BIOLOGIA MOLEKULARNA Z CYTOGENETYKĄ

WYKŁAD 1

Chromosomy - stałe składniki jądra komórkowego

DNA jest polimerem (polinukleotydem)

Konformacje DNA

B:

• większość DNA w jądrach

• prawoskrętna

• średnica spirali 20 nm

• całkowity skręt 34 nm, na jeden skręt 10 nukleotydów, odległość między nimi 3,4 nm

• wewnątrz spirali zasady są odchylone od osi o -6˚

• występuje w warunkach uwodnionych

A:

• mniejsze uwodnienie

• jeden skręt 11 nukleotydów

• odchylenie zasad od osi o +20˚

• duży rowek szerszy ale płytszy

• prawoskrętna

Z:

• w warunkach laboratoryjnych i w pewnych partiach genomu

• lewoskrętna

• jeden skręt 12 nukleotydów

• reszty fosforanowe łączące nukleotydy są ułożone zygzagowato

• występuje w partiach Z-DNA (naprzemiennie puryna, pirymidyna)

• najmniej stabilna

Inne formy DNA:

1. trójniciowe DNA

- w odcinkach homopurynowych lub homopirymidynowych

• u Eukaryota co 150 pz

2. krzyżowe, pętle (formy przestrzenne)

• w palindromowych sekwencjach DNA (prostych i złożonych)

• głównie w sekwencjach regulatorowych

Rodzaje wiązań w cząsteczce DNA:

1. kowalencyjne:

• silne chemicznie

• powstają na skutek wspólnych elektronów między atomami

• w zasadach i cukrach: węglowe (C-C), N-glikozydowe (C-N), C-H, C-O, O-H, N-H, połączenia fosfodwuestrowe między 5` węglem rybozy i 3` węglem kolejnej rybozy

2. słabe między atomem np. O (negatywnie naładowanym) a atomem H (pozytywnie naładowany)

3. mostki hydrofobowe - połączenia miedzy stosami par zasad tworzących rdzeń hydrofobowy, połączenia niepolarnych grup z każdą inną grupą obecną w r-r

Z punktu widzenia chemicznego dla struktury DNA ważna jest pozycja atomów H w zasadach purynowych i pirymidynowych. Ta pozycja jest stała, ale czasem zdarzają się przemieszczenia typu tautomerycznego - TAUTOMERIA. Może być to przyczyna błędu replikacyjnego.

Atomy N w pierścieniach purynowych i pirymidynowych łączą się z H w grupę:

Aminową NH₂

Iminową NH

Aminowa grupa może przyłączać inne mutacja

Atomy C w guaninie i tyminie w pozycji 6` przyłaczają at. O tworząc połaczenia:

Ketonowe (C=O)

Enolowe (COH)

Jakie warunki spełnia DNA jeżeli jest materiałem genetycznym:

1. stabilność w czasie przemian metabolicznych - DNA nie ulega degradacji i nie jest syntetyzowane de novo w każdym cyklu komórkowym

2. precyzyjne samoodtwarzanie się - w okresie S interfazy replikacja jest kontrolowana przez czynniki replikacyjne

3. rozmaitość molekularno - gatunkowa - sekwencja w każdego organizmu jest inna

4. ulega mutacjom i może być reperowany

Nukleosom:

• podstawowa jednostka strukturalna chromatyny

• sposób połączenia DNA z histonami

• 
  oktamer histonowy + DNA (146 pz styka się z rdzeniem)

2H2A

2H2B

2H3 rdzeń nukleosomu

2H4

H1 - łączy miejsce zejścia i wejścia DNA na oktamer

200 pz łączy się z rdzeniem i H1

Histony rdzeniowe mają ogony N i C:

N:

• wystają z nukleosomu na zewnątrz

• występują aminokwasy modyfikowane chemicznie - mogą być acetylowane, metylowane, ADP-rybozylowane, fosforylowane, modyfikacji ulega głównie lizyna. Modyfikacje H3 i H4 są zwiazanez aktywnością genów. Modyfikacja histonów to przykład reakcji epigenetycznych

C:

• schowane wewnątrz nukleosomu

2 frakcje chromatyny:

1. euchromatyna:

• słabo się barwi

• rozproszona

• aktywna genetycznie

2. heterochromatyna

• intensywnie się barwi

• silnie skondensowana

• nieczynna genetycznie

• późno się replikuje w fazie S

a/ fakultatywna - okresowo wyłączona euchromatyna

b/ konstytutywna - obszar genomu zawsze nieczynny

WYKŁAD 2

Każdy chromosom zawiera jedną cząsteczkę DNA. Chromosom ma 2 końce, aby poszczególne cząsteczki nie zlewały się ze sobą. Na końcach występują sekwencje telomerowe, częściowo palindromowe, tworzą charakterystyczną strukturę przestrzenną w kształcie spinki do włosów, przyłączają się do nich specyficzne białka telomerowe - zabezpieczają przed strawieniem.

