczepionki przeciwko: wÄ…glikowi, cholerze drobiu, wÅ›cieklizna
üð sterylizacja szkÅ‚a, pasteryzacja, bulion, czyste hodowle
Robert Koch (1843-1910) Niemiec z Wolsztyna
üð pierwsze podÅ‚oże staÅ‚e, ziemniak, żelatyna, agar, pÅ‚ytki (Petriego)
üð parwienie bakterii
üð prÄ…tki gruz
licy
üð przecinkowiec cholery
Okres pasteurowski  rozwój nauki:
üð Mendel (opisaÅ‚ prawa genetyczne)
üð Iwanowski (opisaÅ‚ wirus mozaiki tytoniowej)
üð Gram (przedstawiÅ‚ metodÄ™ barwienia bakterii)
üð Clamette i Guerin (uzyskali szczepionkÄ™ przeciwko gruz
licy)
üð Griffith (ojeciec biotechnologii genetycznej)
üð Sir Alexander Fleming (zajmowaÅ‚ siÄ™ lizozymem, jest odkrywcÄ… penicyliny)
2
Okres pasteurowski  kalendarium:
üð Rozwój przemysÅ‚u, I wojna Å›wiatowa
üð Oczyszczanie Å›cieków, przemysÅ‚owa produkcja czystych szczepów,enzymów
üð Niemcy: produkcja acetonu butanolu, glicerolu
üð Bioreaktory (fermentory), SCP z odpadów
Przemysłowa produkcja penicyliny 1941-42r
üð Florey, Chain, Haetly,Dmochowski
üð Szczep P. chrysogenum  2x bardziej wydajny
üð Mutagenizacja szczepu, szczep E-15.1, 55x bardziej aktywny niż szczep Fleminga
Antybiotyki promieniowców  Promieniowce: Gram+, tlenowe, gleba, pseudogrzybnia,
konidia. Najlczniejsza grupa producentów antybiotyków. Poznano około 2000 związków. U
ponad 50% znanych gatunków Streptomyces wykryto szczepy produkujące antybiotyki.
Nystatyna  I antybiotyk przeciwgrzybowy Ä…ð Elizabeth Hazen i Rachel Brown: Instytut
Zdrowia w Nowym Jorku, próbka gleby z ogrodu znajomych o nazwisku Nourses. 1950r. 
izolacja Streptomycesnoursei (promieniowiec). 1957r.  patent.
Etap naukowy biotechnologii
üð PrzeÅ‚ożenie kodu genetycznego na kolejność AA
üð Plazmidy jako wektory do przenoszenia DNA
üð Enzymy restrykcyjne  ciÄ™cia DNA w okreÅ›lonych miejscach
üð 1973r. technika rekombinacji DNA
üð 1974r. Ig monoklonalne
üð 1977r. sekwencjonowanie DNA
üð 1978r. produkcja ludzkiej insuliny
üð 1979r. izolacja termofilnych bakterii z grupy Archea (105 st. C )
üð 1981r. pierwsze transgeniczne zwierzÄ™  zÅ‚oty karp, Chiny
üð 1981r. I firma biotechnologiczna
PCR  łańcuchowa reakcja polimerazy  pozwala powielać sekwencję DNA o ile znamy
krótkie sekwencje ją otaczające. Analiza DNA ze szczątków organizmów kopalnych, mumii
egipskich.
Kary Mullis
üð Biochemik i biotechnolog USA
üð 1983r. pomysÅ‚: metoda PCR (publikacja odrzucona przez Nature, przyjÄ™ta przez
Science)
üð F. CetusCorporation Kalifornia odkupuje prawa do wynalazku za 10 tysiÄ™cy $
üð Cetus odsprzedaje prawa do patentu firmie LaRoche (300 milionów $)
üð 1993r. Nagroda Nobla
3
Etap naukowy
üð 1955r. produkcja genetycznie zmodyfikowanej soi i ziemniaków
üð 1997r. sklonowanie owieczki Dolly
üð 2000r. opublikowanie wersji roboczej ludzkiego genomu
üð 2002r. zsekwencjonowanie DNA z ryżu
üð 2003r. GloFish  fluoryzujÄ…ce transgeniczne danio
Wykład 2 (29.02.2012r.)
Biotechnologia obecnie:
üð zdobycze współczesnej genetyki
üð biologia molekularna
üð inżynieria bioprocesowa
üð inżynieria biaÅ‚kowa
üð inżynieria enzymów
üð techniki komputerowe
üð procesy syntezy, rozkÅ‚adu, biokonwersji
üð metabolity pierwotne, wtórne (antybiotyki)
üð produkty optymalne przy użyciu zrekombinowanych komórek
Podział biotechnologii:
1. Biotechnologie tradycyjne
Znane od tysiącleci (browarstwo, winiarstwo). Przebiegające z użyciem naturalnych
enzymów lun organizmów nie zawierających obcego materiału genetycznego.
2. Biotechnologie nowoczesne
Stosowane organizmy lub linie komórkowe konstruowane są metodami inżynierii
genetycznej.
!!! Podział  kryterium
1. wykorzystanie nowoczesnych technik inżynierii genetycznej
2. stosowany organizm (biotechnologia drobnoustrojów, roślin, zwierząt)
3. obszar wykorzystania (biotechnologia środowiskowa, medyczna, żywności)
4. stosowane metody (biotechnologia molekularna)
Biotechnologia biała  wykorzystanie systemów biologicznych w przemyśle i ochronie
środowiska.
Biotechnologia zielona  stosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia
produkcji roślinnej i zwierzęcej. Transgeniczne rośliny: produkcja szczepionek doustnych,
rekombinowanych białek (z
ródło surowców odnawialnych w bioreaktorach,
nowe odmiany roślin uprawnych).
Biotechnologia czerwona  w ochronie zdrowia, do produkcji nowych biofarmaceutyków,
rozwoju diagnostyki genetycznej, genoterapii.
Biotechnologia niebieska  wody, biotechnologia środowiskowa (oczyszczanie wód, ścieków)
Biotechnologia fioletowa  społeczny, biobezpieczeństwo, edukacja, IPR, organizmy
transgeniczne.
4
Przyszłość biotechnologii:
üð Genomika (poznanie genomu)
üð Farmakogenomika
üð Proteomika (poznanie proteomu)
üð Bioinformatyka
üð Nanotechnologia
Nanosrebro  silne działanie bakteriobójcze, przeciwdrobnoustrojowe
Biotechnologia drobnoustrojów  pozyskanie, ulepszanie, przechowywanie szczepów
przemysłowych.
!!! Drobnoustroje (mikroorganizmy):
üð Virales (wirusy)  zdolność do wytwarzania czÄ…steczek potomnych
üð Prokariota (bakterie, Archaea, sinice)
üð Eukariota (grzyby  ale nie kapeluszowe; glony  ale nie plechowce; pierwotniaki)
!!! Mikroorganizmy (drobnoustroje) cechy wspólne:
üð mikroskopijna budowa
üð metody badawcze (izolacja, obserwacje, hodowla)
!!! Zalety produkcji prowadzonej przy użyciu drobnoustrojów:
üð niezależność produkcji od wahaÅ„ klimatycznych i sezonowych
üð produkcja przy użyciu drobnoustrojów jest szybka
üð możliwość zwiÄ™kszania wydajnoÅ›ci (opÅ‚acalność produkcji) przez
·ð optymalizacjÄ™ warunków hodowli
·ð stosowanie odpadów przemysÅ‚owych
·ð poprawÄ™ zdolnoÅ›ci produkowanych drobnoustrojów na drodze mutagenizacji
lub inżynierii genetycznej
üð stosowanie Å‚agodnych warunków produkcji
!!! Skrining (ang. Screening)
üð zespół czynnoÅ›ci majÄ…cych na celu wyizolowanie drobnoustrojów o poszukiwanych
uzdolnieniach metabolicznych, połączone ze wstępną oceną przydatności do
stosowania w procesie technologicznym.
!!! Etapy skriningu:
üð wybór z
ródła/ miejsca izolacji
üð pobranie próbek (+/- wstÄ™pne zwiÄ™kszenie liczebnoÅ›ci)
üð izolacja czystych kultur poÅ‚Ä…czona ze wstÄ™pnÄ… selekcjÄ… (+/-  skrinig jednoetapowy )
üð namnożenie czystych kultur
üð badanie przydatnoÅ›ci drobnoustrojów do okreÅ›lonego procesu technologicznego
Pobieranie prób ze środowiska:
üð +/- wstÄ™pne zwiÄ™kszenie liczebnoÅ›ci
üð wabiki (puÅ‚apki) wprowadzone do Å›rodowiska
·ð paÅ‚eczki powlekane parafinÄ…  Streptomyces
5
·ð rurki szkalne wypeÅ‚nione odpowiednim podÅ‚ożem, kawaÅ‚ki drewna, liÅ›cie
üð obróbka fizyczna lub chemiczna przed wysianiem próby na podÅ‚oże
·ð ogrzanie probówki do 1000C (drobnoustroje przetrwalnikujÄ…ce)
·ð wirowanie 1600x g, supernatant (promieniowce)
·ð inkubacja próbki z dodatkiem kredy, wysiew po 7 dniach ( promieniowce)
Izolacja czystych kultur połączona ze wstępną selekcją:
Podłoża hodowlane z dodatkiem inhibitorów lub substratów promujących wzrost wybranej
grupy drobnoustrojów oraz dobór warunków hodowli.
üð hamowanie wzrostu grzybów - nystatyna
üð hamowanie wzrostu bakterii  tetracykliny, streptomycyna
üð hamowanie wzrostu bakterii Gram (+) - penicylina
üð hamowanie wzrostu bakterii Gram (-)  polimyksyna
üð wybór z
ródła węgla, azotu itp.
üð dodatek ksenobiotyków, metali ciężkich
üð NaCl 5-20%, halofile
üð PodÅ‚oże z etanolem 4%, warunku tlenowe  Acetobacter
Warunki i sposób prowadzenia hodowli:
üð temperatura: 5-200C psychofile; 20 -400C mezofile; 42-1000C termofile
üð wartość pH: 2-4 acidofile;
Hodowla ciągła  przewagę zdobywają drobnoustroje szybko rosnące. Hodowla w atmosferze
gazu obojętnego  beztlenowce.
Rozpoznanie drobnoustrojów o poszukiwanych uzdolnieniach produkcyjnych.
1. Podczas izolacji czystych kultur (skrining jednoetapowy, szybkie testy skriningowe)
2. Po izolowaniu czystych kultur
Skrinig jednoetapowy  ocena uzdolnień metabolicznych bezpośrednio na podłożu stałym, na
które wysiano próbę. Poszukiwania amylaz, lipaz, proteaz.
Amylazy  podłoże ze skrobią, dodanie płynu Lugola,
Testy na obecność lipaz  podłoże z tri glicerydem.
Testy na obecność proteaz  podłoże z kazeiną.
!!! Kryteria wyboru drobnoustrojów:
üð produkcyjność
üð brak produktów ubocznych
üð szybkość wzrostu
üð wymagania odżywcze
üð optimum temperatury
üð stabilność genotypowa i fenotypowa (mutacje spontaniczne)
üð Å‚atwość wydzielania produktu
üð niepatogenność, brak toksycznych metabolitów
6
üð odporność na infekcje
üð odporność na zmiany utlenienia, pH
üð brak pienienia, cechy reologiczne hodowli, zdolność do flokulacji komórek itp.
Ulepszanie szczepów przemysłowych
üð szczepy pozyskiwane ze Å›rodowiska tzw. szczepy dzikie lub wyjÅ›ciowe
üð aktywne mechanizmy regulacyjne
üð skoordynowany, zbilansowany metabolizm (np. enzymy indukcyjne)
üð zwiÄ™kszanie wydajnoÅ›ci procesu przemysÅ‚owego
üð izolacja najbardziej aktywnych szczepów dzikich  optymalizacja warunków hodowli
i izolacji produktów
Modyfikacja genetyczna drobnoustrojów na drodze mutagenizacji:
üð mutacja, rodzaje spontaniczna, indukowana, milczÄ…ce, mutatorowe
Czynniki wpływające na efektywność mutagenizacji:
üð komórki (pojedyncze, haploidalne, jednojÄ…drowe)
üð rodzaj, stężenie mutagenu i warunki mutagenizacji
üð faza wzrostu komórki
üð warunki hodowli i rodzaj podÅ‚oża wzrostowego
üð sprawność mechanizmów naprawy uszkodzeÅ„ DNA
Czynniki mutagenne:
üð chemiczne  MNNG, kwas azotowy, analogi zasad azotowych, barwniki akrydynowe
üð fizyczne  promieniowanie UV, X, Gamma
Promieniowanie UV  fale elektromagnetyczne ( 254-265 nm); lampy rtęciowe;
zalety (dostępność, łatwość użycia, bezpieczeństwo, brak odpadów, wysoka
częstotliwość mutacji, wywołanie mutacji w komórce wegetatywnej i spoczynkowej).
Metody selekcji mutantów:
üð mutagenizacja  proces losowy
üð analiza bardzo wielu hodowli
üð kryterium zajÅ›cia mutacji  morfologia
üð selekcja jednoetapowa (testy podczas izolacji kolonii)
üð selekcja dwuetapowa (wybrane kolonie po namnożeniu poddaje siÄ™ badaniom w
próbach fermentacyjnych)
Zalety:
üð tanie, brak wyspecjalizowanego personelu, brak wymagania specjalistycznego
sprzętu
Wady :
üð proces losowy ( nie mamy wpÅ‚ywu)
üð trzeba zbadać wiele organizmów aby uzyskać wynik
üð nie potrafimy odróżnić drobnoustrojów w których zaszÅ‚a mutacja a u których jest
ona niepotrzebna
üð niepotrzebne zmiany w genach
7
Wykład 3(07.03.2012r.)
Selekcja mutantów pokarmowych (auksotrofów):
üð hodowla na podÅ‚ożu z ograniczonym stężeniem skÅ‚adników organicznych. Hodowle
auksotrofów są mniejsze, o nietypowej morfologii
üð metoda replik
Po mutagenizacji drobnoustroje wysiewamy na podłożu bogatym. Wszystkie kolonie rosną.
Za pomocą stempla, lekko dotykając hodowli pobieramy komórki i odciskamy na kolejnym
podłożu. Wprowadzamy drugą płytkę do inkubacji.
Po inkubacji na podłożu minimalnym nie ma kolonii, która była na podłożu bogatym.
Pobieramy ją z kolejnej płytki&
Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej:
Mutanty  bardziej wydajne ale często słabszy wzrost, większe wymagania odżywcze.
Rekombinacja  proces bardziej racjonalny niż mutageneza, mniej przypadkowy, nie ma
nagromadzania się niekorzystnych zmian. Proces w wyniku, którego powstają nowe
kombinacje genów.
Procesy paraseksualne u bakterii:
1. koniugacja komórek przeciwnych typów płciowych
2. transdukcja (przenoszenie małych fragmentów DNA przed fagi)
3. transformacja (pobieranie DNA ze środowiska)
Ulepszanie szczepów przemysłowych grzybów:
üð rekombinacja genetyczna z wykorzystaniem fuzji protoplastów, stosowana przy braku
procesów płciowych i paraseksualnych
üð protoplasty  komórki caÅ‚kowicie pozbawione Å›ciany komórkowej, u organizmów
wytwarzających tą strukturę w warunkach naturalnych (bakterie, grzyby, rośliny)
üð brak Å›ciany komórkowej zwiÄ™ksza czÄ™stość Å‚Ä…czenia siÄ™ (fuzji) komórek i
prawdopodobieństwo wymiany materiału genetycznego
Elektroporacja i elektrotransformacja  rekombinacja in vitro
Wtórne z
ródła drobnoustrojów:
1. Kolekcje szczepów (banki kultur)
üð Instytuty naukowe
üð Specjalistyczne placówki
üð ZakÅ‚ady przemysÅ‚owe
üð Firmy biotechnologiczne
2. Zalety i wady wyboru wtórnego z
ródła szczepów
üð oszczÄ™dność czasu izolacji, cechy fizjologiczne, wymagania pokarmowe,
sposób przechowywania, potwierdzona cecha technologiczna
üð niska wydajność (szczep zazwyczaj ze Å›rodowiska naturalnego, dÅ‚ugie
przechowywanie w warunkach sztucznych  gromadzenie niekorzystynych
mutacji)
8
Banki kultur:
üð celem kolekcji jest zapewnienie referencyjnych szczepów bakteryjnych dla celów
badawczych, porównawczych, edukacyjnych
üð wiele z nich ma znaczenie praktyczne i jest stosowane w przemyÅ›le, biotechnologii.
