Ćwiczenie 1 i 2- Analiza przeciwutleniczy w produktach żywnościowych

Wstęp teoretyczny:

Przeciwutleniacze są związkami chemicznymi, których budowa pozwala na unieszkodliwianie wolnych rodników. Te z kolei w niewielkich ilościach są pożądane w organizmie, jednak ich nadmiar może powodować niekorzystne zmiany w organizmie człowieka. Mogą się przyczyniać do zwiększania ryzyka chorób: stany zapalne, nadciśnienie, choroby niedokrwienne, wrzody żołądka, nowotwory. U podstaw mechanizmów działania przeciwutleniaczy znajdują się: przerwanie/zakończenie reakcji wolnorodnikowych, oddanie atomów wodoru, oddanie/przyjęcie elektornu przez przeciwutleniacze. Bardzo dobrymi przeciwutleniaczami są polifenole. Ich własności uwarunkowane są: wiązaniem podwójnym między atomami węgla C2 i C3, obecność grupy hydroksylowej w pozycji C3 np. (+) katechina, obecność grupy karbonylowej w pozycji C4, występowanie innych grup OH, jednoczesne występowanie grupy karbonylowej w pozycji C4 oraz hydroksylowych przy C3 i C5. Do polifenoli zaliczamy m.in. kwasy fenolowe (hydroksybenzoesowe- truskawki, maliny, jeżyny, cebula, hydroksycynamonowe- owoce i zboża, estry kwasu kawowego- ), flawonoidy (flawony- grejpfrut, rumianek, flawony- pietruszka, tymianek, seler naciowy, bazylia, mięta, karczochy, flawonole- cebula, skórka jabłek, brokuły, herbata, flawanole- jabłka, czarna, zielona herbata, cebula, czerwone wino, owoce cytrusowe, brokuły, zielone warzywa liściaste, wiśnie, flawanony- albedo owoców cytrusowych, antocyjany- czerwone wino, zboże, owoce liściaste, bakłażany, kabaczki, fasola, cebula, rzodkiew, izoflawony- soja i inne nasiona roślin strączkowych, chalkony- chmiel, kocanki), stilbeny (wśród nich najbardziej znany jest resweratrol- jego wzmożona synteza odbywa się poprzez infekcję winogron przez szlachetną pleśń z gatunku Botrytis cinerea) oraz lignany (soczewica, czosnek, szparagi, marchew, gruszki, śliwki, siemię lniane, całe ziarna zbóż). Resweratrol hamuje proliferację komórek nowotworowych i indukuję apoptozę, chroni grupy sulfhydrylowe białek przed utlenianiem. Do innych znanych przeciwutleniaczy należą karoteny (pod względem siły antyutleniającej wyróżniają się likopen charakterystyczny dla pomidorów i β-karoten występujący m.in. w marchwi), witamina E (cztery tokoferole i 4 tokotrienole) oraz witamina C.
Cel ćwiczenia: Ocena aktywności antyoksydacyjnej wybranych produktów metodą ABTS i DPPH. Oznaczenie ogólnej zawartości polifenoli metodą kolorymetryczną z odczynnikiem Folin-Ciocalteu.
Przygotowanie ekstraktów z owoców: wg instrukcji
Przygotowanie podstawowego i roboczego roztworu ABTS: wg instrukcji
Przygotowano rozcieńczenia zgodnie z tabelą:

Lp	Stężenie końcowe standardu [mg/100 mL]	Objętość PBS [μL]	Objętość 1 mM Troloxu [μL]
1	0	200	0
2	1,25	190	10
3	2,5	180	20
4	5	160	40
5	7,5 (odrzucone)	140	60
6	10 (odrzucone)	120	80

Analiza spektrofotometryczna: zgodnie z instrukcją
Krzywa wzorcowa Troloxu dla ABTS:

0	0,6011
1,25	0,3555
2,5	0,2253
5	0,0041

y-0,5471=-0,1146x
x=(y-0,5471)/-0,1146

Wyniki pomiarów dla ekstraktu zielonej herbaty i soku jabłkowego

Zielona herbata (rozcieńczenie 100, 200, 500 i 1000x)			Sok jabłkowy (rozcieńczenie 50x)
rozcieńczenie	Aktywność przeciwutleniająca [mg Troloxu/100 ml ekstraktu]	Absorbancja	Lp	Aktywność przeciwutleniająca [mg Troloxu/100 ml ekstraktu]	Absorbancja
100 (odrzucony)	-	4,1230	2 (odrzucony)	-	4,8115
200 (odrzucony)	-	1,0754	5 (odrzucony)	-	4,7955
500 (odrzucony)	-	0,7560	10	0,91	0,5367
1000	3750	0,1175	-	-	-