Struktury ORI - miejsca startu replikacji DNA, w chromosomach Euk. jest ich dużo

Sekwencje centromeroweb (kinetochorowe) - gromadzą się specyficzne białka budujące centromer i kinetochory. Centromer wraz z kinetochorem jest ośrodkiem ruchu chromosomów i jest zaangażowany w segregację chromosomów (mitoza/mejoza)

Te trzy struktury warunkują istnienie chromosomów.

Pary chromosomów homologicznych - para chromosomów tej samej długości o tych samych cechach morfologicznych i o identycznie zorganizowanej, tej samej informacji genetycznej. W mejozie koniugują ze sobą tylko chromosomy homologiczne

Genom - haploidalna, podstawowa liczba chromosomów, charakterystyczna dla danej jednostki taksonomicznej

Wielkość chromosomów 0,2μm - 50μ m 9dł), wielkość chromosomów mierzy się również ilością par zasad.

Kształty chromosomów są wyznaczone przez położenie centromeru, centromer zawsze występuje w przewężeniu pierwotnym, odcina ramiona o różnej długości:

1. ch metacentryczny - centromer na środku dł chromosomomu, odcina ramiona równej długości

2. ch submetacentrychny - niedokładnie na środku

3. ch akrocentryczny - jedno ramię bardzo krótkkie

4. ch telocentryczny - centromer bardzo blisko końca chromosomów

Chromosom przed replikacą nie jest podzielony na 2 równe połówki, dopiero po replikacji tworzą się 2 chromatyny podtrzymywane przez centromer.

Niektóry chromosomy w danym zespole posiadają przewężenie wtórne - to miejsce lokalizacji zbioru genów rybosomalnych (rDNA), nazywają się organizatorem jąderkotwórczym (NOR). Odcina on fragment zwany satelitą. Chromosomy posiadające satelitę to SATchromosomy (zawsze posiadają NOR)

Występowanie charakterystycznych prążków w chromosomie:

Heterochromatyna konstytutywna zajmująca stałe miejsce w chromosomie

Zrąb chromosomowy - występują w nim 2 białka:

1. topoizomeraza 2 - jest to enzym wpływający na właściwe zachowanie się struktury DNA w fazie S i również zaangażowanie się w skracanie chromosomu

2. SMC - białka utrzymujące strukturę chromosomu

WYKŁAD 3

3` koniec - gr nieaktywna OH (od OH zaczyna się replikacja)

5` koniec - reszta fosforanowa nieaktywna

DNA jest zmienny sekwencyjnie (u Euk są 4 frakcje sekwencyjne):
1) palindromy (sekwencje palindromowe)

• 1-2% w genomie haploidalnycm

• ciągi sekwencji które czytane od końca 5` i 3` dają taki sam wyraz (tą samą informację)

• w miejscach palindromowych DNA może przybierać różne struktury przestrzenne, są one miejscem rozpoznawanym przez wiele białek regulatorowych wpływających (kontrolujących) aktywność wielu genów obszaru DNA w którym palindromy występują

• występują w obszarach regulatorowych genomu

• w telomerach są sekwencje palindromowe struktura spinki do włosów

2. umiarkowanie powtarzalne sekwencje

• ok. 30%

• tworzą ją np. geny kodujące rRNA(występują w setkach kopii ułożonych jedna za drugą) i tRNA

• występują tu rodziny genowe powtórzone setki, tysiące razy np. rodzina genów rybosomalnych i rodzina genów tRNA

• sekwencje regulatorowe

• sekwencje pochodzenia pseudogenowego

• sekwencje ruchome

3. wysoce powtarzalne sekwencje

• często z 2) tworzą frakcję powtórzonych sekwencji, różniących się ilością powtórzeń

• powtórzenia setki tysięcy i miliony razy

• skład powtórzeń rózny u różnych organizmów

• w chromosomach, wokół centromerów, w poblizu telomerów, interkalarnie

• specyficzna frakcja ze względu na:

a/strukturę: powtórki tandemowe DNA zmetylowany, silnie zespiralizowany odpowiada obszarom heterochromatyny konstytutywnej

b/funkcję

4. sekwencje unikatowe

• 50% całego DNA

• ,,pojedyncze kopie motywów sekwencyjnych”

• są powtórzone ok. 20 razy

• są to geny aktywne, kodujące białka

• ich występowanie jest niezwykłe - są one ulokowane wśród sekwencji wysoce powtarzalnych

• np. pewne geny (800-2000pz) są umieszczone między 300-600 sekwencji powtarzanej frakcji

