25.05.2009r. WYKŁAD 11

METODY BADANIA ZBIOROWOŚCI MIKROORGANIZMÓW W ZANIECZYSZCZONYCH GRUNTACH.

Monitorowanie procesu oczyszczania:

Podstawowym parametrem kontroli przebiegu procesu bioremediacji gruntu zanieczyszczonego substancjami organicznymi jest monitorowanie poziomu zanieczyszczeń podczas procesu oczyszczania (chromatografia gazowa). Jednakże równolegle należy kontrolować liczebność i aktywność metaboliczną mikroflory bytującej w zanieczyszczonym środowisku. Problemem tych badań jest to, że w laboratorium potrafimy wyhodować bardzo niewielką ilość mikroorganizmów funkcjonujących w gruncie. Tak więc trwają starania o opracowania metod pośrednich, które by dostarczyły więcej informacji o liczebności i różnorodności mikroflory zanieczyszczonego środowiska. W ostatnich 6 latach obserwuje się intensywny rozwój metod enzymatycznych i molekularnych (przedmiotem naszego zainteresowania jest metoda enzymatyczna).

Enzymy glebowe są biokatalizatorami ważnych procesów metabolicznych w tym rozkładu substancji organicznej i detoksykacji ksenobiotyków (pestycydów). Degradacja związków organicznych do CO₂ i H₂O wymaga wielu reakcji chemicznych w które zaangażowane są białka katalityczne. Dlatego też, aktywność tych enzymów może być cennym narzędziem w monitorowaniu bioremediacji gruntów zanieczyszczonych związkami ropopochodnymi i innymi substancjami toksycznymi.

Najważniejszymi enzymami, których aktywność może dostarczać istotnej informacji o poziomie zanieczyszczeń są: oksygenazy (zaczynają proces biodegradacji, włączają O₂ ), lipazy, dehydrogenazy, katalazy, ureazy, proteazy, fosfatazy, β-glukozydazy (rozkład związków celulozowych). Poza tymi enzymami oznacza się również poziom zawartości ATP.

1. Analiza poziomu ATP

ATP jest obecny we wszystkich żywych organizmach i działa tam jako koenzym i substrat.

Charakterystycznym jest to, że w komórkach nieżywych jest szybko degradowany. Dlatego też ATP traktowane jest jako podstawowy parametr do oceny aktywności biologicznej żywej biomasy. ATP z próbki gleby poddanej sonifikacji (dźwięki) ………. się kwasem fosforowym, mocznikiem, DMSO i EDTA. Oznaczenie prowadzi się metodą luminescencyjną.

Z dotychczasowych obserwacji wynika, że w intensywnej fazie degradacji zanieczyszczeń poziom ATP jest kilkakrotnie wyższy w porównaniu z poziomem przed zanieczyszczeniem i po zanieczyszczeniu.

2. Badanie aktywności oddechowej gruntu (aktywność oksygenaz)

Oddychanie mikrobiologiczne stanowi sumę wielu procesów metabolicznych powodujących powstawanie CO₂ i jest to wynik wykorzystywania tlenu przez mikroorganizmy bytujące w glebie. Aktywność oddechowa gruntu określana również aktywnością oksygenaz- enzymów z klasy oksydoreduktaz, katalizujących proces wbudowania O₂ w cząsteczkę substratu. Enzmy te uważana są za kluczowe dla procesu biodegradacji takich związków jak węglowodory. Tak więc oznaczenia aktywności oddechowej są miarą mineralizacji węgla organicznego oraz mogą …… miarą oceny dynamiki rozkładu związków organicznych. Oznaczenia te wykonuje się 2 metodami:

-mierząc ilość pobranego tlenu (analizatory tlenu),

-mierząc ilość wydzielonego CO₂.

Oznaczenie wykonuje się metodą miareczkową roztworu KOH do którego przepuszczone zostaje……………………………………. z powietrzem nad pojemnikiem w którym prowadzona była bioremediacja w ciągu 1godziny bez dostępu tlenu.

Zwykle przebieg zmian aktywności oddechowej podczas procesu bioremediacji jest zbliżony do tego jak dla ATP.

3. Aktywność dehydrogenaz

Biologiczne utlenianie jest w dużym stopniu związane z reakcjami odwodornienia, prowadzonym przez enzymy z klasy dehydrogenaz. Enzymy te zostały jako pierwsze włączone w schemat monitorowania przebiegu bioremediacji. Aktywność tych enzymów ulega podobnym zmianom w czasie procesu oczyszczania jak oksygenazy, przy czym są one bardzo wrażliwe na obecność substancji toksycznych, np.: fenoli. Często przez długi czas obserwuje się obniżony poziom aktywności tych enzymów. Aktywność tą oznacza się używając jako substrat chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu. Charakterystyczna jest niska powtarzalność wyników dotyczących aktywności tego enzymu i niedoskonałość danej metody oznaczania.

