15.11.2012

Biomarkery nowotworowe

Biomarker - „cecha. Która daje się obiektywnie zmierzyć ii może być zastosowana w ocenie:

- fizjologicznych procesów biologicznych

- procesów patologicznych

- odpowiedzi organizmu na działania terapeutyczne

- zgodnie z tą definicją biomarkerem może być:

- wynik oznaczenia danej substancji w próbce biologicznej

- wynik badania przedmiotowego

- wynik innych badań dodatkowych

- wynik badania obrazowego

Obecnie pojęcie biomarkeru używa się głównie w określeniu do pierwszej kategorii tj. jako związku analizowanego w materiale biologicznym.

Pojęciem „marker nowotworowy” określa się substancję, której obecność lub stężenie pozostaje w związku z rozwojem nowotworu.

Jest to zmiana która pojawia się w makrocząsteczkach funkcjonujących w danej komórce nowotworowej jako bezpośredni wynik transformacji neoplastycznej tejze komórki lub postępującego jej klonalnego rozrostu.

Czynniki spełniające warunki biomarkeru nowotworowego:

- produkowane przez komórki nowotworowe i uwalniane do krążenia

- obecne w niskim stężeniu w surowicy u osób zdrowych i chorobami łagodnymi, natomiast stężenie ich zwiększa się w przebiegu choroby nowotworowej (zwłaszcza tylko w jednym typie nowotworu)

- łatwe oznaczanie niedroga metodą

- obecne w oznaczalnych ilościach (lub większych niż prawidłowo) we wczesnych lub przed klinicznych stadiach

- stężenie markera nowotworowego odzwierciedla wielkość guza

- wysoka czułość diagnostyczna ( kilka wyników fałszywie ujemnych) i wysoka specyficzność (kilka wyników fałszywie dodatnich)

Mechanizmy zwiększania stężenia markerów w płynach ustrojowych:

1. Zwiększenia liczby kopii genu lub chromosomu ( np. amplifikacja genu)

2. Zwiększenie sekrecji białek związanych z błoną komórkowa lub uwalnianie domeny zewnątrzkomórkowej

3. Angiogeneza, inwazja i destrukcja architektury tkanek (guz pierwotny, przerzuty)

Ad.1 -> nadekspresja genu

Np. nadekspresja HE4 w raku jajnika

HE2 - rak piersi

Ad.2 ECD

- zmiany w polarności komórek nowotworowych -> uwalnianie glikoprotein

- zwiększenie ekspresji proteaz (II, IX, żelatynazy)

Np. ECD HER 2

Ad.3 w przypadku nowotworów nabłonkowych: białka mogą przenikać błonę podstawną

Np. PSA (KLK3)

Wymogi analityczne i kliniczne oznaczanie biomarkerów nowotworowych.

Wymagania analityczne:

Wiarygodność wyników a tym samym ich użyteczność diagnostyczna determinuje spełnienie przez metody wielu wymagań odnośnie:

- czułości analitycznej,

- swoistości analitycznej,

- precyzji,

- dokładności.

Czułość analityczna metod pomiarowych

Pomiar stężeń rzedu 10⁹ - 10⁶ g/l dla metod immunochemicznych

Swoistość analityczna metod pomiarowych.

Zależy od jakości antygenów:

1. Stosowanych jako wzorce i kalibratory,

2. Użytych w procesie otrzymywania przeciwciał
   - stosowane przeciwciała monoklonalne powinny być skierowane przeciwko determinantom antygenowym, których obecność jest charakterystyczna dla nowotworu.

Dokładność metod pomiarowych.

Można oceniać tylko w układzie zestawów odczynnikowych i materiału referencyjnego pochodzących od tego samego producenta.

Precyzja metod pomiarowych.

Współczynniki zmienności

• wewnątrzseryjnej powinny być <5%

• pomiędzyseryjnej< 10%

Użyteczność diagnostyczna wyników oznaczeń markerów nowotworowych.

Użyteczność diagnostyczna wyników oznaczeń markerów nowotworowych charakteryzują cztery parametry:

Czułość diagnostyczna określa prawdopodobieństwo stwierdzenia u chorego na nowotwór stężenie markera wyższego od przyjętej wartości odcinającej ( cut-off-value) - dodatni wynik testu.

Czułość diagnostyczna = PD / [PD + FU]

Swoistość diagnostyczna to prawdopodobieństwo wyniku nizszego od wartości odcinającej u osób bez nowotworu.- ujemny wynik testu.