Obliczenia dla soku jabłkowego

Rozcieńczenie 2x
x= (4,8115-0,5471)/-0,1146= -37,21 mg/100 mL (wynik odrzucony)
Rozcieńczenie 5x
x= (4,7955-0,5471)/-0,1146= -37,07 mg/100 mL (wynik odrzucony)
Rozcieńczenie 10x
x= (0,5367-0,5471)/-0,1146= 0,091 mg/100 mL
x2 (po uwzględnieniu 10x rozcieńczenia)= 10*0,091= 0,91 mg/100 mL (dla soku jabłkowego)
Średnio dla soku jabłkowego 0,91 mg/100 mL

Obliczenia dla herbaty

Rozcieńczenie 100x
x=(4,1230-0,5471)/-0,1146= -31,20 mg/100 mL (wynik odrzucony)
Rozcieńczenie 200x
x=(1,0754-0,5471)/-0,1146= -4,61 mg/100 mL (wynik odrzucony)
Rozcieńczenie 500x
x=(0,7560-0,5471)/-0,1146= -1,82 mg/100 mL (wynik odrzucony)
Rozcieńczenie 1000x
x=(0,1175-0,5471)/-0,1146= 3,75 mg/100 mL (dla rozcieńczenia 1000x)
x2 (po uwzględnieniu 1000x rozcieńczenia)= 1000*3,75 mg/100 mL= 3750 mg/100 mL (dla ekstraktu herbaty)
Średnio dla herbaty 3750 mg/100 mL

Oznaczenie polifenoli ogółem

Wykonanie krzywej wzorcowej: zgodnie z instrukcją
Obliczenia:

50mg - 100cm³

X1- 0,5cm³

X1= 0,25 mg w 25cm³ metanolu

X2- 5cm³

X2= 0,05 mg w 50 cm³

X3- 100cm³

X3=0,1 mg (wzorzec nr 1)

50mg- 100cm³

X1- 1,25cm³

X1= 0,625 mg w 25cmł metanolu

X2- 5cmł

X2= 0,125 mg w 50 cmł

X3- 100cmł

X3=0,25mg (wzorzec nr 2)

50mg - 100cmł

X1- 2,5cmł

X1= 1,25 mg w 25cmł metanolu

X2- 5cmł

X2= 0,25 mg w 50 cmł

X3- 100cmł

X3=0,5 mg (wzorzec nr 3)

50mg- 100cm³

X1- 3,75cm³

X1= 1,875 mg w 25cmł metanolu

X2- 5cmł

X2= 0,375 mg w 50 cmł

X3- 100cmł

X3=0,75 mg (wzorzec nr 4)

50mg- 100cmł

X1- 5cmł

X1= 2,5 mg w 25cmł metanolu

X2- 5cmł

X2= 0,5 mg w 50 cmł

X3- 100cmł

X3=1 mg (wzorzec nr 5)

Lp	Zawartość katechiny [mg/100 mL]	Absorbancja
1 (odrzucony)	0	0,2763
2	0,1	0,0608
3	0,25	0,1342
4	0,50	0,2034
5	0,75	0,2062
6 (odrzucony)	1,00	0,2053

x= (y-0,0628)/0,221x

Wyniki pomiarów dla ekstraktu zielonej herbaty i soku jabłkowego

Zielona herbata (rozcieńczenie 100, 200, 500 i 1000x)			Sok jabłkowy (rozcieńczenie 2, 5, 10 i 50x)
rozcieńczenie	Zawartość katechiny [mg/100 mL]	Absorbancja	Lp	Zawartość katechiny [mg/100 mL]	Absorbancja
100	1,81	0,0668	2 (odrzucony)	-	0,0192
200	70,5	0,1407	5	2,56	0,1758
500	243,65	0,1705	10	7,81	0,2354
1000	707,7	0,2192	50 (odrzucony)	-	0,1483

Obliczenia dla soku jabłkowego

Rozcieńczenie 5x
x= (0,1758-0,0628)/0,221= 0,5113 mg/100 mL (dla rozcieńczenia 5x)
x2 (po uwzględnieniu 5x rozcieńczenia)= 5*0,5113 mg/100 mL= 2,5565 mg/100 mL (dla soku)
Rozcieńczenie 10x
x= (0,2354-0,0838)/0,1503= 0,781 mg/100 mL (dla rozcieńczenia 10x)
x2 (po uwzględnieniu 10x rozcieńczenia)= 10*0,781 mg/100 mL= 7,81 mg/100 mL (dla soku)
Średnio dla soku jabłkowego 5,18 mg/100 mL