Szereg szczepów wzorcowych używa się do testów jako standardy.
üð przy bardzo dużej rożnorodnoÅ›ci drobnoustrojów nie ma uniwersalnej metody
przechowywania
üð dla każdego drobnoustroju dobiera siÄ™ indywidualne warunki przechowywania i
przeszczepiania
Zadania kolekcji:
üð poszukiwanie nowych szczepów o przydatnych cechach oraz ich ulepszanie
üð klasyfikacja i identyfikacja drobnoustrojów
üð badania nad doborem skutecznych metod przechowywania drobnoustrojów
Åšwiatowa Federacja Kolekcji Kultur (WFCC)  aktualnie zarejestrowanych jest 526 kolekcji
w 67 krajach.
NRRL  Northern Regional Research Laboratory (Illinols, USA) , 78 tys. szczepów
ATCC  American Type Culture Collection (Wirginia, USA), 39 tys. szczepów
CBS -
DSMZ -
Polskie Kolekcje  w Polsce do WFCC należy 9 kolekcji.
CCBA  Kolekcja Glonów, Uniwersytet Gdański
Wrocław - Kolekcje chorobotwórcze (PCM)
A
ódz
 Politechnika A
ódzka (LOCK) drobnoustroje fermentacji mlekowej, grzyby
strzępkowe
Przechowywanie kultur przemysłowych:
üð stabilizacja cech technologicznych
üð ograniczenie do niezbÄ™dnego minimum liczby przesiewów
üð możliwie jak najdÅ‚uższe przechowywanie bez podziałów komórkowych
Wymagania spełniane przez daną metodę przechowywania kultur (!!!):
üð stabilność genetyczna, zachowanie cech technologicznych szczepu
üð wysoka przetrwalność komórek
üð ograniczenie przypadkowych zakażeÅ„
üð Å‚atwość uaktywnienia hodowli
üð tania
!!! Metody (dobierane ze względu na rodzaj kultury):
1. przechowywanie w pożywce lub na podłożu stałym, częste przeszczepianie (1 tyg,
bakterie; kilka miesięcy grzyby), duże zagrożenie zakażeniem, mutacjami
2. w stanie wysuszenia  na skosie, na perełkach szklanych, tak jak w naturze
9
3. przechowywanie s stanie zamrożenia, w płynach ochronnych (-80 0C) lub w ciekłum
azocie, żywotność do 10% (-1960C), kilka lat
4. liofilizacja  wysuszenie ze stanu zamrożenia (z dodatkiem czynników ochronnych,
żywotność do 10%)
Płyny ochronne  sacharoza; miód; odtłuszczone mleko; surowica; bulion; mannitol; glicerol
10%; DMSO 5%; zwiÄ…zki krioochronne; Asp; Glu; Pro; Gly; Wal
GMO  płyny ochronne; podłoża zawierają antybiotyki (usuwane komórki, które tracą
wprowadzony plazmid).
Wzrost i hodowla drobnoustrojów
Wzrost drobnoustrojów:
1. przyrost biomasy i objętości organizmów (cykl komórkowy)
2. wzrost populacji (zbioru organizmów w danym środowisku)
Czynniki wpływające na przebieg wzrostu
üð rodzaj drobnoustroju
üð dostÄ™pność substratów
üð tlen
üð temperatura
üð pH
üð woda, zasolenie,
üð ciÅ›nienie atmosferyczne
üð rodzaj procesu (hodowla okresowa, ciÄ…gÅ‚a, powierzchniowa)
E. coli dzieli się po 15 min; Gronkowiec złocisty po 27min; Prątek gruz
licy po 15 godz;
Bacillus mycoides po 28 min.
Cykl komórkowy  cykl od komórki macierzystej do uzyskania komórek potomnych:
1. podwojenie rozmiarów
2. podwojenie materiału genetycznego (chromosomu bakteryjnego)
3. rozdzielenie materiału genetycznego
4. wytworzenie przegrody (septum)
Bakterie  komórka macierzysta dzieli się na 2 komórki potomne.
Drożdże  (pączkujące) komórka macierzysta po wysączkowaniu komórki potomnej jest
nadal zdolna do rozmnażania.
Grzyby nitkowate (strzępkowe)  wydłużanie się strzępki szczytowej oraz strzępek bocznych.
Rodzaje hodowli:
1. hodowle na podłożu płynnym:
üð wgÅ‚Ä™bne (SF  submerged fermentation)
üð powierzchniowe w postaci kożucha, np. bakterie octowe (fermentacja wina), grzyby,
Aspergillus Niger
10
2. hodowle na podłożu stałym (SSF  solid state fermentation), np. bakterie rosnące na/w
wilgotnym ryżu wykorzystywanie do produkcji zywności tzw. orientalnej (u nas
rzadkie)
3. hodowle na podłożu stałym agarozowym
4. hodowle synchroniczne  komórki dzielą się tym samym czasie
5. hodowle komórek lub enzymów unieruchomionych (im mobilizowanych)
!!! Hodowle na podłoży płynnym:
üð kryterium: (+) Å›wieże powietrze
üð hodowla okresowa (tzw. system zamkniÄ™ty  w czasie jej trwania nie doprowadza siÄ™
świeżego podłoża wzrostowego)
üð hodowla okresowa z zasilaniem (dodawanie podÅ‚oża w okreÅ›lonych odstÄ™pach czasu)
üð hodowla półciÄ…gÅ‚a (okresowe dodawanie pożywki i odbieranie hodowli)
üð hodowla ciÄ…gÅ‚a (tzw. proces ciÄ…gÅ‚y  staÅ‚e odbieranie i dodawanie podÅ‚oża, prÄ™dkość
wzrostu komórek jest stała)
!!! Hodowle okresowe (zamknięte):
üð nie doprowadza siÄ™ nowych porcji podÅ‚oża
üð nie odprowadza siÄ™ porcjo hodowli lub koÅ„cowych produktów metabolizmu
üð objÄ™tość hodowli jest staÅ‚a
üð krzywa wzrostu zawiera 6 faz (na zaliczeniu do opisania i narysowania)
üð szybkość wzrostu jest zmienna
(rys. krzywej faz)
Fazy wzrostu drobnoustrojów w hodowli okresowej:
1. Lag faza (adaptacyjna, przygotowawcza)
2. Przyśpieszonego wzrostu
3. Logarytmicznego wzrostu
4. Zwolnienia wzrostu
5. Stacjonarna
6. Letalna (śmierci)
11
(kąt nachylenia między fazą 2 a 3 mysi być inny)
Arytmetyczny i półlogarytmetyczny wykres zależności liczby komórek od czasu:
Wykładniczy wzrost bakterii (w fazie logarytmicznego wzrostu) jest uwidoczniony w
postaci linii prostej, w której nachylenie odpowiada szybkości podziałów.
Im większe nachylenie, tym większa szybkość podziałów.
(rys.)
Charakterystyka hodowli okresowej:
1. Faza przygotowawcza, lag faza - µ=0 (µ - specyficzny współczynnik wzrostu), etap
adaptacji do nowych warunków, długość fazy zależy od stanu fizjologicznego
komórek, rodzaju podłoża i liczby wprowadzanych komórek
2. Faza logarytmicznego wzrostu µ=µ max (const) szybkość wzrostu jest staÅ‚a, zależy
od rodzaju drobnoustroju oraz warunków hodowli (rodzaju i stężenia substratu
wzrostowego, temperatury, pH)
Parametry krzywej wzrostu:
üð Czas trwania lag fazy [4/min]
üð Szybkość wzrostu w fazie logarytmicznego wzrostu [h-1] = µ
üð Parametr pomocniczy: czas podwojenia biomasy w fazie log [h]
üð Wydajność, plon, wzrost maksymalny [g/l]
!!! Hodowla ciągła (otwarta)
üð staÅ‚e odbieranie podÅ‚oża i staÅ‚e uzupeÅ‚nianie Å›wieżą porcjÄ… (obj = const)
üð szybkość wzrostu jest staÅ‚a, bo staÅ‚e sÄ… warunki Å›rodowiska
üð produkcja: biomasy, kwasów organicznych, czystych kultur (szczepów)
üð zalety : ograniczenie liczby przygotowania inokulum; zwiÄ™kszenie wydajnoÅ›ci;
mniejsza powierzchnia użytkowa zakładu
üð wady: nagromadzenie komórek zmienionych (mutacje spontaniczne, degeneracja
populacji); osadzanie się komórek na ściankach; łatwość zakażenia
Wykład 4(14.03.2012r.)
Bioreaktor (fermentor)
Urządzenie służące do hodowli drobnoustrojów, komórek roślinnych i zwierzęcych oraz
reaktory enzymatyczne.
üð szklany (skala laboratoryjna)
üð za stali kwasoodpornej, z polewanÄ… powierzchniÄ…
üð Betonowy (skala techniczna i przemysÅ‚owa)
12
Rodzaje bioreaktorów:
üð rodzaje procesów: biosynteza, fermentacja, transformacja
üð wymagania fizjologiczne komórek: procesy tlenowe, beztlenowe
üð wielkość procesu (10, 40 100 000 litrów)
üð sposób prowadzenia hodowli: do hodowli wgÅ‚Ä™bnych, w podÅ‚ożu staÅ‚ym, z
unieruchomionym materiałem biologicznym
Bioreaktory do hodowli płynnych, napowietrzanych:
üð ukÅ‚ad doprowadzajÄ…cy, rozprowadzajÄ…cy, odprowadzajÄ…cy gaz (powietrze, tlen)
üð ukÅ‚ad filtrujÄ…cy wprowadzany i odprowadzany gaz
üð rozprowadzanie gazu  mieszanie
üð Å‚amacze, piany
üð dozowniki kwasów i zasad, odpieniacza, pożywki
üð ukÅ‚ad pomiarowy tlenu, pH, temperatury
üð regulacja temperatury
üð pÅ‚aszcze chÅ‚odzÄ…cy
üð wężownica chÅ‚odzÄ…ca (wewnÄ…trz zbiornika)
Mieszanie:
üð wpÅ‚ywa na jednorodność ukÅ‚adu fizjologicznego i morfologicznego komórki
üð mechaniczne (wibracyjne, mieszadÅ‚a)
üð hydrauliczne (obieg pożywki wymuszony, przez pompÄ™)
üð pneumatyczne (obieg pożywki jako wynik ruchu gazu)
(rysunek bioreaktora do hodowli płynnych)
13
Bioreaktory do prowadzenia hodowli w stałym złożu (SSF)
1. Komora inkubacyjna z tacami.
Tace z zaszczepionym powietrzem w termostatywnej komorze z wentylacją, grubość
warstwy pożywki na tacy to ok. 5 cm co ogranicza przegrzanie hodowli
2. Hodowla w grubej warstwie.
Warstwa stałego podłoża o grubości 1 cm, podłoże na ruszcie, w termostatywnej
komorze. Powietrze doprowadzane przez ruszt, podłoże jest wstrząsane lub mieszane
specjalnym urzÄ…dzeniem.
3. Bioreaktor bębnowy do hodowli w podłożu stałym.
Ruch obrotowy bębna  przesypywanie się pożywki przeciwdziała przegrzewaniu
spienionej warstwy.
Unieruchamianie (immobilizacja)
üð wiÄ™kszość drobnoustrojów żyje w warunkach naturalnych w postaci unieruchomionej
(biofilmy)
Materiał biologiczny: komórki, enzymy
üð sorpcja fizyczna na powierzchni: szkÅ‚o porowate, wÄ™giel drzewny, wióry, pianki,
gÄ…bki
üð zamykanie wewnÄ…trz żeli naturalnych (alginian, agar) lub syntetycznych (żel
poliakrylamidowy)
üð zamykanie wewnÄ…trz półprzepuszczalnych membran (z octanu celulozy)
Zalety: łatwość oddzielenia od płynów, możliwość wielokrotnego użycia biomasy.
Wady: utrudniona wymiana masy i energii.
!!! Bioproces - fermentacja
üð bioprocesy  procesy biotechnologiczne, procesy w których używane sÄ… komórki, ich
części (np. chloroplasty) lub ich metabolity (np. enzymy).
üð cele:
·ð synteza biomasy (produkcja drożdży piekarniczych)
·ð produkcja wybranego metabolitu (zew.- lub wewnÄ…trzkomórkowego, np.
kwasy, enzymy, gazy  metan, antybiotyki, toksyny)
·ð przeksztaÅ‚canie zwiÄ…zków (transformacje)  niewielkie zmiany w czÄ…steczce,
produktach
Przebieg procesu technologicznego jest opisywany wzorami matematycznymi (inżynieria
bioprocesowa).
Etapy
üð przygotowanie procesu
üð prowadzenie procesu głównego (np. fermentacja)
üð wydzielanie (izolacja produktu)
14
Inny podział:
1. przygotowanie fermentora
2. kontrola osprzętu
3. przygotowanie podłoża wzrostowego i inokulum, odpieniaczy
4. sterylizacja fermentora i podłoża
5. kalibracja układów
6. przygotowanie kultury startowej
7. zaszczepienie (wprowadzenie kultury startowej, inokulum)
8. fermentacja  kontrola parametrów napowietrzania, mieszania, temperatury, pH,
pobieranie i analizowanie prób
9. zakończenie procesu
10. wydzielanie i oczyszczanie produktu
11. unieszkodliwienie lub zagospodarowanie produktów ubocznych lub odpadowych
Wydzielenie, oczyszczanie, konfekcjonowanie
üð produkt bioprocesu - jogurt, kefir (gotowy produkt), biomasa (np. drożdże
piekarnicze), piwo (gotowe produkty)
üð wiÄ™kszość bioprocesów  produkt wymaga wydzielenia z pÅ‚ynu lub z biomasy,
zatężenie i oczyszczenia; wydzielanie i oczyszczanie (ang. down stream procesing)
!!! Oddzielenie biomasy od płynu pokarmowego
üð flokulacja i sedymentacja  Å‚Ä…czenie siÄ™ komórek w aglomeraty i opadanie, czÄ™sto
wymagany jest dodatek elektrolitów (np. piwo)
üð filtracja  oddzielenie biomasy w wyniku przepÅ‚ywu przez przegrodÄ™. Wielkość
komórek, agregaty grzybki, metody tańsze w porównaniu z wirowaniem
nadawa (surowiec wprowadzany do urządzenia w celu przeróbki), pemeat (filtrat)
üð wirowanie (próżniowy filtr bÄ™bnowy)
Produkt w komórce  dezintegracja komórki.
Komórki zwierzęce  brak ściany komórkowej, tanie metody mechaniczne, homogenizacja,
młynki.
Komórki bakterii, grzybów, roślin  wysoki nakład energii.
Metody
üð metody mechaniczne  mÅ‚yny, ultradz
więki, dekompresja, ucieranie
üð metody chemiczne  kwasy, zasady, detergenty, antybiotyki
üð metody enzymatyczne  protoplasty, sferoplasty, szok osmotyczny
üð metody biologiczne  fagi
Wydzielanie, zagęszczanie i oczyszczanie produktu z roztworu wodnego:
üð zagÄ™szczanie termiczne
üð ekstrakcja
üð ultrafiltracja
üð precypitacja/ dializa
15
üð destylacja
üð odparowanie próżniowe
üð krystalizacja
üð chromatografia
üð elektroforeza
Utrwalenie bioproduktów:
üð termiczne, chemiczne  zawartość wody (8-10%), usuwanie wody (filtracja,
wirowanie, strÄ…canie)
üð standaryzacja cech użytkowych bioproduktu  okreÅ›lenie aktywnoÅ›ci, trwaÅ‚oÅ›ci,
czystości, masy i innych niezbędnych cech użytkowych produktu
Powiększanie skali procesu
üð skala laboratoryjna  skala przemysÅ‚owa
üð proces musi być szybki, tani, wydajny
Problemy
üð zmiana ksztaÅ‚tu, wielkoÅ›ci urzÄ…dzeÅ„
üð napowietrzanie, mieszanie, transport ciepÅ‚a
üð wprowadzanie inokulum (fermentator pomocniczy), sterylizacja, wydzielanie
produktu, nabijanie komórek
Biotechnologia środowiskowa
Kierunki działań:
1. rozkład zanieczyszczeń (związków) przez drobnoustroje i usuwanie (wiązanie) jonów
metali ciężkich:
üð oczyszczanie Å›cieków
üð bioremechnizacja gleby
üð oczyszczanie gazów
2. drobnoustroje jako wskaz
niki w badaniach przydatności związków na rozkład
mikrobiologiczny, test aminokwasów toksykologicznych, testy mutagenności
3. mikrobiologiczne insektycydy
4. zagospodarowanie odpadów (kompost, podłoża mikrobiologiczne, SCP/SCB,
wysypiska śmieci)
zanieczyszczenie środowiska naturalnego jest wynikiem wzrostu populacji ludzkiej, rozwoju
przemysłu oraz braku wiedzy.