Swoistość diagnostyczna = PU / [PU + FD]

Dodatnia wartość predykcyjna określa prawdopodobieństwo stwierdzenia obecności nowotworu na podstawie dodatniego wyniku testu

Dodatnia wartość predykcyjna = PD / [PD - FD]

Ujemna wartość predykcyjna stanowi prawdopodobieństwo wykluczenia obecności nowotworu przy ujemnym wyniku testu.

Ujemna wartość predykcyjna = PU / [PU + FU]

Krzywa ROC.

Biomarkery:

- diagnostyczny (skriningowy)

- prognostyczny)

- stratyfikacji (predykcji)

Diagnostyczny

- używany do wykrywania i identyfikacji typu nowotworu

- powinien posiadać wysoką czułość i wysoką swoistość diagnostyczną np. obecność białka Bence - Jonesa

Prognostyczny

- stan choroby został ustalony

- pozwalają przewidzieć prawdopodobieństwo choroby, włączając jej nawrót od niech zalezy agresywność terapii np. potworniaku jądra, HCG, AFP

Stratyfikacji

- przewidywanie odpowiedzi na leki przed rozpoczęciem leczenia

- klasyfikacja pacjentów n atych, którzy odpowiadają na szczególny rodzaj leczenia i tych którzy nie zareagują

Biomarker prognostyczny: określa wpływ charakteru nowotworu na chorego, informuje o wyniku leczenia, niezależnie od jego rodzaju.

Biomarker predykcyjny - określa wpływ rodzaju leczenia na nowotwór, dostarcza informacji o wyniku określonego leczenia

Zastosowanie biomarker nowotworowego

Skrinnig

Diagnozowanie

Prognozowanie

stopniowanie choroby

Wczesne wykrywanie nawrotów choroby -> użyteczność jest kontrowersyjna

Przewidywanie odpowiedzi na leczenie

Monuitorowanie skuteczności leczenia

Skrinning

Test przesiewowy powinien mieć bardzo wysoką czułość wyjątkową specyficzność

W celu wniknięcia zbyt wielu fałszywie pozytywnych wyników w populacji z niskim wskaźnikiem wystąpienia nowotworów

	Marker	Nowotwór	Czułość
Markery surowicze, typowe markery nowotworowe	PSA - swoisty antygen sterczowy	Rak prostaty (badanie prostaty po 50 r.ż, po 40 r.ż - predyspozycje	65%
		AFP	Pierwotny rak wątroby (po wirusowym zapaleniu wątroby typu C, B)	70%
		Beta HCG		100%
		Kalcytonina (rodzaj raka tarczycy)	MEN 2	100%
	Krew utajona w kale	Rak jelita grubego	80%
Markery komórkowe	Cytologia szyjki macicy DNA HPV	Rak szyjki macicy	85-95%
						80%
				Mutacja BRCA 1 i 2	Rak piersi Rak jajnika	100%/50-85%
						100%/23-63%
		Mutacja APC	Rodzinna polipowatość gruczalakowata	100%/100%
		Mutacja MSH 2, MSH 1	Nie polipowaty rak jelita grubego	100%/80%

Diagnozowanie

- niska czułość i swoistość diagnostyczna ogranicza zastosowanie markerów nowotworowych w diagnostyce.

Prognozowanie:

- większość markerów nowotworowych ma wartość prognostyczną

Stopniowanie choroby

- z wyjątkiem AFP i HCG dokładność markerów w określeniu stadium choroby jest zła

Wczesne wykrywanie nawrotów choroby

- klinicznie wznowa może zdarzyć się bez wzrostu stężenia biomarkera

- wzrost stężenia biomarkerów może być niespecyficzny.

Przewidywanie odpowiedzi na leczenia

- bardzo niewiele markerów ma moc predykcyjną ( wyjątkiem są receptory hormonów steroidowych i amplifikacja HER 2 dla raka piersi) ale dostarczają informacji na temat kwalifikacji do leczenia

Monitorowanie skuteczności leczenia

Obecnie biomarkery dostarczają informacji na temat odpowiedzi na leczenie (skuteczna, nieskuteczna)

Analiza kinetyczna

warunkiem wykorzystania markerow w ocenie skutecznosci leczenia chorych jest rygorystyczne przestrzeganie zasady czestotliwosci oznaczania markerow - analiza kinetyczna tj. Wzglednie czeste powtarzanie badania w celu wykreslania krzywej zaleznosci zmian stezenia markera od czasu.

Dla kazdego markera przewidziana jest optymalna czestotliwosc badania: od 1 miesiaca do 0,5 roku, zalezna od czasu jaki uplynal od momentu zabeigu chirurgicznego czy zakonczenia terapeutycznego.