4. Aktywność lipaz

Hydrolazy acyloglicerolowe (lipazy) prowadzą reakcje hydrolizy estrów glicerolu i wyższych kwasów tłuszczowych. Odgrywają istotną rolę w przemianach lipidów u mikroorganizmów, roślin, zwierząt. Jeszcze do nie dawna uważano, że ze względu na oddziaływanie z niepolarnymi substratami lipazy mogą działać jedynie z nierozpuszczalnymi w wodzie substratami i zawdzięczają to występowaniu tzw. miejsc hydrofobowych w cząsteczce enzymu. Dziś widomo, że mogą działać w środowiskach hydrofilowym i hydrofobowym, charakteryzują się stosunkowo niską specyficznością substratową i mogą brać udział w wielu reakcjach enzymatycznych.

Oznacza się je kolorymetrycznie z użyciem jako substratu paranitrofenylomaślanu. Charakterystyczny przebieg aktywności tego enzymu podczas procesu bioremediacji jest następujący:

W początkowej fazie procesu bioremediacji obserwuje się stosunkowo niski poziom aktywności, a następnie stopniowy wzrost aktywności lipaz, któremu towarzyszy jednoczesny spadek stężenia węglowodorów. W końcowej fazie bioremediacji obserwuje się ustabilizowany poziom aktywności tego enzymu. Dla niektórych substancji zakażających obserwuje się w ciągu całego procesu stopniowy wzrost aktywności tego enzymu.

Uważa się, że aktywność lipazy ze względu na swą prostotę i szybkość analizy może być doskonałym wskaźnikiem dla monitorowania procesów oczyszczania. Moment stabilizacji aktywności może informować o fazie końcowej procesu rozkładu zanieczyszczeń.

5. Aktywność katalazy

Katalaza jest to oksydoreduktaza, odpowiada za rozkład nadtlenku wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego. Nadtlenek wodoru jest produktem ubocznym powstającym w wyniku działania innych oksydoreduktaz, (np. dysmutazy nadtlenkowej), wytwarzany jest w cytoplazmie i peroksyzomach. Katalaza zabezpiecza przed toksycznym działaniem nadtlenku wodoru niszczącym struktury komórkowe. Katalazę oznacza się metodą miareczkową z nadmanganianem potasu. Zmiany tej aktywności w czasie procesu oczyszczania są podobne jak w przypadku oksygenaz i dehydrogenaz.

6. Aktywność ureazy (rozkład mocznika z uwolnieniem amoniaku)

Aktywność tego enzymu związana jest z wykorzystaniem źródeł azotu w oczyszczanym środowisku. Aktywność tego enzymu oznacza się dokonując pomiaru ilości uwolnionego amoniaku stosując jako substrat mocznik. Pomiar ten daje nam informacje o ogólnej aktywności „życiowej” mikroorganizmów. Główną obserwacją dotyczącą tego pomiaru jest to, że korelacje między wykorzystanym stopniem degradacji zanieczyszczeń, a aktywnością ureazy obserwuje się tylko w początkowym stadium procesu biodegradacji. Analogiczną ocenę i zadania ma oznaczenie aktywności proteazy.

7. Aktywność fosfatazy

Fosfataza to enzym katalizujący przemiany fosforu organicznego do fosforanów. Jest to enzym typowy dla środowiska glebowego, występuje w korzeniach roślin, grzybach, promieniowcach i innych mikroorganizmach glebowych. Odgrywa poważną rolę w przemianie substancji humusowych i jego aktywność jest ściśle związana ze stężeniem fosforanów w oczyszczanym środowisku. Jest dobrym wskaźnikiem mineralizacji substancji zanieczyszczających, zawierających związki fosforu i mało przydatnym wskaźnikiem w przypadku zanieczyszczeń węglowodorami.

PODSUMOWANIE:

Badanie aktywności biologicznej (enzymatycznej) oczyszczanych gruntów dostarcza cennej wiedzy o intensywności, przebiegu procesów biodegradacji zanieczyszczeń i jednocześnie o toksycznym wpływie zanieczyszczeń na zbiorowość mikroorganizmów. Zdecydowana większość analiz przydatna jest jednak głównie w początkowej fazie procesu oczyszczania. Niewielkie różnice aktywności w końcowych etapach mogą wynikać z postępujących procesów adaptacji mikroorganizmów do zanieczyszczeń resztkowych, bądź toksyczności najtrudniej degradowanych komponentów na mikroflorę środowiska. Specjaliści w zakresie monitorowania środowiska wskazują, że do chwili obecnej nie ma oprogramowanych metod, które w sposób jednoznaczny wskazywałyby na stan oczyszczanego miejsca. Wszystkie poznane dotąd metody są użyteczne, a wyniki jednych metod są interpretowane w porównaniu z innymi metodami (chemiczne, mikrobiologiczne, enzymatyczne). W wyniku tych oznaczeń korelować należy z oznaczeniami toksyczności zanieczyszczeń w poszczególnych fazach procesu oczyszczania.

---