DDT  taki był początek badań nad podatnością związków na rozkład mikrobiologiczny
Dichlorodifenylotrichloroetan
üð masowe użycie od 1945r., od lat 70tych XXw. wycofany, w krajach trzeciego Å›wiata
nadal używany do walki z malarią
üð nazwa handlowa w Polsce  AZOTOX jako Å›rodek owadobójczy
16
DDT jest 100mln x mniej rozpuszczalny w wodzie w porównaniu z glukozą, u zwierząt
kumuluje się w tkance tłuszczowej (prawie doprowadził do wyginięcia orłów, ponieważ
samice zgniatały jaja swoim ciężarem, jaja miały bardzo słabą skorupkę).
Ksenobiotyki  niska podatność na rozkład
üð substancje chemiczne obce dla danego organizmu
üð zwiÄ…zki, które zostaÅ‚y wytworzone stosunkowo niedawno przez czÅ‚owieka i wiÄ™kszość
drobnoustrojów nie posiada odpowiednich enzymów, które mogłyby je przekształcić
üð sÄ… to substancje chemiczne i mutagenne dla drobnoustrojów
üð niska rozpuszczalność w wodzie
Rozkład/ ko metabolizm
üð zwiÄ…zki chemiczne:
·ð rozkÅ‚ad caÅ‚kowity  mineralizacja  CO2, H2O, energia (bakterie)
·ð ko metabolizm  zwiÄ…zki toksyczne rozkÅ‚adane tylko w obecnoÅ›ci Å‚atwo
metabolizowanych z
ródeł węgla (np. glukozy)  grzyby
·ð detoksykacja  rozkÅ‚ad (do mniej toksycznych pochodnych)
·ð biotransformacja - przeksztaÅ‚canie zwiÄ…zków, produkt nie wchodzi w procesy
kataboliczne ani anaboliczne
üð metale ciężkie  sorpcja przez biomasÄ™ (nie sÄ… rozpuszczalne ani rozkladane)
Rodzaje zanieczyszczeń:
1. Pochodzenie
üð naturalne (produkowane przez organizmy)
üð ksenobiotyki (produkowane przez przemysÅ‚ chemiczny)
üð ropa naftowa i metale ciężkie (wydobywane z ziemi)
2. Budowa chemiczna
üð WWA  wielopierÅ›cieniowe wÄ™glowodory aromatyczne
üð chlorofenole
üð nitrozwiÄ…zki
üð zwiÄ…zki metaloorganiczne
3. Zastosowanie
üð pestycydy
üð biocydy
üð dodatki do tworzyw sztucznych
4. Działanie wobec ludzi
üð toksyny, mutageny, modulatory hormonalne (EDCS)
Pestycydy  większość pestycydów chemicznych to ksenobiotyki; pest  szkodnik; są to
substancje chemiczne oraz żywe organizmy stosowane w celu unieszkodliwienia szkodników,
owadów (insektycydy), chwastów.
Biocydy  grupa substancji chemicznych stosowanych do niszczenia szkodników, należą do
pestycydów, nie każdy pestycyd jest biocydem (np. grzyby niszczące owady).
17
Związki ropopochodne  związki wchodzące w skład ropy naftowej oraz powstające w
wyniku ich częściowej degradacji lub modyfikacji., np. WWA, metale ciężkie.
WWA  naftalen, antracen, fluoren, piren.
Wraz z liczną pierścieni rośnie hydrofobowość, mutagenność, odporność na rozkład,
toksyczność.
(wzory związków)
Główne z
ródła WWA
1. z
ródła naturalne  wynikające z aktywności środowiska
üð naturalne wycieki ropy naftowej
üð wybuch wulkanów
üð pożary lasów
2. z
ródła antropogeniczne  wynikające z aktywności człowieka
üð przemysÅ‚ chemiczny, petrochemiczny
üð katastrofy tankowców
üð spalanie paliw
!!! Czynniki sprzyjające biodegradacji WWA (oraz większości innych zanieczyszczeń)
üð dostÄ™pność tlenu
üð optymalne dla wzrostu organizmów pH, temperatura
üð dostÄ™pność pierwiastków biogennych (S, N, P), skÅ‚adników odżywczych (grzyby, ko
metabolizm)
üð aktywność enzymów degradacyjnych
üð różnorodność drobnoustrojów
üð biosurfaktanty  biologiczne zwiÄ…zki powierzchniowo czynne
Wykład 5(21.03.2012r.)
Wybrane organizmy przekształcające WWA
üð bakterie
·ð Pseudomonas sp.
üð grzyby
·ð Cunninghamella elegant
·ð Penicillium chrysogenum
·ð Ligninolityczne
18
üð glony
·ð Oscillatoria sp.
·ð Chlorella autotrophica
Rozkład benzenu (WWA) przez bakterie.
Enzym  dioksygenaza (wprowadza tlen w jeden pierścień), pozwala rozbić pierścień, a
produkty pośrednie kierowane do cyklu Krebsa, zachodzi całkowita mineralizacja
zanieczyszczeń.
Rozkład benzenu (WWA) przez grzyby.
Monooksygenazy (cyt P450), epoksyol.
Ludzie też posiadają cyt P450 w wątrobie i podobnie metabolizują WWA (np. z grillowanej
kiełbasy). Część pochodnych jest sprzęgana z siarczanami i glukozą. Produkty są mniej
toksyczne i bardziej hydrofilowe (bardziej rozpuszczalne w wodzie). Pochodne takie sÄ… u
człowieka wydalane z moczem lub odkładane w tkance tłuszczowej a w środowisku
rozkładane całkowicie już przy udziale bakterii.
Chlorofenole  ksenobiotyki.
üð np. pentachlorofenol (PCP)
üð bardzo trwaÅ‚e, obecność chloru hamuje dziaÅ‚anie wiÄ™kszoÅ›ci monooksygenaz i
diooksygenaz
üð wiÄ™kszość bardzo toksyczna, mutagenna i zakłócajÄ…ca dziaÅ‚anie ukÅ‚adu hormonalnego
(EDCs  modulatory hormonalne)
üð rozkÅ‚ad chlorofenoli w warunkach tlenowych jest szybszy ale wystepuje tylko u
niewielu drobnoustrojów Norcadia, Pseudomonas, Bacillus, Mycobacterium,
Alcaligenes
üð ko metabolizm  grzyby np. Mucor
Modulatory hormonalne.
EDCs (Endocrine disrupting compounds)
Zmieniają strukturę lub funkcję układu wydzielania wewnętrznego.
Mechanizm działania: wiązanie się z receptorami hormonów w tkankach (komórkach)
docelowych i działanie w podobny sposób jak hormony naturalne; blokowanie działania
hormonów.
Ponad 500 związków należących do EDCs:
üð dioksyny
üð produkty degradacji fitosteroli
üð pestycydy chloro organiczne (DDT, PCP)
üð polichlorowane bifenyle (PCB)
üð metale ciężkie (Pb, Ni, Hg, Cd)
üð ksenoestrogeny (bifenol A)
üð zwiÄ…zki metaloorganiczne (TBT)
üð syntetyczne estrogeny (hormonalne leki antykoncepcyjne)
19
Niektóre WWA mogą oddziaływać jak EDCs.
TBT  Tributylocyna, organiczny zwiÄ…zek cyny.
TBT jest składnikiem farb przeciwporostowych (powoli przedostawał się do wód morskich na
całym świecie). Komponent preparatów do konserwacji kamieni, papieru, tkanin i skóry.
Inhibitor aromatazy zależnej od cyt P450.
Małże  mężnieją  małże przestały się rozmnażać, samice miały męskie cechy płciowe
(Imposex). Blokada procesu przekształcania testosteronu do estradiolu.
Przepisy prawne  1.01.2003r. Zakaz pokrywania kadłubów.
Estrogeny i ksenoestrogeny.
Ścieki z zakładów celulozowych (Kanada) zawierały produkty degradacji fitosteroli 
roślinnych związków steroidowych o budowie zbliżonej do hormonów płciowych
(androgenów i estrogenów).
Skutek  opóz
nienie dojrzewania płciowego ryb, ograniczony wzrost gonad i zmany
zawartości hormonów płciowych.
Badania na płociach pochodzących z 10 rzek w Wielkiej Brytanii.
Samce wykazywały cechy obojnacze (Intersex), niepełnowartościowe nasienie, bezpłodność.
Powód to obecność w wodzie syntetycznych estrogenów  środki antykoncepcyjne i leki
podawane podczas menopauzy oraz ksenoestrogenów (związki syntetyczne o odmiennej
budowie niż estrogeny ale działają jak estrogeny), np. bisfenol A (stosowany przy produkcji
tworzyw  np. butelek dla niemowlÄ…t).
Obecne kierunki działań:
üð opracowanie czuÅ‚ych metod wykrywania EDCs
üð HPLC/MS, GC/MS organizmy wskaz
nikowe
üð konieczność monitorowania zawartoÅ›ci EDCs w wodzie oraz przed i po oczyszczaniu
ścieków
üð skuteczna eliminacja metodami fizycznymi EDCs zawartych w wodzie (wÄ™giel
aktywny, nanofiltracja, ozonowanie)
üð opracowanie zestawu szczepów drobnoustrojów zdolnych do aktywnej degradacji
EDCs w ściekach
Mikrobiologiczne testy w ochronie środowiska:
Testy pozwalają ustalić:
üð podatność zwiÄ…zków na rozkÅ‚ad biologiczny (biodegradacjÄ™)
üð toksyczność zwiÄ…zków
üð mutagenność zwiÄ…zków
üð sprawdzenie czy nie sÄ… EDCs ami
Zastosowanie
üð badanie nowych zwiÄ…zków przed ich wprowadzeniem do handlu
üð ocena aktualnego Å›rodowiska  biomonitoring
20
Toksyny mi mutageny.
Toksyny  działają niekorzystnie. Związki mogą być nietoksyczne, słabo toksyczne,
średniotoksyczne, mocno toksyczne  wiele klas toksyczności.
Mutageny  powodują mutację, zmiany w materiale genetycznym. Związki mogą być
mutagenne lub nie mutagenne.
!!!Żaden test nie ma 100% wykrywalności. Konieczność stosowania różnych testów, różnych
organizmów testowych.
Mikrotox  test toksyczności z wykorzystaniem:
üð bakterii Vibrio fischeri
üð gram (-) przecinkowiec, wystÄ™pujÄ…cy w morzach
üð wytwarza enzym lucyferazÄ™, katalizujÄ…cy reakcjÄ™, której towarzyszy wydzielanie
światła
bakterie rosnąć w warunkach optymalnych (w nieobecności toksyn) przetwarzają ok. 10%
energii metabolicznej na wytwarzanie światła.
Zasada testu: w obecności toksyn metabolizm bakterii ulega ograniczeniu.
Mutatox  test mutagenności z wykorzystaniem  ciemnego mutanta Vibrio fischeri.
üð  ciemny mutant vibrio fischeri posiada zablokowany gen lucyferazy
üð mutant rosnÄ…cy w warunkach optymalnych nie Å›wieci
üð jeÅ›li zwiÄ…zek jest mutagenem to powoduje różne, liczne mutacje, także takie które
odblokowujÄ… gen lucyferazy
Wynik: bakteria rośnie w obecności mutagenu i zaczyna świecić.
Sprzęt taki jak w mikrotox.
Oczyszczanie ścieków
Ścieki  woda, która w wyniku użycia uległa takim zmianom fizycznym, chemicznym,
biologicznym, że nie jest już możliwe wykorzystanie jej do tego samego celu.
1. XIX/XX w  pierwsze oczyszczalnie ścieków.
2. Rozkład do związków prostych, łatwo przyswajalnych przez organizmy, zachodzi
głównie przy udziale drobnoustrojów.
3. W biodegradacji biorą udział mieszane populacje mikroorganizmów.
4. Drobnoustroje wykorzystujÄ… odpady jako substancje pokarmowe.
5. Istota biodegradacji zanieczyszczeń.
Rodzaje ścieków i ich pochodzenie:
üð Å›cieki bytowe  gospodarstwa domowe, obiekty użytecznoÅ›ci publicznej
üð Å›cieki opadowe  opady atmosferyczne, Å›nieg, polewanie ulic
üð Å›cieki przemysÅ‚owe  procesy produkcyjne
üð Å›cieki komunalne - mieszanina Å›cieków bytowych, opadowych i niektórych
przemysłowych
21
Åšcieki zawierajÄ…:
üð ciaÅ‚a staÅ‚e
üð zwiÄ…zki nieorganiczne (siarczany, chlorki)
üð zwiÄ…zki organiczne pochodzenia naturalnego
üð zwiÄ…zki organiczne o charakterze ksenobiotyków
üð metale ciężkie
üð drobnoustroje chorobotwórcze
Możliwe zmienione pH, temperatura. Tłuszcze i oleje  izolacja powierzchni wody.
Metody naturalne:
üð oczyszczanie gruntowe
üð najstarszy sposób utylizacji Å›cieków
üð ograniczenia
·ð wysokie koszty transportu
·ð obecność substancji toksycznych
·ð drobnoustroje chorobotwórcze
·ð sezonowość oczyszczania
·ð wykorzystanie dużych powierzchni terenów
üð stawy Å›ciekowe
·ð tlenowe pÅ‚ytkie zbiorniki do 15m, warunki tlenowe
·ð beztlenowe do Å›cieków bardzo stężonych, o dużej zawartoÅ›ci zawiesin
üð stawy rybne
Wskaz
niki zanieczyszczeń ścieków:
Pozwalają ocenić możliwości oczyszczenia ścieków.
üð pH (optymalne 6,5  8)
üð temperatura
üð ilość zawiesin Å‚atwo opadajÄ…cych
üð ilość substancji organicznych
·ð BZT  biochemiczne zapotrzebowanie tlenu
·ð ChZT  chemiczne zapotrzebowanie tlenu
·ð OWO  ogólny wÄ™giel organiczny
üð ilość pierwiastków biogennych (P, N)
üð zwiÄ…zki toksyczne np. metale ciężkie, pestycydy
üð wskaz
niki higieniczne (drobnoustroje chorobotwórcze  bakterie gr. coli)
!!!Oczyszczanie ścieków - kolejność stosowania metod. (rys.)
22
Metody biologiczne.
Drugi/ trzeci stopień oczyszczania.
üð odzwierciedlenie procesów przebiegajÄ…cych w warunkach naturalnych, intensyfikacja
procesów naturalnego samooczyszczenia
üð sztuczne  w urzÄ…dzeniach specjalnie w tym celu zbudowanych z unieruchomionÄ…
biomasą, mogą być tlenowe lub beztlenowe
Metoda z unieruchomionÄ… biomasÄ….
üð sztuczne zÅ‚oże biologiczne (zraszanie)
üð warstwa gruzu, tworzywa sztucznego uÅ‚ożona na ruszcie
üð zÅ‚oże jest od góry zraszane Å›ciekami, a od doÅ‚u napowietrzane
üð drobnoustroje rozwijajÄ… siÄ™ w postaci bÅ‚ony biologicznej (biofilmu)
üð drobnoustroje utleniajÄ… i mineralizujÄ… zwiÄ…zki organiczne podczas przepÅ‚ywu Å›cieków
przez złoże
Błona biologiczna  bakterie, orzęski, organizmy typowe dla osadu czynnego (skład
uboższy).