Czestotliowosc oznaczania markerow:

przed rozpoczeciem leczenia okresla sie stezenie poczatkowe,podstawowe, z ktorym porownuje sie wszystkie nastepne,

po leczeniu radykalnym:

a. monitorowanie w ciagu pierwszych pieciu lat

-co 2-3 miesiace w pierwszych dwoch latach

-co pol roku w trzecim do piatego roku

b. monitorowanie po 5 latach:

-raz w roku (nie zawsze jest konieczne)

c. co 2 do 4 tygodni gdy stezenie jest podwyzszone lub narasta

d. gdy podejrzewa sie wystapienie wznowy lub przerzutow

po radioterapii:

-zasady odnosnie czestosci wykonywania oznaczen markerow po zakonczeniu leczenia napromienianiem narzuca rodzaj leczenia(radykalne lub paliatywne)

w czasie chemioterapii

-przed rozpoczeciem i przed kazdym kolejnym cyklem chemioterapii (okresy okolo 6-tygodniowe)

Klasyfikacja biomarkerów nowotworowych.

1.Antygeny płodowe i zarodkowe

2.Antygeny łożyskowe

3.Glikoproteiny mucynowe

4.Enzymy

5.Cytokreatyny

6.Inne markery - białka

7.Hormony

8.Markery DNA

9.Receptory

Biomarker:

- DNA

- RNA

- białkowe markery - oznaczanie w surowicy, moczu, w tkankach/

Cancer Biomarker Database

- markery oznaczanie we krwi

- markery oznaczanie w innych rodzajach materiału biologicznego ( tkanki, mocz, kał, ślina)

Rodzaje biomarkerów nowotowrowych:

• neoantygeny - antygeny swoiste nowotworów ( ang. Tumor specific antigens - TSA)

• antygeny towarzyszące nowotworom (ang. Tumor associated antigens - TAA)

Neoantygeny mają wieksza wartość diagnostyczną, nistety obecnie oznaczane są głównie antygeny towarzyszące nowotworom.

Rodzaje markerów nowotworowych:

• markery nowotworowe krążące, humoralne
  - wydzielane przez kom. now. do płynów ustrojowych (krew, mocz, wysięki, przesięki, pmr)
  > wykrywane metodami biochemicznymi
  

• markery nowotworowe komórkowe:
  - występujące w komórkach
  > wykrywane w komórkach za pomoca met. cytochemicznych,
  > w tkankach - met. immunohistochemicznymi w cytozolu lub sondami molekularnymi w jadrze.

Klasyfikacja markerów krążących

Antygeny płodowe i zarodkowe:

-występują w tkankach i surowicy krwi płodu,normalnie znikają w kilka dni po urodzeniu

-pojawiają się w komórkach nowotworowych wskutek ekspresji odpowiedniego genu,

-należą do nich:

-antygen karcynoembrionalny,antygen rakowo-płodowy, CEA

-alfa-fetoproteina,białko płodowe alfa,AFP

Antygeny łożyskowe

-występują w surowicy krwi kobiet ciężarnych i znikają po porodzie

-należą do nich:

-ludzka gonadotropina kosmówkowa, podjednostka beta , beta-HCG

-laktogen łożyskowy,HPL

-białko ciążowe SP-1 ( swoista beta-1 glikoproteina)

-łożyskowe fosfataza zasadowa,PLAP

Glikoproteiny mucynowe (antygeny pochodzenia nabłonkowego, antygeny trasplantacyjne)

antygen nowotworowy 15-3 (CA 15-3) - episiolina

-antygen nowotworowy 125 (CA 125)

-antygen nowotworowy 19-9 (CA 19-9)

-antygen nowotworowy 50 (CA 50) - nieswoisty, rzadko oznaczany

-antygen nowotworowy 72-4 (CA 72-4)

Cytokratyny

-tkanowy swoisty antygen polipeptydowy TPS

-tkankowy antygen polipeptydowy,TPA

-CYFRA 21-1, fragment cytokeratyny 19,

Inne białka

-antygen raka płaskonabłonkowego,SCC-Ag

NH P22, S100, BTA PSMA BZM, CgA, HE4

Hormony polipeptydowe

- przysadki

- tarczycy

- przytarczyc

Receptory

- receptory hormonów steroidowych ER, PR

- HER 2

- receptory cytokin

Markery DNA: BRCA 1, 2

Na poszczególnych etapach rozwoju komórki produkowane są różnorodne markery:

1. marker proliferacji , którego stężenie koreluje z intensywnością podziału komórki np. TPS

2. markery różnicowania, których stężenia zależa od masy żywych komórek ;