Obliczenia dla herbaty

Rozcieńczenie 100x
x= (0,0668-0,0628)/0,221= 0,0181 mg/100 mL (dla rozcieńczenia 100x)
x2 (po uwzględnieniu rozcieńczenia)= 0,0181* 100= 1,81 mg/100 mL (dla ekstraktu herbaty)
Rozcieńczenie 200x
x=(0,1407-0,0628)/0,221= 0,3525 mg/100 mL (dla rozcieńczenia 200x)
x2 (po uwzględnieniu 200x rozcieńczenia)= 200*0,3525 mg/100 mL= 70,5 mg/100 mL (dla ekstraktu herbaty)
Rozcieńczenie 500x
x=(0,1705-0,0628)/0,221= 0,4873 mg/100 mL (dla rozcieńczenia 500x)
x2 (po uwzględnieniu 500x rozcieńczenia)= 500*0,4873 mg/100 mL= 243,65 mg/100 mL (dla ekstraktu herbaty)
Rozcieńczenie 1000x
x=(0,2192-0,0628)/0,221= 0,7077 mg/100 mL (dla rozcieńczenia 1000x)
x2 (po uwzględnieniu 1000x rozcieńczenia)= 1000*0,7077 mg/100 mL= 707,7 mg/100 mL (dla ekstraktu herbaty)
Średnio dla herbaty 255,92 mg/100 mL

Wnioski:
Na podstawie wyników otrzymanych na podstawie ćwiczenia nr 1 widać, że zawartość aktywność przeciwutleniająca ekstraktu z zielonej herbaty jest dużo wyższa niż dla soku jabłkowego. Aktywność antyutleniająca badanych substancji wynika z zawartości polifenoli.
http://www.biochemiaurody.com/slownik/greentea.html
Z artykułu zamieszczonego na tej stronie wynika, że zawartość polifenoli ogółem w 1 filiżance (150 mL) zielonej herbaty wynosi 100-200 mg. Zatem w 100 mL ekstraktu z zielonej herbaty znajduje się 66,7-133,3 mg polifenoli. Zatem badana herbata odznaczała się bardzo silnymi własnościami antyoksydacyjnymi. Podczas fermentacji herbaty dochodzi do spadku zawartości przeciwutleniaczy (herbata zielona zawiera do 30% więcej związków polifenolowych niż herbata czarna).
http://www.biochem.umcs.lublin.pl/readarticle.php?article_id=57
Z tego samego powodu herbata czarna zawiera teaflawinę, która reguluje ilość cholesterolu we krwi i tearubiginę, która pobudza perystaltykę jelit. Zatem nie można jednoznacznie określić, że któraś z herbat jest „ogólnie lepsza”.
www.pttz.org/zyw/wyd/czas/2006.../14_Rembialkowska.pdf
Z artykułu zamieszonego na tej stronie wynika, że zawartość polifenoli ogółem w 100 mL soku pasteryzowanego wynosi 19,37-34,87 mg (przebadano odmiany Cortland, Jonagold, Idared). Zatem badany sok miał niską aktywność antyoksydacyjną. Główny wniosek jaki się nasuwa na podstawie przeprowadzonych analiz jest taki, że skuteczniej przed wolnymi rodnikami chroni zielona herbata. Podobnie jak w przypadku produkcji fermentowanej herbaty, tak w przypadku produkcji soku klarowanego i pasteryzowanego dochodzi do znacznego spadku zawartości antyoksydantów. Wynika z tego także wniosek, że obierając jabłko i wyciskając z niego sok wyrzucamy dużą część cennych dla zdrowia człowieka polifenoli. Przeprowadzone i opisane w tym artykule badania (te same odmiany jabłek) wskazują, że pastryzowany kremogen zawierał polifenole w ilości 4462-6929 mg/kg.
Generalnie rzecz biorąc warto suplementować swoją dietę w produkty bogate w antyoksydanty ze względu na ich korzystne działanie dla zdrowia:

- ochrona przed powstawaniem nowotworów. Wykazano bowiem, że społeczeństwa azjatyckie, które chętniej sięgają po zieloną herbatę niż społeczeństwa zachodnie, rzadziej zapadają na nowotwory.
- zapobieganie przed starzeniem organizmu. Polifenole mają działanie chelatujące w stosunku do żelaza, które to jony biorą udział w tworzeniu jonów hydroksylowych, które z kolei powodują niszczenie błon komórkowych. Poza tym polifenole hamują postępowanie chorób neurodegeneracyjnych takich jak choroba Alheimera i Parkinsona.
- zapobieganie miażdżycy. M.in. katechiny zielonej herbaty zapobiegają utlenianiu frakcji cholesterolu LDL w tętnicach, a przez to zapobiegają przekształcaniu się makrofagów w struktury piankowate. Katechiny stymulują także wytwarzanie tlenku azotu (II), który stymuluje rozkurcz naczyń krwionośnych.
- spadek aktywności enzymów rozkładających węglowodany (mniejsze wchłanianie cukrów w jelitach), tłuszcze (lipaza żołądkowa i lipaza trzustkowa- mniejsze wchłanianie lipidów)

---