Metoda osadu czynnego
Zanieczyszczenia są absorbowane na powierzchni kłaczków i wykorzystywane przez
drobnoustroje do budowy masy komórkowej i podtrzymywania aktywności metabolicznej.
KÅ‚aczki osadu czynnego
Istotna rolę odgrywają bakterie wydzielające zewnątrzkomórkowe polimery, które stanowią
matrycę ułatwiająca formowanie kłaczków drobnoustrojów.
Składniki: bakterie, grzyby, pierwotniaki, inne organizmy.
W kształtowaniu kłaczków o znacznych rozmiarach mają znaczenie bakterie nitkowate.
Bakterie stanowią pokarm dla pierwotniaków co przyczynia się od ciągłego odnawiania
(odmładzania) populacji bakterii, które są ciągle w logarytmicznej fazie wzrostu. Pierwotniaki
stanowią pokarm dla Wrotków. Zapewnienie ciągłego dostarczania tlenu- pompowanie
powietrza oraz intensywne mieszanie- zapewnia warunki tlenowe, co warunkuje szybkie
tempo metaboliczne, redukuje przykry zapach (brak procesów beztlenowych- gnilnych).
Osad czynny  dalsze losy.
Osadnik wtórny (oddzielenie osadu)
üð część zwracana do komory osadu czynnego (osad recyrkulowany)
üð część usuwana jako osad nadmierny, dalsza przeróbka
·ð metody biologiczne (kompostowanie, fermentacja)
·ð metody chemiczne (wapniowanie)
Beztlenowe oczyszczanie ścieków.
Rozkład związków organicznych bez udziału tlenu z wykorzystaniem biogazu (metan i
dwutlenek węgla). Rożne grupy drobnoustrojów ściśle współdziałające i zależne od siebie.
Udział metanogenów (drobnoustroje prokariotyczne z domeny Archea).
Proces kilkuetapowy:
üð polimery (hydroliza)
23
üð monomery (fermentacja = kwasogeneza)
üð kwasy organiczne, alkohole, CO2, H 2, (octanogeneza, metageneza)
üð 4 H2 + CO 2 -> CH 4 + 2 H 2O; CH3COOH -> CH4 + CO2
Czas trwania  do 40 dni; otrzymanie pH 6,5  7,5; temperatura 200C; brak toksyn.
Bardziej ekonomiczne niż metody tlenowe dla ścieków o wysokiej zawartości związków
organicznych i substancji stałych (do 15%).
Osady i opady ściekowe, ścieki z hodowli zwierząt (gnojowica), ścieki pochodzące z
cukrowni, krochmalni, drożdżowni.
Wykład 6(28.03.2012r.)
Biogaz
üð SkÅ‚ad: metan (70%), CO2 (30%), Å›lady H2, H2S
üð ilość metanu (wartość energetyczna biogazu) zależy od rodzaju utylizowanych
związków
Zagospodarowanie:
üð produkcja ciepÅ‚a (ogrzewanie pomieszczeÅ„, komór fermentacyjnych)
üð produkcja energii elektrycznej
Bioremediacja gleby
üð Bioremediacja - eliminacja lub istotne ograniczenie niekorzystnego dziaÅ‚ania
związków chemicznych i metali ciężkich, przy wykorzystaniu zdolności organizmów
(głównie drobnoustrojów i roślin)
üð Grunty o podwyższonej zawartoÅ›ci zanieczyszczeÅ„ -rafinerie, stacje benzynowe,
warsztaty samochodowe, magazyny paliw, rurociągi przesyłowe, lotniska, bazy
wojskowe i poligony, huty, kopalnie
üð Przyczyny skażenia gleby - niekontrolowane wycieki (korozja, przeÅ‚adunek), DziaÅ‚ania
wojenne, Ćwiczenia wojskowe, Katastrofy drogowe, kolejowe, tankowców,
Eksploatacja kopalń, składowiska odpadów
!!!Czynniki wpływające na szybkość i efektywność bioremediacji gleby:
1. Charakter skażenia
üð struktura chemiczna zwiÄ…zków
üð toksyczność
üð hydrofobowość
üð stężenie
üð różnorodność
üð przestrzenne rozmieszczenie
üð zdolność do wiÄ…zania siÄ™ ze skÅ‚adnikami gleby
üð czas przebywania w gruncie
2. Rodzaj gleby
3. Czynniki biologiczne (rośliny, drobnoustroje)
24
Czynniki wpływające na bioremediację  gleba
Gleba - środowisko złożone. Skład: cząstki stałe, powietrze glebowe, roztwór glebowy,
organizmy.Gleby różnią się składem chemicznym i strukturą. Zanieczyszczenia:
üð silnie wiążą siÄ™ z glinÄ…, humusem
üð tworzÄ… warstwy (filmy) na hydrofobowych powierzchniach czÄ…stek gleby
üð wnikajÄ… do wewnÄ™trznych przestrzeni w czÄ…stkach gruntu
üð ulegajÄ… wytrÄ…ceniu
üð tworzÄ… krople (zwiÄ…zki oleiste)
!!!Biologiczne czynniki wpływające na bioremediację
üð warstwy powierzchniowe zawierajÄ… wiÄ™cej zwiÄ…zków organicznych, wiÄ™ksza
dostępność tlenu, duża zawartość bakterii tlenowych, promieniowców, grzybów.
Jednostki koloniotwórcze:
üð bakterie 107 - 108/ 1g gleby, Grzyby 104  105/ 1g gleby
üð drobnoustroje zdolne do rozkÅ‚adu lub przeksztaÅ‚cania zanieczyszczeÅ„ to nieliczna
grupa mikroflory glebowej 0,01-1%
üð bakterie Pseudomonas, Micrococcus, Alcaligenes, Vibrio, Acinetobacter,
Mycobacterium, Bacillus, promieniowce (Actinomyces, Nocardia, Streptomyces)
üð grzyby mikroskopowe strzÄ™pkowe(Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Mucor,
Rhizopus, Geotrichum), Drożdże (Candida, Saccharomyces), grzyby ligninolityczne
üð glony Oscillatoria, Scenedesmus
!!!Metody bioremediacji:
üð uprawa gleby (ang. land farming), metoda in situ
üð pozwala usuwać ksenobiotyki zalegajÄ…ce do 50 cm w gÅ‚Ä…b gruntu
üð typowe zabiegi rolnicze: oranie, bronowanie, zraszanie. Konieczny staÅ‚y monitoring
np. brak wody zatrzymuje procesy życiowe organizmów, nadmiar wody prowadzi
do powstania warunków beztlenowych
Biostymulacja
üð odmiana metody  land farming
üð stymulacja wzrostu drobnoustrojów przez
wprowadzanie składników odżywczych
üð cel  pobudzenie procesów kometabolizmu grzybów
Metody i procesy bioremediacji:
Wstępne zabiegi fizyko-chemiczne
üð (bio)wentylacja +/- (przedmuchiwanie gleby gorÄ…cym powietrzem). Polega na
wprowadzaniu powietrza do oczyszczanego gruntu i usuwaniu ksenobiotyków w
wyniku odparowania. Zastosowanie  zanieczyszczenia lotne
üð przepÅ‚ukiwanie gleby (rozpuszczalniki, surfaktanty, biosurfaktanty, roztwory kwasów)
üð wstÄ™pne utlenianie
25
Wstepne utlenianie
üð ozonowanie - Metoda szybka
üð utlenione pochodne zwykle sÄ… bardziej rozpuszczalne w wodzie
üð ozonowanie jest agresywne dla Å›rodowiska (obniża liczbÄ™ drobnoustrojów w glebie)
üð czasami powstajÄ… bardziej toksyczne pochodne
üð fotochemiczne utlenianie
üð ekspozycja ksenobiotyków na Å›wiatÅ‚o sÅ‚oneczne
üð metoda tania, przyjazna dla Å›rodowiska
Typowe zabiegi rolnicze  oranie i bronowanie.
Bioaugmentacja  zaszczepianie
üð metoda in situ lub ex situ
üð dodanie drobnoustrojów do gleby
üð gleba o niskiej zawartoÅ›ci mikroflory
üð szczepionki (biopreparaty): Pojedynczy szczep lub mieszane hodowle, Bakterie i
grzyby, Drobnoustroje autochtoniczne lub szczepy patentowe
üð szczepionki pÅ‚ynne, staÅ‚e (immobilizowane)
üð podawanie szczepionki: wpompowanie, wymieszanie z glebÄ…
!!!Wykorzystanie odpadów przemysłu rolno-spożywczego do produkcji biomasy
drobnoustrojów i otrzymywania cennych metabolitów:
Przemysł rolno-spożywczy: odpady zawierają związki organiczne pochodzenia naturalnego
üð mleczarstwo, browarnictwo, winiarstwo, gorzelnictwo, przemysÅ‚ cukrowniczy,
Odpady to 40-90%
üð najczęściej przetwarzane odpady:
·ð Melasa (przemysÅ‚ cukrowniczy)
·ð Serwatka (mleczarstwo)
·ð odpady po produkcji napojów alkoholowych
üð gorzelnictwo: drożdże odpadowe, pozostaÅ‚oÅ›ci ziemniaków lub zbóż, wywar
gorzelniczy
üð winiarstwo: drożdże odpadowe i wytÅ‚oki owocowe (pozostaÅ‚oÅ›ci owoców)
üð browarnictwo: drożdże odpadowe i młóto (wysÅ‚odziny) czyli pozostaÅ‚oÅ›ci z
jęczmienia
Odpady z przemysłu rolno-spożywczego - kierunki zagospodarowania
Produkcja:
üð kompostu
üð biomasy ( lub biaÅ‚ka) drobnoustrojów (SCP/SCB)
üð probiotyków
üð napojów fermentowanych
üð wielocukrów
üð kwasów organicznych
üð etanolu
26
!!!Produkcja biomasy ( lub białka) drobnoustrojów (SCP/SCB)
üð SCP  single cell protein  jeżeli z biomasy drobnoustrojów izolowane jest biaÅ‚ko,
(jako dodatek do żywności ludzi, mała akceptacja, nieekonomiczne) ale metody są
opracowane
üð SCB  single cell biomass  jeżeli produktem handlowym, a tym samym z
ródłem
białka jest biomasa (całe komórki drobnoustrojów), powszechnie stosowanie jako
pasze
Problem kwasów nukleinowych
üð bakterie rosnÄ… szybciej niż drożdże, majÄ… wyższÄ… zawartość biaÅ‚ka ale majÄ… wyższÄ…
zawartość kwasów nukleinowych  bardzo szkodliwych w pożywieniu
üð wydzielanie biaÅ‚ek z komórek wymaga dezintegracji Å›cian komórkowych (procesy
bardzo drogie -zniszczenie ścian kom.  do 80% kosztów produkcji).
üð dlatego najczęściej hodowane sÄ… drożdże i to jako caÅ‚e komórki czyli SCB. Po
hodowli suszone i dodawane do pasz
!!!Drobnoustroje wykorzystywane do produkcji SCP lub SCB
üð Bakterie  Bacillus, Methylomonas - najszybszy wzrost, najmniejsze wymagania
odżywcze
üð Drożdże  Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Saccharomyces, Pichia, Hansenula -
niska zawartość AA-SH ale wysoka lizyny (AA egzogenny)
üð Grzyby strzÄ™pkowe  Trichoderma, Paecilomyces
üð Glony  Chlorella, Scenedesmus, Spirulina
Działanie probiotyków
üð wspomaganie wzrostu pożądanej mikroflory
üð stymulacja ukÅ‚adu immunologicznego
üð hamowanie rozwoju drobnoustrojów patogennych i produkcja substancji
antybakteryjnych
Zastosowanie probiotyków
üð leczenie biegunki infekcyjnej, poantybiotykowej
üð zapobieganie alergii pokarmowej
üð nieswoiste zapalenia jelit, Zespół drażliwego jelita
üð nietolerancja laktozy
üð stosowanie probiotyków może być metodÄ… uzupeÅ‚niajÄ…cÄ… antybiotykoterapiÄ™
Wykład 7(04.04.2012r.)
Wykorzystanie drobnoustrojów w różnych gałęziach przemysłu
!!!Praktyczne wykorzystanie drobnoustrojów: podział ze względu na pochodzenie
produktu
1. całe komórki
üð drożdże piekarskie i paszowe
üð SCP (single cell protein) SCB (single cell biomass)
üð probiotyki
27
2. produkty końcowe przemian katabolicznych
üð etanol,
üð kwas mlekowy
üð aceton
üð butanol
3. fermentowane produkty spożywcze
üð jogurt, kefir,
üð kiszone warzywa
üð piwo, wino
4. produkty syntez podstawowych
üð zwiÄ…zki niskoczÄ…steczkowe (kwasy organiczne, AA, witaminy)
üð zwiÄ…zki wysokoczÄ…steczkowe (enzymy, wielocukry)
5. produkty syntez peryferyjnych
üð antybiotyki, alkaloidy, gibereliny
6. produkty transformacji
üð leki steroidowe np. hydrokortyzon
7. produkty obce dla mikroorganizmu
üð syntezowane przez szczepy ze zrekombinowanym DNA
üð insulina, hormon wzrostu, interferony
!!!Wykorzystanie drobnoustrojów w różnych dziedzinach przemysłu
üð spożywczy
üð farmaceutyczny
üð chemiczny aceton, butanol, izopropanol
üð kosmetyczny: enzymy
üð garbarstwo: enzymy proteolityczne
üð ochrona Å›rodowiska naturalnego
üð interdyscyplinarne produkcja tworzyw sztucznych: kwas PHB
(polihydroksymasłowy), enzymy
ANTYBIOTYKI
Fleming - 1928r. (penicylina).
1942  początek ERY ANTYBIOTYKÓW, masowa produkcja
Handlowo i klinicznie najważniejsza grupa biotechnologicznych farmaceutyków.
Niskocząsteczkowe związki organiczne bardzo zróżnicowanej budowie.Zazwyczaj
metabolity wtórne produkowane przez różne organizmy (głównie drobnoustroje).
Działające wybiórczo, w bardzo małych stężeniach, hamująco (statycznie) lub bójczo na
komórki innych organizmów.
Antybiotyki  podział
1. mechanizm działania
InterferujÄ…ce z biosyntezÄ… peptydoglikanu - Penicyliny i cefalosporyny, bezpieczne dla
Eukariota .Działające na błonę komórkową  antybiotyki hamujące replikację DNA,
28
transkrypcjÄ™, translacjÄ™
2. kierunek działania: przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze&
3. budowa chemiczna: bð-laktamowe, polipeptydowe, makrolidowe,
aminoglikozydowe&
4. sposób otrzymania: naturalne, półsyntetyczne (modyfikowane), syntetyczne np.
chloramfenikol (S. venezuelae)
5. przydatność kliniczna wąskie, szerokie spektrum działania, podstawowe  stosowane
w 1 kolejności
6. pochodzenie
üð bakteryjne: Bacillus, Pseudomonas, Lactococcus 9%, Actinomycetales
(promieniowce) 60%
üð grzybowe 18% Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cephalosporium
Wykład 8(11.04.2012r.)
BIOTECHNOLOGIA ROÅšLIN
Biotechnologia:
üð zintegrowana dziedzina nauk przyrodniczych i technicznych, praktyczne
wykorzystanie w procesach biologicznych
üð wiedza z zakresu biochemii, mikrobiologii, nauk inżynieryjnych w celu wykorzystania
zdolności drobnoustrojów, roślin, zwierząt, kultur tkankowych czy komórkowych do
wytworzenia lub modyfikacji produktów lub procesów z określonym zastosowaniem
üð zmierza do uzyskania użytecznych organizmów lub ich produktów (otrzymywanie
nowych kombinacji cech lub nowych cech) np. hodowla nowych odmian roślin i
zwierzÄ…t hodowlanych droga sztucznego doboru.
29
Biotechnologia tradycyjna:
Od tysięcy lat wykorzystuje sie naturalne organizmy i produkowane przez nie
enzymy/substancje:
üð produkcja piwa, wina, pieczywa- proces biotechnologiczny, fermentacja cukrów
prostych przez drożdże ( w niedostatecznej ilości tlenu), utlenianie niezupełne i
następuje fermentacja
üð produkcja przetworów mlecznych- wykorzystanie bakterii produkujÄ…cych kwas
mlekowy
üð zdolność części bakterii do koncentrowania w komórkach niektórych metali ciężkich
wykorzystywana np. w górnictwie (biolugowanie)
üð stosowana w recyklingu i oczyszczaniu Å›rodowiska z zanieczyszczeÅ„- bioremediacja.