CEA , AFP , HCG , CA 125, CA 19-9, CA 15-3, CA 549, MCA, BCM, PSA i inne

3. markery obumierania komórki, których stężenia korelują z rozpadem komórek : TPA, CYFRA 21.1

Antygeny towarzyszące nowotworom

Antygen karcynoembrionalny,antygen rakowo-płodowy,CEA

wytwarzany w prawidłowych tkankach płodu,przede wszystkim w przewodzie pokarmowym i trzustce

zakres wart. Referencyjnych

< 2,5 ng/ml (u niepalących)

< 5 ng/ml (u palących)

- jest to marker niespecyficzny

Umiarkowane zwiększenie stężenia CEA mogą powodować :

1. ciąża

2. nienowotworowe choroby

Czułość CEA dla rozpoznania jelita grubego, żołądka, trzustki, wątroby wynosi 30 do 85 % w zależności od typu i stopnia zaawansowania choroby.

Dla nowotworów o innej lokalizacji ( płuca, gruczoł krokowy, macica, jajniki, tarczyca) jest jeszcze niższa.

CEA może być używany do badań przesiewowych w kierunku jakiegokolwiek guza.

Natomiast jest przydatny w monitorowaniu terapii i określeniu rokowania.

Alfa-fetoproteina, Białko płodowe alfa, AFP

Białko syntetyzowane głównie w wątrobie, przewodzie pokarmowym i w pęcherzyku żółtkowym płodu

Wartości referencyjne : < 15 ng/ml

Stężenie AFP jest podwyższone:

• u kobiet w ciąży z maksimum w 32-36 tygodniu; wyniki oznaczeń w tym okresie mają znaczenie w diagnostyce prenatalnej

• podczas procesów regeneracyjnych wątroby, np. w przewlekłym zapaleniu lub marskości ( do 500 ng/ml )

• w pierwotnym raku wątroby ( u 50 % AFP > 10 000 ng/ml )

• u 5-15 % chorych z przerzutami do wątroby nowotworów o innej lokalizacji ( < 100 ng/ml )

• w zarodkowokomórkowych postaciach raka jąder i jajników

W badaniach przesiewowych

• u pacjentów z przewlekłym, aktywnym zapaleniem wątroby typu B, którzy stanowią grupę ryzyka rozwoju hepatoma

• w połączeniu z β-HCG u pacjentów obarczonych czynnikami ryzyka rozwoju nowotworów wywodzących się z komórek płodowych.

Ludzka gonadotropina kosmówkowa, HCG

Hormon glikoproteinowy zbudowany z dwóch podjednostek α ( niespecyficznych ) i β ( specyficznych ) syntetyzowany przez komórki syncytiotrofoblastu łożyska.

Zakres wartości referencyjnych : 0-5 IU/l

U kobiet nieciężarnych zwiększenie stężenia wskazuje na obecność zmian nowotworowych.

Stężenie HCG w surowicy może być podwyższone w pierwotnych nowotworach wywodzących się z komórek rozrodczych:

• nabłoniak kosmówkowy jądra lub jajnika,

• guzy komórek zarodkowych,

• rak jajnika i inne.

HCG używa się w:

• badaniach przesiewowych w grupie pacjentów o zwiększonym ryzyku wystąpienia nabłoniaka kosmówkowego ( pacjenci po przebytym zaśniadzie groniastym ),

• do monitorowania terapii ww. nowotworów złośliwych ( zwykle łączenie z AFP ),

• do wykrywania wznowy.

METODY BIOCHEMICZNE OZNACZANIA MARKERÓW KRĄŻĄCYCH

oznaczania krążących mark. nowo. stosowane są metody immunochemiczne:

1. metoda immunoenzymatyczna EIA
   a. technika MEIA
   b. technika ELISA

2. Matody radioimmunologiczne - RIA

3. Metody immunochemiliminescencyjne CLIA

4. Metody immunofluorescencyjne FIA

METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ OZNACZANIA MARKERÓW KOMÓRKOWYCH

Zaburzenia genetyczne pojawiające się w komórkach nowot. można analizowac na poziomie DNA i RNA a także poprzez ocene białkowych produktów genów.

1. Badania oparte na analizie DNA ( PCR, Southern blotting, FISH)

2. Badania oparte na analizie RNA (RT-PCR, Northern blotting)

3. Badania oparte na analizie białek:
   a. met immunohistochemiczna
   b. met immunocytochemiczna,
   c. test radioimmunologiczny, RIA,
   d. test immunoenzymatyczny, ELISA.

9

by Anna

Ograniczona użyteczność biomarkerów

Wysoka użyteczność biomarkerów

---