Biotechnologia molekularna (współczesna):
üð wykorzystuje organizmy, enzymy i biaÅ‚ka zmodyfikowane genetycznie zwiÄ…zana z
postępem biologii i genetyki molekularnej
üð podstawowa cecha- uniwersalność tj., wspólne reguÅ‚y dla drobnoustrojów, roÅ›lin,
zwierząt (specyficzna dotyczy głownie procedur transformacyjnych poszczególnych
grup organizmów
üð narodziny- w najwiÄ™kszym stopniu przyczyniÅ‚y sie badania kwasów nukleinowych,
doprowadziły do powstania biologii molekularnej, póz
niej inżynierii genetycznej
(enzymy restrykcyjne- klucz do manipulowania genami) i genomiki
(sekwencjonowanie i analiza całych genomów)
Podział biotechnologii drobnoustrojów, zwierząt, roślin- klasyczna oraz tzw. kolorowa oparta
na modyfikacjach genetycznych, konstrukcji GMO
üð biaÅ‚a- wykorzystuje sie systemy biologiczne w produkcji przemysÅ‚owej i ochronie
środowiska
üð czerwona- wykorzystywana w ochronie zdrowia (produkcja biofarmaceutyków,
szczepionek, rozwoju diagnostyki genetycznej)
üð zielona- zwiÄ…zana z rolnictwem obejmuje metody inżynierii genetycznej w celu
doskonalenia produkcji roślinnej lub zwierzęcej.
Składowe biotechnologii: dziedziny, które dostarczają wiedzy dla dzisiejszej biotechnologii są
to dziedziny wszystkich form nauki (mikrobiologia, ekologia, biochemia, genetyka, biologia
molekularna, ochrona środowiska, chemia, informatyka, fizyka, ekonomia, medycyna,
rolnictwo, przemysł spożywczy i chemiczny).
Biotechnologia tradycyjna vs współczesna:
üð tradycyjna- wyÅ‚Ä…cznie krzyżowanie osobników tego samego gatunku/blisko
spokrewnionych
üð współczesna- oparta na technikach inżynierii genetycznej, zniesienie barier w
przenoszeniu genów z jednego organizmu do innego
üð zmiany zachodzÄ…ce dziÄ™ki biotechnologii tradycyjnej sÄ… powolne, lata na uzyskanie
wyraz
nie zmienionych ras zwierząt czy odmian roślin. Biotechnologia współczesna -
uzyskanie dowolnego organizmu w ciÄ…gu tygodni
üð zmiany genetyczne powstaÅ‚e dziÄ™ki biotechnologii tradycyjnej dotyczyÅ‚y niewielu
gatunków. Biotechnologia współczesna- zmiany wśród licznych gatunków
uprawnych, gatunków wykorzystywanych w usuwaniu zanieczyszczeń środowiska,
produkcji leków, szczepionek.
30
PoczÄ…tki GMO, techniki rekombinacji DNA:
üð Cohen, Boyer- izolacja i transfer ludzkiegoo genu do bakterii
üð zarówno bakterie jak i czÅ‚owiek posÅ‚ugujÄ… sie tym samym jÄ™zykiem genetycznym, tj.
w taki sam sposób odczytują informacje genetyczna zapisana w strukturze genu.
Insulina: ludzki hormon produkowany dzięki technikom inżynierii genetycznej przez
bakterie- klasyczny przykład modyfikacji pierwotnych bakterii metodami inżynierii
genetycznej.
Po licznych modyfikacja przeprowadzonych metodami inżynierii genetycznej, gen insuliny
zaczął ulegać ekspresji u bakterii E. Coli.
Epokowość eksperymentu- udowodniono ze zarówno bakterie, jak i człowiek posługują sie
tym samym językiem (kodem) genetycznym, tj. w taki samym sposób odczytują informacje
genetycznÄ… zapisanÄ… w strukturze genu.
Dowód pokrewieństwa świata ożywionego- podstawa nowoczesnej biotechnologii.
Organizmy modyfikowane
üð organizmy transgeniczne- zawierajÄ… w swoim genomie tj. puli informacji genetycznej
organizmu, obce im geny, pochodzÄ…ce z innego organizmu
üð dziedzina nauki zajmujÄ…ca sie modyfikacjami organizmów to inżynieria genetyczna-
umożliwia identyfikacje, izolowanie i namnożenie dowolnego genu z dowolnego
organizmu za pomocą rożnych metod wprowadzania go do genomu modyfikowanego
organizmu. Pojęcie dotyczy wszystkich typów organizmów prokaryotycznych i
eukariotycznych. Przenoszony gen to transgen.
Organizm inny niż człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób
niezachodzący w warunkach naturalnych, w szczególności z zastosowaniem rekombinacji
DNA z użyciem wektorów (art. 3, Dz.U.nr. 76 ustawy o GMO)
Rodzaje zmian w materiale genetycznym
üð przenoszenie genów z organizmu, w którym istniejÄ… w naturze do nowego gospodarza
üð mutacje- celowe zmiany w pierwotnej strukturze genów
üð blokowanie lub usuwanie genów o niepożądanym dziaÅ‚aniu
üð powielanie kopii genów o pożądanej cesze
üð modulowanie aktywnoÅ›ci endogennych genów
Są to świadome poczynania.
Wykład 9(18.04.2012r.)
Narzędzia inżynierii genetycznej:
üð genomy (rezerwuary milionów genów)
üð enzymy (pozwalajÄ… m.in. wycinać, kopiować, wklejać geny- restryktazy, ligazy,
odwrotna transkryptaza)
üð wektory (bezpieczny transfer genów do nowych organizmów)
üð nie sÄ… wytworem myÅ›li ludzkiej
üð stworzone przez naturÄ™ a wykorzystywane przez badaczy do tworzenia organizmów o
nowych, pożądanych przez człowieka cechach.
Enzymy restrykcyjne  występują u bakterii i stanowią obronę przed wirusami. Rozpoznają
sekwencje nukleotydów i wycinają go, dzięki czemu nie można jej usunąć. Rola nożyczek
molekularnych (odkryte w latach 70 - uhonorowana NagrodÄ… Nobla)
31
Przed i po wprowadzeniu technik IG:
üð roÅ›liny- obiekt modyfikacji od tysiÄ™cy lat
üð dzisiejsza pszenica, kapusta, pomidory (sprzed epoki IG), tak dalece różniÄ… sie od
swoich dzikich przodków, ze klasyfikowane są jako odrębne gatunki
üð metody tradycyjne- losowe mieszanie tysiÄ™cy genów, selekcja osobników, niska
przewidywalność efektów
üð wszystkie roÅ›liny wyższe to organizmy transgeniczny
üð wprowadzenie obcych DNA komórek praprzodków dzisiejszych roÅ›lin zachodziÅ‚o
miliony lat temu
üð metody inżynierii genetycznej
üð poznanie struktury i funkcjonowania genów/ genomów
üð wieloetapowe, Å›wiadome dziaÅ‚ania- efekty bardziej skuteczne i przewidywalne.
Etapy modyfikacji genetycznych
üð okreÅ›lenie cechy, w którÄ… chcemy wzbogacić dany organizm
üð poszukiwanie wÅ›ród innych organizmów genu produkujÄ…cego biaÅ‚ko odpowiedzialne
za taka cechÄ™
üð przeniesienie genu z organizmu dawcy do gatunku, który ma być jego biorca
üð trwaÅ‚a integracja transgenu z genomem gospodarza
üð kontrolowana i wydajna ekspresja nowego genu tj. jego aktywnoÅ›ci
üð opracowanie metod jej regulacji (produkcja pożądanego biaÅ‚ka).
Cele konstrukcji roślin transgenicznych (GMO)
Rośliny transgeniczne powstałe z zastosowaniem technik inżynierii genetycznej:
üð wzrost wydajnoÅ›ci produkcji
üð odporność na chemiczne Å›rodki ochrony roÅ›lin
üð produkcja biaÅ‚ek o znaczeniu farmaceutycznym
üð przystosowanie do ekstremalnych warunków Å›rodowiska (susza, chłód, zasolenie)
üð odporność roÅ›lin na szkodniki, choroby wirusowe
üð poprawa parametrów technologicznych
Rośliny w życiu człowieka :
üð z
ródło pożywienia
üð surowiec do wytwarzania odzieży
üð Å›rodek leczniczy
üð walory ozdobne
üð klimat
üð rodzaj schronienia
Przodkowie vs odmiany dzisiejsze:
Rośliny, obiekt modyfikacji od tysięcy lat  losowe mieszanie tysięcy genów, mało
przewidywalny efekt, ryzykowne, długa selekcja  osobniki o innych pulach genowych
niż przodkowie.
Narzędzia i metody inżynierii genetycznej  świadoma, precyzyjna praca z kilkoma
genami  szybszy, przewidywalny efekt ulepszania rośliny.
Korzyści z upraw GM  wzrost plonów
üð modyfikacja Bt- odporność na szkodniki
üð do roÅ›liny wprowadzony gen bakterii Bacillus Thurigensis- produkuje toksyczne dla
szkodników białko Cry
32
üð szkodnik ginie
üð biaÅ‚ko nie jest toksyczne dla ssaków, ptaków, pÅ‚azów
üð poÅ›redni wzrost plonów (ograniczenie szkód)
üð np. kukurydza, baweÅ‚na
Rośliny odporne na herbicydy
üð odporność roÅ›lin na dziaÅ‚anie herbicydu, pozwala na jego stosowanie bez obawy o
zniszczenia upraw
üð nowe albo dodatkowe kopie genu odpowiedzialnego za syntezÄ™ enzymów
rozkładających herbicydy, roślina staje sie odporna na herbicydy
üð poÅ›redni wzrost plonów ( ograniczenie strat)
üð np. baweÅ‚na
Rośliny usuwające toksyny z gleby:
üð do tytoniu wprowadzone gen szczura
üð uzyskano roÅ›liny produkujÄ…ce biaÅ‚ko metalotioneinÄ™
üð tak zmodyfikowany tytoÅ„ pochlania setki razy wiÄ™cej jonów metali ciężkich z gleby
niż tradycyjne odmiany.
Roślina (a właściwie tylko korzeń bo tylko on bierze udział w tym procesie, metle
ciężkie nie są transportowane w wyższe partie rośliny) może potem być spalona, a
metale ciężkie będą bezpiecznie usunięte z popiołu.
Poprawa jakości żywności- złoty ryż:
üð 500 tys. dzieci rocznie traci wzrok w skutek niedoboru Wit. A w diecie
üð 2 mln dzieci do 5 roku życia umiera
üð problem krajów trzeciego Å›wiata (ryz podstawa diety)
üð organizm ludzi nie produkuje Wit. A
üð naturalne odmiany praktycznie nie zawierajÄ… Wit. A
üð 2 dodatkowe geny ( z żonkila- desaturaza karotenu i kukurydzy- syntaza fitoenu),
produkują beta karoten (20 x więcej niż w tradycyjnych odmianach)
Wykład 10(25.04.2012r)
Polacy zmutowali ziemniaka
üð odmiana odporna na dÅ‚ugotrwaÅ‚y brak wody
üð w szklarni zsadzono ziemniaki normalne i zmodyfikowane. Po 2 tyg. Å‚adnego wzrostu
obu bez podlewania jedynie te zmodyfikowane świetnie się trzymały.
üð w upalny suchy rok plon 8-13 ton/ha, przy nawadnianiu i regularnych opadach ok 50
ton
üð daleka droga do powstania nowej odmiany i wypuszczenia jej na rynek, dÅ‚ugi proces
badan, kilka sezonów testowania, zainteresowanie producentów
üð w okresie suszy roÅ›liny sÄ… sÅ‚absze i Å‚atwiej atakujÄ… je szkodniki (suchy lipiec-> atak
chorób)
Zmodyfikowany ziemniak obniży cholesterol
üð wzbogacony o gen AmA1 z nasion szarÅ‚atu
üð dodany do 7 gatunków ziemniaka  po dwóch latach bulwy zawierajÄ…ce 35-60%
więcej białka niż tradycyjne odmiany, ponadto aminokwasy o niskim poziomie w
niezmodyfikowanych ziemniakach (Lis, Tyr, Cys)
33
üð gen ze szarÅ‚atu (aramantus) jedna z najstarszych roÅ›lin uprawnych, podstawa diet
Inków i Azteków
üð nasiona amarantusa to z
ródło wielu nienasyconych kwasów tłuszczowych ( niski
poziom cholesterolu), łatwo przyswajalnych białek, oraz skwalenu- silny
przeciwutleniacz (opóz
nia procesy starzenia)
Testy nowych ziemniaków na szczurach i królikach- nie stwierdzono żadnych niepożądanych
efektów.
Cele modyfikacji
üð modyfikacje roÅ›lin ozdobnych- zmiany morfologiczne- m.in. dla osiÄ…gniÄ™cia
intensywniejszej barwy (szybsze niż tradycyjna selekcja) np. petunia z genem
reduktazy dihydroflawonidu pochodzącym z kukurydzy. Zmiana intensywności
zapachu- gen syntazy limonenu z grupy monoterapenów wprowadzony do róż,
petunii.
Odporność na patogeny- bakterie, grzyby, wirusy.
·ð owoce bezpestkowe, kawa bezkofeinowa
·ð owoce, warzywa, kwiaty o podwyższonej trwaÅ‚oÅ›ci np. pomidor z zahamowana
synteza etylenu
·ð owoce jako producenci szczepionek przeciwko chorobom ludzkim i
zwierzęcym, np. produkcja glikoproteiny wirusa wścieklizny (transgeniczne
pomidory, które produkowały to białko podano myszom. Okazało sie ze chroni
ona zwierze przed zakażeniem wścieklizną)
üð odporność na niekorzystne warunki Å›rodowiska tj. czynniki abiotyczne- możliwość
uprawy roślin na terenach gdzie wcześniej uprawa nie była możliwa (zasolenie gleby,
susza, mróz, zanieczyszczenie metalami ciężkimi, wysoka temperatura)
·ð fitoremediacja- oczyszczanie gleby z zanieczyszczeÅ„, tworzenie roÅ›lin zdolnych do
podwyższonej aktywności akumulacji metali ciężkich
·ð zmiana cech jakoÅ›ciowych- wzbogacenie roÅ›lin w okreÅ›lone witaminy, zmiana
wartości odżywczych (słodkie ziemniaki, ogórki- wprowadzenie genu słodkiego
białka- taumatyny)
Rośliny - fabryki białek farmakologicznych
üð produkcja skÅ‚adników krwi (albuminy osocza, czynniki krzepniÄ™cia krwi- tytoÅ„)
üð somatotropina (hormon wzrostu- tytoÅ„)
üð tzw. jadalne szczepionki  m.in. przeciwko zapaleniu wÄ…troby typu B- saÅ‚ata,
pomidory.
Etapy modyfikacji genetycznych
üð zdefiniowanie nowej cechy pożądanej w danym gatunku
üð poszukiwanie w naturze organizmu wyposażonego w taki gen
üð izolacja tego genu/ zespoÅ‚u genów i ich przeniesienie z organizmu dawcy do
organizmu biorcy
üð dobór/ opracowanie skutecznej metody transferu
üð trwaÅ‚a integracja trans genu z genomem gospodarza
üð kontrolowana i wydajna ekspresja nowego genu (opracowanie metod jego regulacji)
üð opracowanie metod regeneracji roÅ›liny (jeÅ›li obiektem zainteresowania sÄ… owoce,
kwiaty, liście)
34
Po co uprawiamy rośliny modyfikowane genetycznie?
üð ogromne straty w rolnictwie (owady, szkodniki, chwasty, warunki klimatyczne 
susze, zasolenie gleb  zmniejszenie kosztów produkcji)
üð podniesienie walorów jakoÅ›ciowych warzyw i owoców
üð podniesienie odpornoÅ›ci roÅ›lin, ograniczenie strat w uprawach
üð produkcja zwiÄ…zków farmakologicznych (skÅ‚adniki krwi, szczepionki, hormony)
üð oczyszczanie gleby (metale ciężkie)
Cel - głównie uzyskanie korzyści gospodarczych! Jeśli w wyniku modyfikacji
genetycznej nowa cecha negatywnie wpłynie na inne wartości istotne dla jakości plonów,
to taka odmiana nie wzbudzi zainteresowania rolników, konsumentów.
Biotechnologia roślin  uwarunkowania
Współczesna biotechnologia roślin (bazujących na inżynierii genetycznej) opóz
niona kilka lat
w stosunku do biotechnologii mikroorganizmów, zwierząt.
Przyczyny:
üð trudnoÅ›ci w wprowadzeniu obcego DNA do komórek roÅ›linnych (zabieg opanowany
w latach 90-tych; 10 lat po pojawieniu siÄ™ w handlu ludzkiej insuliny otrzymywanej
metodą inżynierii genetycznej)
üð stosunkowo dÅ‚ugi czas generacji roÅ›lin (od wykieÅ‚kowania z nasiona do wytworzenia
następnych nasion).
Mity o polskiej żywności
üð  naturalny  bardziej element strategii marketingowej (podobnie jak znaczniki
jakości), niż rzeczywisty wyznacznik jakości produktu
üð certyfikaty  każdy kto zÅ‚oży deklaracjÄ™ produkcji żywnoÅ›ci w sposób naturalny (bez
użycia środków chemicznych), może się o to ubiegać
üð obejmujÄ… m.in. wykorzystanie konwencjonalnych nasion, gdzie bez ograniczeÅ„
stosowano pestycydy, nawozy sztuczne
üð brak systematycznej kontroli ekożywnoÅ›ci przed wprowadzeniem produktu do
sprzedaży
üð żywność eko w testach na zawartość szkodliwych substancji, bakterii nie wypada
lepiej niż inna
 Polskie smaki
üð seria produktów (jogurty, kefiry, czekolady mleczne, twarożki) zawierajÄ…ce koszenicÄ™
(E120)  czerwony barwnik otrzymywany z odwłoków mszyc i ich jaj (żerują na
kaktusach, Tropiki ameryki PÅ‚.)
üð żywe owady sÄ… suszone w cieplarkach, a nastÄ™pnie mielone
 Zdrowa żywność vs modyfikacje genetyczne
üð  zdrowa sugeruje, że inna niż tzw. naturalna jest niezdrowa- manipulacja, element
strategii marketingowe a nie rzetelnej oceny jakości produktu
üð Polak w ciÄ…gu roku z chlebem, wÄ™dlinami, nabiaÅ‚em zjada ok. 2 kg Å›rodków
chemicznych
üð Z 2 mln polskich gospodarstw - <100tys. dostarcza 85% żywnoÅ›ci na polski rynek.
Stosują podobne metody hodowli co farmerzy zachodni (np. 150kg nawozów/ha;
hormonalny kurczak w pół roku osiągnie swoją masę)
35
Obawy
üð czy nowy gen może indukować zmianÄ™ funkcjonowania innych?
Przypadki wykrywalne w testach poprzedzajÄ…cych wprowadzenie na rynek (6-10 lat 
czas od startu badań nad konkretną modyfikacją do chwili, kiedy roślina pojawi się na
polach uprawnych)
üð strategia badania pokarmu stale udoskonalana, kluczowy test - porównanie gatunku
genetycznie modyfikowanego z niezmienionym pod względem naturalnych
składników odżywczych, toksyn, alergenów
üð żadne inne produkty żywnoÅ›ciowe trafiajÄ…ce na rynek, nie sÄ… badane tak restrykcyjnie
jak żywność genetycznie modyfikowana
Kontrowersje  konsumpcja żywności z roślin genetycznie modyfikowanych
üð obce DNA w pokarmie nie stanowi żadnego zagrożenia
üð transgen dla ukÅ‚adu pokarmowego tak samo  oby co każdy inny spożywany w
posiłku DNA i tak samo traktowany
üð biaÅ‚ka  degradowane i wchÅ‚aniane, te nie trawione wydalane
üð biaÅ‚ko trans genu nie jest obce dla przewodu pokarmowego. To rodzime biaÅ‚ka roÅ›lin
uprawnych czy bakterie powszechnie obecne w naszym otoczeniu. Jako takie trafiajÄ…
do przewodu pokarmowego zwierząt, człowieka bez pośrednictwa rośliny genetycznie
modyfikowanej
üð transgeniczne biaÅ‚ka nie stanowiÄ… novum dla ukÅ‚adu trawiennego
Kontrowersje  Czy nowy gen zaburzy funkcjonowanie organizmu biorcy?
üð insercja transgenu może zmieniać ekspresjÄ™ genów rodzimych
üð może dochodzić do zmian naturalnego metabolizmu
üð transgen może produkować biaÅ‚ko inne niż gatunków rodzimych
üð to sytuacje stale przebiegajÄ…ce w naturze
Przypadki takie wykrywalne są zawsze podczas testów poprzedających wprowadzenie
produktu na rynek.
üð żadne inne produkty żywnoÅ›ciowe nie sÄ… tak badane jak żywność GM
Kontrowersje c.d.
1. GMO zagrożeniem dla bioróżnorodności
üð wyselekcjonowane geny roÅ›lin uprawnych nie dajÄ… im przewagi w naturze, przeciwnie
 integracja człowieka utrzymuje pulę genów, korzystne jedynie z ludzkiego pkt.
widzenia (pole, o które nie zadba rolnik zostanie opanowane przez chwasty a nie
skolonizowane przez rośliny uprawne)
üð roÅ›liny uprawne do swojej egzystencji wymagajÄ… specjalistycznych zabiegów
uprawnych, które poza polami uprawnymi nie są wykorzystane
üð jeÅ›li np. nagle w naszym kraju jedna uprawa stanie siÄ™ dominujÄ…cÄ… to zawsze nastÄ…pi
to na skutek decyzji rolników.
2. geny przenoszone między odległymi ewolucyjnie gatunkami mogą wywoływać
szkodliwe zmiany
üð geny nie sÄ… Å›ciÅ›le  przywiÄ…zane do gatunku
üð szansÄ… zaistnienia takich zmian (i ich przeoczenia przed badaczy) wielokroć mniejsza
w przypadku mutacji spontanicznych, te zachodzÄ… stale we wszystkich organizmach.
Ignorujemy większe ryzyko dlatego przejmować się mniejszym?
36
3. stworzymy superchwasty
üð byÅ‚y, sÄ… i bÄ™dÄ… stwarzane, powstajÄ… tam gdzie dziaÅ‚a presja selekcyjna, np. na polu
uprawnym (np. bez odporności na herbicydy, zostały wcześniej  wyciągnięte z
organizmów, które pod presja taki gen sobie wyselekcjonowały)
4. ucieczka genów
Sposoby przeciwdziałania niepożądanym skutkom:
üð bariery fizyczne  szklarnie, pola uprawne z GMO obsadzone z kilkutygodniowym
wyprzedzeniem lub opóz
nieniem w stosunku do gatunków niezmodyfikowanych
üð bariery biologiczne  liczne metody molekularne zapewniajÄ…ce sterylność lub brak
aktywności pyłków
y
ródła niepokojów
üð obawa przed sytuacjami, na które sami nie mamy wpÅ‚ywu, nie panujemy nad nimi (np.
lot samolotem vs prowadzenie auta)
üð nowoÅ›ci przyjmowane z rezerwÄ…, wydajÄ… siÄ™ bardziej niebezpieczne niż metody
wcześniej stosowane i uznane za sprawdzone
üð znikoma wiedza wiÄ™kszoÅ›ci spoÅ‚eczeÅ„stwa o nowych technologiach, w tym o
metodach inżynierii genetycznej, tym samym brak zrozumienia mechanizmów istoty
takich działań, w konsekwencji uznanie ich na niebezpieczne
Wykład 11(09.05.2012r.)
Co kształtuje opinię?
üð Greenpeace  uwagÄ™ mediów zwraca, wywoÅ‚ujÄ…c spektakularny konflikt, skupia siÄ™
zwykle na jakimś szczególe problemu. Opinia kształtowana jest pod względem obrazu
aktywistów niszczących uprawy -> ludzie podświadomie kojarzą nowe technologie z
zagrożeniem
üð w rzeczywistoÅ›ci wiele innych skÅ‚adników pożywienia powinno budzić poważniejsze
objawy o zdrowie, niż rośliny GM. Skala zagrożenia w niczym nie dorównuje
szkodom wyrzÄ…dzanym przez chemizacjÄ™ rolnictwa, Polak w ciÄ…gu roku z chlebem,
wędlinami, nabiałem spożywa ok. 2 kg chemii.
Przyszłość???
üð techniki genowe to jeden ze sposobów tworzenia nowoczesnego zrównoważonego
rolnictwa
üð brak miÄ™dzynarodowych standardów oceny rynku (zasadnicze różnice miÄ™dzy
AmerykÄ… PÅ‚n. a EuropÄ…)
üð kiedy możemy uznać, że mamy dostatecznÄ… pulÄ™ danych o bezpieczeÅ„stwie
wynikającym z obecności w naszym życiu organizmów (żywności) GM?
üð Brak wiarygodnych informacji o negatywnych efektach stosowania inżynierii
genetycznej dla człowieka lub środowiska
üð Pozytyw: wyższe zyski rolników, zmniejszenie iloÅ›ci stosowanych herbicydów,
pestycydów; przez to obniżenie skażenia środowiska, oczyszczenie środowiska
naturalnego, produkcja leków
37
Względy ekonomiczne
üð Polska nie jest samowystarczalna żywnoÅ›ciowo
üð 2 mln ton to roczny import modyfikowanej soi i kukurydzy na pasze  surowiec
niemodyfikowany znacznie droższy, tym samym droższe produkty powstałe na bazie
tych pasz (jaja, mleko, kurczaki, wołowina), alternatywa to import takich produktów
(np. drożdże), a np. kurczaki i tak będą karmione paszą genetycznie modyfikowaną
üð niższe koszty produkcji rolnej na skutek ograniczenia strat w uprawach
Ewolucja to historia udoskonalenia organizmów setkami metod. Dzisiaj kontynuujemy
ten proces dysponując owoczesnymi narzędziami a natura i ludzie wybiorą to co lepsze.
GMO to technologia dająca nadzieję ludzkości i najnowszy etap w długiej historii
stosowania przez ludzi metod genetycznych.
BÄ…dz
my ostrożni, krytyczni, rzetelni w swoich Poznaniach, ale poszukujemy nowych
rozwiązań polepszających nasze życie.
To postęp a nie zastój jest zgodny z naturą.
Sposoby pozyskiwania genów (cz. 1)
üð wykorzystywanie odwrotnej transkrypcji (przy dużej iloÅ›ci danych tran skryptów w
puli mRNA  hormony, białka zapasowe, enzymy)
üð synteza chemiczna, na podstawie znanej sekwencji aminokwasów, biaÅ‚ek (zasady
kodu genetycznego)
üð PCR, przy znanej sekwencji (lub części) poszukiwanego genu (izolacja bezpoÅ›rednio z
genomu)
üð hybrydyzacje
üð biblioteki cDNA (banki genów), genomowe  przeszukiwanie kolekcji klonów za
pomocÄ… sond
üð poznanie struktury, analiza caÅ‚ych genomów  genomika (identyfikacja obszarów
kodujÄ…cych)
üð interferencja RNA (wyciszanie genów)
üð analiza porównawcza profili ekspresyjnych różnych części organizmu (identyfikacje
genów warunkujących zmiany fenotypowe)
üð hybrydyzacje różnicowe kolekcji cDNA dla różnych organizmów tymi samymi
sondami
üð kontrolowane mutacje w obszarach wybranych sekwencji i Å›ledzenie fenotypowych
efektów tych zmian
üð żaden za sposobów nie jest uniwersalny, skuteczny w odniesieniu do wszystkich
genów/ genomów
Wybór metod pozyskiwania genów
Kluczowe znaczenie  dostępność informacji na temat danego genu:
üð funkcja
üð lokalizacje genu w genomie
üð znajomość caÅ‚kowitej lub częściowej jego sekwencji
üð wiedza o produktach danego genu
üð informacje na temat analogicznych genów w innych organizmach
üð wzór ekspresji genów (spektrum produktów biaÅ‚kowych)
üð możliwie najpeÅ‚niejsza wiedza o strukturze genomu, potencjalnego dawcy genu (także
genomu biorcy), zaplanowane miejsca wbudowania nowego genu
38
Lokalizacja genów
üð badanie in silcio  za pomocÄ… komputera (bazy danych, oprogramowania), oparte na
analizach DNA
üð cechy genów wyróżniajÄ… je spoÅ›ród sekwencji niegenowych. Podstawowe to: ORF 
tj. seria kodów umożliwiających przyłączenie kolejnych aminokwasów do tworzonego
peptydu. Jej poczÄ…tek to kodon inicjujÄ…cy (ATG), koniec  terminacyjny (TAA, TAG,
TGA)
üð poszukiwania  skanowanie danej sekwencji pod kÄ…tem obecnoÅ›ci obu kodonów i
odpowiedniej odległości między nimi. Efektywne u bakterii  niewielki procent
sekwencji niekodujących. Mniej skuteczny w genomach eukariotycznych  duże
regiony pozagenowe plus introny w genach.
üð kolejny etap poszukiwaÅ„  charakterystyczne poÅ‚Ä…czenia ekson  intron
üð metody te nie dotyczÄ… genów  niebiaÅ‚kowych jak np. gen RNA (nie majÄ… ORF).
Tworzą za to charakterystyczne struktury II  rzędowe (np. spinka do włosów).
Programy te skanują DNA pod kątem takich struktur, identyfikują obszary, w których
takie geny sÄ… obecne
üð analizy porównawcze  poszukiwania podobieÅ„stw nowej sekwencji do genów już
powstałych
Metody eksperymentalne
üð wiÄ™kszość, inaczej niż w metodach komputerowych, oparta na wykrywaniu i badaniu
transkryptu (RNA)
üð analizy hybrydyzacyjne, w tym m.in. hybrydy.ZOO  gdzie pozytywny sygnaÅ‚
hybrydyzacji dla Dna z każdego gatunku oznacza, że gen np. wybranych ludzi jest
również obecny w pozostałych gatunkach, ale hybrydyzujące frakcje na DNA krowy i
królika są mniejsze niż fragmenty na próbkach DNA ludzkiego i szympansa  tzn.
sekwencje homologiczne wobec sondy sÄ… obecne we wszystkich 4 gatunkach, ale
występują w innym otoczeniu sekwencyjnym
Techniki pozyskiwania genów (cz. 2)
(rys.)
39
Techniki pozyskiwania genów (cz. 3)  synteza chemiczna
Białko
(oznaczanie kolejności aminokwasów)
|
Leu  Met  Cys  Liz  Arg  Ala  Gli  Leu  His
(zasady kodu genetycznego)
|
GAA CTA CCA GTT GGC CCA AAT TGG TCA
(polimeraza DNA)
|
GAA CTA CCA GTT GGC CCA AAT TGG TCA
Gen: CTT GAT GGT CAA CCG GGT TTA ACC AGT
Ustalenie funkcji genu  metody komputerowe
üð analizy baz danych, odpowiednie programy
üð poszukiwania homologii wobec genów już opisanych o zdefiniowanej funkcji. Geny
homologiczne wywodzą się od wspólnego produktu (nie muszą mieć identycznej
sekwencji nukleotydów). Wśród nich:
·ð ortologi  homologi obecne u rożnych organizmów, które przed rozdzieleniem
się gatunków miały wspólnego przodka. Geny takie zwykle mają kasie same
funkcje, np. gen mioglobiny ludzkiej i szympansa
·ð para logi  obecne w tym samych organizmie (czÅ‚onkowie rodzin
wielogenowych), np. mioglobiny i beta globiny człowieka
üð homologia `" podobieÅ„stwo (geny sÄ… lub nie spokrewnione)
Analizy sekwencji DNA
üð przedmiotem analiz sÄ… raczej sekwencje aminokwasów (a nie DNA).
Niespokrewnione geny bardziej różnią się przy porównaniu sekwencji aminokwasów.
Wynik analiz porównawczych jest obarczony mniejszym błędem (białka złożone z 20
aminokwasów, a DNA tylko z 4 nukleotydów)
üð program porównuje badanÄ… sekwencjÄ™ do tych zawartych w bazie danych. Wartość
wyliczonego współczynnika decyduje o homologii badanych sekwencji (ocena stopnia
identyczności 2 sekwencji  liczba pozycji, których w obu sekwencjach obecny jest
dany aminokwas)
üð BLAST  popularny program m.in. do identyfikacji spokrewnionych sekwencji
(identyczność sekwencji  76%, na poziomie aminokwasów  26%)
Metody eksperymentalne
üð RNAi  sposób inaktywacji genu przez zniszczenie jego mRNA
üð wprowadzenie do komórek dÅ‚ugich dwuniciowych (dsRNA) o sekwencjach
homologicznych wobec docelowego mRNA (proces indukowany np. wprowadzeniem
do komórki wektorów retro wirusowych). Sekwencja dsRNA zaprojektowana z
zachowanie zasady komplementarności wobec danego genu o znanym składzie
nukleotydów
üð indukcja zjawiska siRNA
üð efekt  degradacja mRNA, brak produktu genu (zahamowanie syntezy biaÅ‚ek)
üð analizy fenotypowe
üð wymuszona nadekspresja genów  stworzenie organizmu, w którym badany gen
wykazuje nadaktywność wobec zwykłego odpowiednika
40
üð osiÄ…gana przez wprowadzenie do komórek wektora z silnym promotorem (wydajna
transkrypcja i duża ilość białka) oraz badanym genem (używa się jego cDNA, który
nie zawiera intronów, jest więc krótszy i łatwiejszy w manipulacji)
üð stwierdzenie jak to zjawisko wpÅ‚ywa na fenotyp organizmu transgenicznego 
informacja o funkcji tego genu
Wykład 12(16.05.2012r.)
Kryteria wyboru obiektu badań
üð zapotrzebowanie ze strony firm biotechnologicznych  roÅ›liny o dużym znaczeniu
gospodarczym/ekonomicznym  rolnictwo (gatunki uprawne), medycyna, przemysł
spożywczy, farmaceutyczny
üð organizmy modelowe (E.coli, A. thaliana), dotychczasowa wiedza na ich temat (np.
komórki drożdży ważnym modelem w badaniach komórek Eukariota  w tym, np.
mechanizmy regulacji funkcjonowania genów, interakcji między nimi)
üð aktualny stan zaawansowania metod molekularnych i informatycznych
(bioinformatyka) i wynikająca z niego aktualna wiedza o gatunkach użytkowych
będących obiektem zainteresowania
üð rozmiary genomu i stopieÅ„ jego poznania
Metody transformacji roślin
üð wprowadzenie obcego DNA do genomu biorcy utrudnia Å›ciana komórkowa
üð brak uniwersalnych metod transformacji  specyficzne dla gatunków, rodzajów
komórek. Konkretne warunki opracowane dla wybranych gatunków/tkanek nie muszą
być skuteczne w innych
üð szczególna trudność  transformowanie roÅ›lin jednoliÅ›ciennych (m.in. zboża)
üð komórki, obiekt transformacji przeprowadzane wstÄ™pnie w stan tzw. kompetencji
(zmiana struktury ściany komórkowej)
üð nie zawsze celem transformacji musi być ostateczne regeneracja caÅ‚ej roÅ›liny.
Niekiedy komórki roślinne, zależnie od charakteru nowej cechy mogą być
utrzymywane w stanie zawiesiny komórkowej
Rodzaje transformacji
üð autonomiczna  gen dawcy wprowadzany do komórki biorcy i replikowany
niezależnie od jego genomu (procedury efektywne w transformacji drobnoustrojów).
Możliwa dzięki użyciu odpowiednich wektorów (miejsca ori, ARS)
üð integracyjna  gen dawcy trawle integruje siÄ™ z genomem gospodarza i podlega
replikacji jak pozostałe jego geny (podstawa procedur transformacji organizmów
wyższych), techniki wektorowe i bezwektorowe (rekombinacja niehomologiczna)
Kryteria doboru metody transformacji
Wymagania stawiane przed wybranÄ… metodÄ…:
üð wydajny sposób transferu DNA (inny dla jedno- i dwuliÅ›ciennych)
üð zdolność transformowanych komórek do regeneracji
üð odpowiednia metoda selekcji transformatorów
41
Dodatkowe cechy optymalnej metody transformacji
üð powtarzalna, wysoka wydajność transformacji
üð krótki czas hodowli
üð duża czÄ™stość wystÄ™powania zdrowych pÅ‚odnych roÅ›lin
üð relatywna prostota techniczna wykonania
üð uniwersalność  szeroki wachlarz gatunków
üð ogólne koszty zabiegów
Metoda wektorowa
üð korzysta z wektorów naturalnych, sztucznych. UmożliwiajÄ… bezpieczny transfer
genów do komórki nowego gospodarza.
üð naturalne wektory, obecne m.in. w komórce Agrobacterium tumefacieus. DziÄ™ki nim
bakterie te posiadają naturalną zdolność wprowadzania swojego DNA do komórek
roślin. W wektorze tym zakodowana jest informacja o białkach niezbędnych do
zaatakowania rośliny.
üð plazmid Ti wnika do komórek, jeden z jego elementów (T-DNA) integruje siÄ™ z
genomem gospodarza  agroinfekcja (agrotransformacja).
üð w obszar T-DNA można wstawić gen innego gatunku.
üð ograniczenie  roÅ›liny jednoliÅ›cienne (zboża) w minimalnym stopniu ulegajÄ…
agroinfekcji.
Agroinfekcja
üð podstawa tzw. wektorowych metod uzyskiwania roÅ›lin transgenicznych to zjawisko
genetycznej transformacji komórek roślinnych przez bakterie z rodzaju Rhizobiaceae
 Agrobacterium tumefacieus lub Agrobacterium rhizogenes (ten sam co bakterie
brodawkowate  symbioza z korzeniami roślin motylkowych).
üð to Gram (-) bakterie glebowe, efekt to pojawienie siÄ™ rakowatych naroÅ›li w miejscach
infekcji (A. tumefacieus) lub infekcja dużej liczby włośnikowatych korzeni (A.
rhizogenes).
üð bakterie pod wpÅ‚ywem chemotaksji przyÅ‚Ä…czajÄ… siÄ™ do komórek roÅ›linnych, a
następnie przenoszą część swojego naturalnego plazmidu Ti lub Ri do niektórych
komórek.
Modyfikacja przy użyciu A. tumefacius
üð bakterie majÄ… naturalnÄ… zdolność wprowadzania swojego DNA do komórek roÅ›lin.
Część wprowadzonych genów powoduje powstanie tumorów (roślin) na łodygach  A.
tumefacius.
üð geny te można usunąć, a w ich miejsce wstawić dowolny gen, który zostanie
wprowadzony do rośliny. Zamiast narośli roślina uzyska odporność np. na herbicydy 
środki ochrony roślin.
üð przy użyciu A. tumefacius modyfikowano głównie roÅ›liny dwuliÅ›cienne (np. soja,
rzepak, bawełna, tytoń). Do modyfikacji roślin jednoliściennych (zboża) stosowano
metody bezpośredniego wprowadzania DNA bez użycia wektorów.
Plazmid Ti (tumor inducing)
üð dÅ‚ugość ok. 200 kpz, posiada naturalny mechanizm integracji swojego regionu T-DNA
(20 kpz) w regionie infekowanej komórki roślinnej.
42
üð sygnaÅ‚ do transferu  uwolnienie podczas zranienia roÅ›liny pochodnych fenolu i
cukrów, zakwaszenie środowiska (czynniki chemokatalityczne, kierują bakterie w
stronÄ™ zranionej tkanki).
üð efekt  indukcja genów wirulencji (obszar vir, 24 geny w 8 operonach leżą poza T-
DNA). Produkty tych genów regulują transfer T-DNA i stabilnie integrują go z
genomem gospodarza.
üð region T zawiera m.in. geny zwiÄ…zane z produkcjÄ… fitochromów, syntezy
aminokwasów, opin (z
ródło N i C dla bakterii).
üð kluczowa rola w transferze T-DNA  sekwencje LB i RB (po 25 pz) tj. lewy i prawy
ogranicznik regionu T. Niezbędne w stabilnej integracji w genom rośliny. DNA
zawarty między nimi przenoszony do komórki rośliny za pomocą białek hodowlanych
przez geny regionu vir (leżą poza obszarem T-DNA).
üð geny regionu T zawierajÄ… m.in. TATA (lokalizacja kompleksu polimerazy RNA II,
sygnaÅ‚ inicjacji transkrypcji, AATAAA Ä…ð sygnaÅ‚ poliadenylacji, terminacji
transkrypcji).
üð Å‚Ä…cznie 196 genów
üð region wirulencji (30-40 kpz) 0 geny vir w 8 operonach
üð geny katabolizmu specyficznych dla szczepów opin
üð region inicjacji replikacji (ori)
üð gen tra (odpowiedzialny za transfer pTi rekombinacji bakteryjnej
Ograniczenia metody
üð głównie dwuliÅ›cienne i nieliczne jednoliÅ›cienne (Liliales i Arales), brak wÅ›ród nich
większości gatunków uprawnych
üð dodatkowe ograniczenie  niemożność transferu fragmentów DNA dÅ‚uższych niż 30
kpz (uniemożliwia wprowadzenie dużych genów, całych szlaków metabolicznych)
Wady systemu
üð duży rozmiar plazmidu (utrudniona manipulacja)
Metody wektorowe, pośrednie  zalety
Naturalna, największa metoda transformacji za pośrednictwem A. tumefacius
üð skuteczna ochrona wprowadzonych fragmentów DNA
üð wysoka wydajność (czÄ™stość integracji fragmentów T z genomem roÅ›liny)
üð jednoczesna możliwość użycia kilku szczepów bakterii zawierajÄ…cych wtórne geny
üð niskie koszty i prostota wykonania (inkubacja szczepów Agrobacterium w zawiesinie
komórek roślinnych, obiektu transformacji).
Metody wektorowe  wady
üð maÅ‚a skuteczność w przypadku roÅ›lin jednoliÅ›ciennych (brak syntezy induktorów Ä…ð
sÅ‚aba integracja T-DNA i produkcja przez te roÅ›liny specyficznych substancji Ä…ð
pochodne diterpenów, odpowiedz
tkanek na infekcje (Agrobacterium, zahamowanie
wzrostu)
üð najczęściej udaje siÄ™ wÅ‚Ä…czyć pojedynczy gen
Bezwektorowy transfer genów
Metody wprowadzania obcego DNA do roślin dwuliściennych dla wielu gatunków
opracowane w stopniu umożliwiającym niemal rutynowe otrzymywanie roślin
43
transgenicznych (skuteczność wybranej metody jest bardzo różna dla różnych gatunków,
odmian, nawet tkanek).
Próby transformowania jednoliściennych mało efektywne. Wynika to z niewielkiej
przydatności A. trmefacieus do wprowadzenia obcej informacji genetycznej do
jednoliściennych, nie są one naturalnym gospodarzem tego patogenu.
W związku w powyższym, poszukiwania alternatywnych metod transferu do tych gatunków.
Wykład 13(23.05.2012r.)
Metody bezwektorowe (fizyczne, chemiczne)
üð bezpoÅ›rednie wprowadzenie DNA do komórek roÅ›linnych. Transformowane komórki
mogą być uprzednio pozbawione ściany komórkowej (protoplast).
üð elektroforacja (fizyczne)  seria impulsów elektrycznych tworzÄ…cych pory w Å›cianie
komórkowej, DNA może przenikać do wnętrza.
üð mikrowstreliwanie (fizyczne)  mikropociski opÅ‚aszczone DNA wstrzeliwywane sÄ… do
komórek za pomocą  armatki genowej .
üð z użyciem PEG (chemiczne)  PEG zwiÄ™ksza przepuszczalność Å›ciany komórkowej
üð mikroiniekcja (fizyczne)
üð przez impuls elektryczny (elektroporacja)  krótkie wysokonapiÄ™ciowe impulsy
ułatwiają wprowadzenie transgenu do komórek/protoplastów. Skuteczność zależy od
stężenia DNA, natężenia i czasu trwania impulsu (ustalona eksperymentalnie dla
każdego gatunku osobno). Efektywność zależy ponadto od protoplastów, czasu
inkubacji, stężenia PEG i noÅ›nika DNA, obecnoÅ›ci Mg²z . Wydajność 2-8%. Metoda
ograniczona do gatunków z opracowanymi metodami regeneracji roślin z
protoplastów.
Mikrowstrzeliwanie
üð biolistyczna technika, przeÅ‚om w transformacji zbóż (Sanford 1987).
üð wstrzeliwanie do żywej tkanki  mikropocisków opÅ‚aszczonych preparatem DNA
(m.in.. również wektorem) przy pomocy strzelby genowej. Odpalanie naboju dzięki
energii sprężonego gazu (hel), impulsu elektrycznego czy mechanicznego. Nośnikami
genów  kulki wolframowe, złote.
üð czynniki efektywnoÅ›ci  rodzaj aparatu, ciÅ›nienie gazu, wielkość i rodzaj pocisku,
rodzaj tkanki.
Woda  mikronośniki najczęściej hamuje się w wakuolach, cytoplazmie, jądrze
komórkowym.
Inne techniki bezwektorowe (bezpośrenie)
üð Mikroiniekcja  bezpoÅ›rednie wprowadzenie DNA do komórki unieruchomionej w
agarze poprzez wstrzykniecie transgenu pipetą. Najbardziej precyzyjna i pracochłonna
metoda. Wydajność 15-25%. Nie wymaga markerów selekcyjnych.
üð Endocytoza stymulowana chemicznie  inkubacja protoplastów wraz z roÅ›linnym
DNA w obecności związków chemicznych (np. PEG) odwracalnie rozluz
niajÄ…cych
strukturę błon komórkowych, co ułatwia przenikanie DNA przez błonę,
Bezwektorowe transfery  zalety i wady
üð Zaleta  brak barier gatunkowych (jedno- i dwuliÅ›cienne)
üð Wady:
·ð trudnoÅ›ci w regeneracji roÅ›lin z protoplastów (procedury)
44
·ð niestabilne, wielokopijne procesy transgenów
·ð tendencja do wyciszania genów i zaburzeÅ„ ekspresji
·ð niska wydajność transformacji
·ð niska przeżywalność komórek (uszkodzenia mechaniczne, szok  zaburzenia
podstawowych procesów życiowych Ä…ð metabolizm, reakcje na bodz
ce,
zdolność do regeneracji)
·ð wysokie koszty (cena aparatów, noÅ›ników)
·ð uzależnienie od dostÄ™pnoÅ›ci procedur regeneracji caÅ‚ej roÅ›liny
·ð brak uniwersalnych metod efektywnych dla szerokiego spektrum gatunków
Efektywność transgeniczna
Różna dla wybranych roślin (agroinfekcja skuteczna przede wszystkim w przypadku roślin
dwuliściennych, u jednoliściennych  niedostatek naturalnych induktorów). Czynniki
decydujące o skuteczności transformacji:
üð gatunek roÅ›liny
üð rodzaj transformowanej tkanki
üð zastosowany szczep bakteryjny
üð metodyka transformacji
üð optymalizacja warunków
üð interakcja Agrobacterium  roÅ›lina (stres)
üð obecność sekwencji towarzyszÄ…cych genomom
Efektywność danej metody w przypadku wybranego gatunku nie oznacza, że będzie ona
równie skuteczna dla innego. Parametry każdego transferu dobierane eksperymentalnie.
Etapy skutecznej transformacji genetycznej
üð konstrukcja rekombinowanego wektora
üð transfer okreÅ›lonego elementu wektora do komórki roÅ›linnej
üð jego integracja z chromosomami roÅ›liny
üð ekspresja informacji genetycznej, tj. nadanie roÅ›linie pożądanej cechy dziÄ™ki
obecności i aktywności transgenu
Cechy  konstruktu transformacyjnego
üð podstawowe elementy wektora ekspresyjnego: promotor genu strukturalne (noÅ›nik
pożądanej cechy), selekcyjne, reporterowe, terminator, dodatkowo  sekwencje
sprzyjajÄ…ce wbudowaniu transgenu do odpowiedniego regionu genomu czy
umożliwiające sekrecję białek do określonych przedziałów.
üð wbudowanie transgenu sekwencjami homologicznymi do jakiegoÅ› odcinka jÄ…drowego
lub plastycznego DNA (zwykle dobiera się obszary międzygenowe) co sprzyja
wbudowaniu transgenu do genomu/plastomu (materiały genetycznego plastydów) na
zasadzie wymiany podobnych fragmentów pomiędzy wieloma cząsteczkami DNA w
procesie homologicznej rekombinacji).
Konstrukt służący do transformacji
(rys.)
45
Promotor  odcinek DNA powyżej genomu, zawiera elementy rozpoznawane przez
polimerazę RNA zależną od DNA (połączenie rozpoczyna transkrypcję). Eukariotyczne
dodatkowo zawiera sekwencje rozpoznawane prze czynniki transkrypcyjne (wiążą się z DNA
i umożliwiają związanie się polimerazy RNA z nicią DNA i rozpoczęcie transkrypcji).
Promotor może mieć długość od kilkudziesięciu do kilkuset nukleotydów.
Typy promotorów
üð konstytutywne  ich indukcja i ekspresja regionu kodujÄ…cego we wszystkich tkankach
niezależna od czynników środowiskowych i rozwojowych.
üð indukowane  ulegajÄ… ekspresji w obecnoÅ›ci czynnika indukujÄ…cego. WÅ›ród nich
regulowane chemicznie za pomocą związków chemicznych (ich pojawienie się w
środowisku powoduje  zwiększenie aktywności promotora. Czynnik nie może być
toksyczny dla komórki, działają wyłącznie na ekspresję tkankowego genu, w naturze
nie są one składnikami komórki. Regulowane czynnikami fizycznymi (światło,
temperatura).
üð syntetyczne  we wspólny element Å‚Ä…czone sÄ… naturalne najbardziej konserwatywne
regiony promotora Pro- i Eukariota, np. TATA box (u roślin zastępowany przez
AGGA boc), CAAT box, GC box.
Konstrukty objęte patentami  zasada konstrukcji, użycie, liczne wymagania.
üð tkankowo-specyficzne  indukowane czynnikami egzo- i endogennymi. ZawierajÄ…
elementy wzmacniające (osłabiające ekspresję genu w wybranych organizmach (np.
owoce  E8 genu oksydazy ACC, nasiona  ad43)
üð organowo-specyficzne (promotor patatyny ulegajÄ…cy ekspresji w bulwach) lub
działające w określonych fazach rozwojowych roślin (apg z Arabidopis aktywujący
geny w stadium mikrospory)
Promotor konstytutywny  cechy, przykłady
üð promotory genów roÅ›lin jednoliÅ›ciennych zwykle podnoszÄ… ekspresjÄ™ transgenów u
dwuliściennych (np. promotor genu Adh1 z kukurydzy nieaktywny w tkankach
tytoniu). Dodanie elementów wzmacniających może powodować jego aktywność.
üð promotor genu dobrze dziaÅ‚ajÄ…cy w tkankach rodzimego gatunku może nie
wykazywać aktywności lub niską w tkankach innego gatunku (potrzeba badań roślin
transgenicznych różnych gatunków, także w różnych warunkach środowiskowych).
üð transgeny nieaktywne w jednym genotypie roÅ›linnym mogÄ… być stabilne i aktywne w
innym środowisku genetycznym.
üð roÅ›linne promotory konstytutywne, uniwersalne  CaMv 35S, syntazy opionowej (z
atogenów roślinnych), Wos  syntazy nopaliny.
üð specyficzne dla jednoliÅ›ciennych  ubikwitynowy, Act-1 (nice actin), Adn-1
Promotor CaMv 35S  pochodzi z wirusa mozaiki kalafiora, w genomie gospodarza tworzy
transkrypt 3TS. Aktywny w komórkach jedno- i dwuliściennych. Aktywność nie zależy od
białek kodowany przez genom CaMv, odpowiadają za nią czynniki transkrypcyjne gospodarz.
Geny represorowe  markery inżynierii genetycznej
Kodują białka, których obecność łatwo oznaczyć w komórkach (in vivo)  metody
biochemiczne, autoradiografia, spektrofotometrii bio- i chemiluminescencyjnych.
A
ączące w fuzję z genami o pożądenej (nieznanej cesze).
46
Wprowadzenie do badanych komórek na drodze transformacji (bakterie) lub transfekcji
(komórki w hodowli komórkowej). Efekt ekspresji stały lub przejściowy (ulegają lub nie
ekspresji z genami biorcy).
Konstrukt gen represorowy stosowany jest w danym systemie badawczym jeśli system jest
pozbawiony endogennego genu homologicznego. Niezbędny wektor ekspresyjny, który
umożliwi efektywne wyrażenie białka kodowanego przez gen reporterowi w badanym
układzie.
Geny reporterowe
üð ²-galaktozydaza (²-gal)  enzym kodowany przez gen lac2 z E. coli.
Oznaczenie aktywności  substrat x-gal pod wpływem enzymu rozkładany do
niebieskiego produktu. Jego ilość oznaczona kolorymetrycznie, proporcjonalna do
aktywności genu.
üð lucyferaza  enzym kodowany przez lucyferynÄ™ z robaczka Å›wiÄ™tojaÅ„skiego.
Katalizuje bioluminescencyjną reakcję przemiany lucyferyny, która utlenia się i
przechodzi w stan wzbudzenia, następnie powracając do stanu wyjściowego 
powoduje emisję światła, a emitowane fotony są zliczane (luminator). Całkowita
emisja światła jest proporcjonalna.
üð biaÅ‚ko zielonej fluorescencji (EFP)  kodowane przez gen gfp meduzy
A. victoria normalnie fluoryzuje po dostarczeniu energii przez fotoproteinÄ™
aktywowanÄ… jonami Ca²z . FluorescencjÄ™ GFP można też indukować
promieniowaniem niebieskim i UV. Liczne pochodne GFP fluoryzujÄ… na niebiesko
(CFP) lub żółto (PEP).
Wykład 14 (30.05.2012r.)
Regeneracja roślin (cz.1)
Drugi obok transformacji zespół metod koniecznych do utworzenia rośliny transgenicznej.
Komórki roślinne muszą uzyskać stan kompetencji.
Najwyższą efektywność do transformacji i regeneracji mają komórki merystemów, zarodków,
młodych liści, siewek.
Na zdolność do regeneracji wypływają:
üð etap rozwoju i wiek kultury
üð rodzaj pożwyki, na której komórki rozwijajÄ… siÄ™ w niej regulatory wzrostu (auksyny,
cytokininy) oraz wiązki inicjacji procesów organo  i embriogenezy
üð warunki Å›wietlne (typ i dostÄ™pność Å›wiatÅ‚a, czas naÅ›wietlania)
Optymalne warunki regeneracji najczęściej kolidują z warunkami efektywnego transferu
genów!!! A
atwiejsza dla dwuliściennych.
Równolegle z regeneracją roślin następuje eliminacja komórek, które nie uległy procesowi
transformacji (pożywka bogata w związki selekcyjne). Transformowane komórki wyposażone
są w aktywne geny selekcyjne (np. odporności na kanamycynę, higromycynę) bądz
zawierajÄ…
geny produkujÄ…ce enzymy neutralizujÄ…ce te antybiotyki.
Stymulacją do rozwoju transformatorów jest dodatek do podłoża (hodowli) mannozy, jej
metabolizm upośledza komórki nietransgeniczne.
47
Dobór metod selekcji (dawek czynników selekcyjnych) zależy od gatunku rośliny, reakcji
tkanek, rodzaju genów markerowych (parametry dobrane eksperymentalnie)
üð totipotencja  zdolność dzielenia siÄ™ i odtwarzania organów caÅ‚ego organizmu
(organogeneza)
üð podatność komórek do podziałów i wzrostu w kulturze in vitro, odwrotnie
proporcjonalne do stopnia zróżnicowania i specjalizacji. Najbardziej odpowiednie 
żywotnie jądro komórkowe, unieruchomione błony plazmidu; niezbyt grube ściany
komórkowe.
üð najczęściej stosowane eksplantanty (fragmenty roÅ›liny) to komórki merystemów
wierzchołkowych, bocznych tj. wierzchołki korzenia i pędów oraz zawiązki korzeni
bocznych
üð nieprzydatne  komórki wysoce zróżnicowane i wyspecjalizowane pod wzglÄ™dem
fizjologicznym i strukturalnym
üð Å‚atwiejsza u dwuliÅ›ciennych (najczÄ™stsza u nagonasiennych)
·ð gatunki o dużej zdolnoÅ›ci morfogenetycznej in vitro  N.tabacum  sÅ‚abo
regenerujÄ…ce  drzewiaste
üð o powodzeniu decyduje też stan fizjologiczny i zdrowotnoÅ›ci roÅ›liny. Wszystkie
komórki zwierają identyczną informacje genetyczna, a różnicowanie morfologiczne i
funkcjonalne wynika z zablokowania aktywności części genów. Odróżnicowanie
niezbędne do ponownego podjęcia podziałów komórkowych, podlega na
uaktywnieniu zablokowanych genów
üð potem może nastÄ…pić powtórne zróżnicowanie  odmÅ‚odzonych komórek
(recyferencjacja). Bodz
cem wyzwalającym proces odróżnicowania w kulturach in
vitro jest odizolowanie komórek/tkanek od rośliny matczynej i obecność regulatorów
wzrostu w pożywkach (auksyny, cytokininy).
Kultury komórek (zawiesiny)
Zbiór pojedynczych, szybko dzielących się komórek zawieszonych w płynnej pożywce. W
hodowlach zawiesinowych oprócz pojedynczych komórek obecne są agregaty komórkowe.
Do otrzymania zawiesin wykorzystywane są eksplantanty  młody klaus, komórki zarodków
oraz wierzchołki pędów utrzymywane w formie niezróżnicowanej (organogeneza hamowane
hormonalnie)
Agregaty  symulacja naturalnych warunków (brak komunikacji komórek typowych dla
naturalnych tkanek, zaburza procesy regulacji metabolizmu). Mankamenty takich układów 
powolny wzrost biomasy i trudności w wymuszeniu sekrecji związków poza komórkę.
Istotne, aby proces zakładania kultury, komórki roślinne były wolne od wirusów (komponenty
pożywki powinny je eliminować np. tiouracyl).
48
Kultury zawiesinowe
üð pożywka z hodowlÄ… zawiesinowÄ… stale mieszana -dobre napowietrzanie i
jednorodność składu chemicznego, rozproszenie namnażających się komórek
üð eksplantaty izolowane bezpoÅ›rednio z roÅ›lin, powodujÄ… znaczne opóz
nienie wzrostu
hodowli zawiesinowej (gwałtowna zmiana środowiska, duża spoistość tkanek
roślinnych), z tych powodów inne niż kalus tkanki są wykorzystywane rzadko. Kalus
początkujący hodowlę ma postać tkanki z luz
no ułożonymi komórkami (po uniesieniu
w płynnej, wytrząsanej pożywce ulega rozbiciu na pojedyncze komórki)
üð eksplantaty używane do zaÅ‚ożenia zawiesiny musza być zupeÅ‚nie wolne od
drobnoustrojów  materiał roślinny używany jako eksplantat pochodzi najczęściej już
z hodowli in vitro
Metabolity wtórne
üð zwiÄ…zki chemiczne nie odgrywajÄ…ce kluczowej roli w metabolizmie podstawowym
üð istotne w przystosowaniu roÅ›lin do warunków Å›rodowiska i potrzeb czÅ‚owieka
üð produkcja nie wymaga regeneracji roÅ›lin, mogÄ… być wytwarzane w warunkach kultur
komórkowych/tkankowych (hodowle prowadzone w bioreaktorach). Możliwa ścisła
kontrola warunków biosyntezy (wymuszenie wydajnej produkcji), niezależnych od
warunków klimatycznych
üð Å‚atwiejszy wybór bezpoÅ›rednio zwiÄ…zanych z produkcjÄ…, konkretnego zwiÄ…zku.
Akumulacja metabolitów w wybranych przedziałach komórkowych)wakuole,
ogranicza szkodliwy wpływ na komórki) oraz sekrecja związków do pożywek
Jeden z najważniejszych kierunków biotechnologii roślin. Ich synteza ma podłoże
genetyczne, liczne z nich pełnia funkcje regulacyjne w ekspresji genów. Ekspresja genów
odpowiedzialnych za syntezę niektórych, indukowana przez substancję pojawiające się w w
roślinie, w warunkach stresowych.
Tworzą kilka grup związków:
·ð terpentenoidy  zwiÄ…zki eteryczne (kamfora, mentol), glikozydy nasercowe,
polimery łańcuchowe (kauczuk)
·ð alkaloidy, narkotyki (opium), atropina, kofeina
·ð zwiÄ…zki fenolowe, tym barwniki (flawony, antocyjany, garbniki, kwas
cynamonowy)
üð w warunkach naturalnych ich biosynteza jest wolna i maÅ‚o wydajna, czÄ™sto przebiega w
określonych częściach roślin, a do ich ekstrakcji używa się ogromne ilości biomasy
roślinnej
üð synteza tych zwiÄ…zków na drodze chemicznej jest droga i zÅ‚ożona. StÄ…d badania nad
optymalizacją warunków do produkcji metabolitów w postaci kultur komórkowych
üð barwniki roÅ›linne  (np. fioletowe flawonoidy, czerwone antocyjany, żółte karotenoidy)
stosowane jako dodatek do farb, barwniki tkanin, dodatki do żywności, kosmetyków.
Pozyskane z biomasy roślinnej, w warunkach In vitro podniesiono ich trwałość,
neutralność.
49
üð zwiÄ…zki zapachowe  w naturze  mieszanki zÅ‚ożone z kilkunastu zapachów, a
oryginalność zależy od proporcji składników, np. zapach waniliowy jest wytwarzany
przez grupę enzymów, ich gen zidentyfikowano w Vanillia plantriofolia, sklonowano
pod silnymi promotorami i za pośrednictwem wektora wprowadzono do komórek
stanowiÄ…cych bazÄ™ kultur zawiesinowych
Wydajność produkcji metabolitów
üð przyczyny niskiej produktywnoÅ›ci metabolitów: sÅ‚aba znajomość wybranych szlaków
metabolicznych oraz wiedza o molekularnych mechanizmach regulacji
üð metodami inżynierii genetycznej wprowadzanie genów kodujÄ…cych syntezÄ™ enzymów
obecnych w komórkach roślin w niedostatecznych ilościach
üð czynniki determinujÄ…ce wydajność produkcji metabolitów:
·ð rodzaj genotypu
·ð ukierunkowanie akumulacji do wybranych przedziałów komórkowych
(wakuole, ogranicza wpływ na komórki) organów
·ð sekrecja zwiÄ…zków poza komórkÄ™ (wzrost przepuszczalnoÅ›ci)
·ð dostÄ™pność prekursorów
üð wpÅ‚yw na warunki hodowli (tym samym i produkcje metabolitów) ma pochodzenie
eksplantantów (stan fizjologiczny, wiek). Wybór materiału biologicznego do hodowli
to ważne kryterium efektywności
üð zdolność poszczególnych tkanek tej samej roÅ›liny do wytwarzania metabolitów bywa
zupełnie różna (nawet możliwości ich regeneracji, transformacji)
üð w praktyce najczęściej spoÅ›ród kultur stosowane sÄ…:
·ð zawiesina komórkowa wyprowadzona z kalusa lub komórek merystemów
·ð korzenie wÅ‚oÅ›nikowate
Wady hodowli komórek
üð zawiesiny komórkowe zwykle utrzymywane sÄ… w formach niezróżnicowanych
(hormonalnie blokowana organogeneza). Brak komunikacji z innymi tkankami
(inaczej niż w warunkach naturalnych), wywołuje zaburzenia procesów naturalnych i
ogranicza zdolności produkcji metabolitów
üð symulacja warunków maturalnych  agregaty komórek w hodowlach (możliwość ich
różnicowania). Każdy typ komórek ma odrębne wymagania i wybór określonych,
wymaga licznych testów optymalizacyjnych.
Wykład 15 (06.06.2012r.)
50