DOŚWIADCZENIE DYSOCJACJI - REASOCJACJI DNA

• pokazuje zróżnicowanie sekwencji DNA

• dwuniciowy DNA absorbuje światło UV o dł fali 260 nm a w formie jednoniciowej wzrasta o ok. 1/3 tej długości fali dając efekt hyperchromatyczny

• biochemicznie cząsteczka DNA jest jednorodna, ale jest zróżnicowana sekwencyjnie. Można to wykazać w wyniku przeprowadzenia doświadczenia dysocjacji - reasocjacji DNA:

1. próbkę DNA izoluje się i oczyszcza z dostępnej tkanki

2. umieszcza się ją w r-r soli fizjologicznej i poddaje się ją sonikacji (cięcie ultradźwiękami) - wielkość cząsteczek jest ważna w doświadczeniu ponieważ mniejsze cząsteczki są ruchliwsze i łatwiej odnajdują segmenty homologiczne w r-r

3. pomiar absorbcji światła, dł fali

4. zamyka się zbiorniczek z DNA i podgrzewa do 100°C

5. mierzy się poziom absorbcji UV, wzrasta on od 1-1,5 raza DNA rozdziela się na pojedyncze nici (topienie DNA

Od czego zależy temperatura topnienia?:

• od składu zasad więcej par G-C trzy mostki wodorowe wyższa temp.

• Sekwencja zasad w DNA ustala zakres temp. topnienia cząsteczki DNA

1. gwałtowne schłodzenie do 65°C (optymalne środowisko jonowe dla reasocjacji ponowne łączenie 2 nici DNA). W czasie reasocjacji spada absorbcja UV. Reasocjacja nie odtwarza w 100% wyjściowej cząsteczki (jest to skutek występowania w DNA różnych frakcji sekwencyjnych)

stężenie DNA w r-r wpływa na reasocjację:

• bardzo rozcieńczony r-r długi czas reasocjacji

• większe stężenie czas reasocjacji krótszy

DZIAŁANIE SPECYFICZNYCH ENZYMÓW BAKTERYJNYCH = RESTRYKCYJNYCH = RESTRYKCYJNE ENDONUKLEAZY

Bakterie rozporządzają specjalnymi enzymami:

1. modyfikacyjnymi - enzymy metyujące, które przyłączają grupy metylowe do zasad (A), która występuje w określonym miejscu na DNA

2. restrykcyjnymi - hydrolizują DNA nie zawierający zmetylowanych zasad w odpowiednim wzorze metylacji

1 i 2 jest to system obronny bakterii przed bakteriofagami (bakteriofag ma inny wzór metylacji, jest atakowany i hydrolizowany). Bakterie tną szkielet fosforowo węglowy i degradują go.

WYKŁAD 4

Enzymy restrykcyjne rozpoznają określone geny w genomie. Służą do tworzenia map genetycznych i markerów molekularnych RFLP.

Enzymy restrykcyjne działają na każde DNA, nie tylko na bakteriofagi.

Markery RFLP - jest to różna długość fragmentów DNA pociętych przez jeden enzym u różnych gatunków np. człowiek i muszka

RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

Restryktazy dzieli się na 3 klasy:

Klasa	Kofaktor	Struktura	Msc rozpoznania DNA	Cechy cięcia	Np.
I	ATP, Mg2+, S-adenozyl-metionina	Kompleksowy, 500-600 kDal, 3 oddzielne podjednostki	13-15 pz, zawierają zakłócenia 6-8 pz	Niespecyficzne, w oddaleniu od msc rozpoznania	EcoK
II	Mg2+	Zwykłe homodimery o 20-77 kDal	4-8pz zwykle symetrii rotacyjnej 180°	Precyzyjne w msc rozpoznania lub blisko niego, lepkie końce	EcoR1
III	ATP, Mg2+, S-adenozyl- metionina (stymulator)	Heterodimery, z podjednostkami 70-100kDal	5-6 pz, bez symetrii rotacyjnej	Precyzyjne w ustalonej odległości od 3` do rozpoznanej sekw.	EcoP1

Przykłady enzymów restrykcyjnych:

Alu I

- Sekwencje cięte głównie w genomie ludzkim

• wyizolowany z Arthrobacter luteus

• rozpoznaje sekwencje 4-nukleotydowe

5`AG*CT

3`TC*GA tępe końce * miejsce cięcia

Bfa I

• z Bacteroides fragilis

5`C*TAG

3`GAT*C lepkie końce

Nci I

• z Neiseria cinera

• może rozpoznawać miejsca niekomplementarne tylko na jednej nici

5`CC*GGG

3`GG*CCC tępe końce


EcoR I

• z E.coli

5`G*AATTC

3`CTTAA*G lepkie końce

Hae II

• z Haemophilus aegyptius

5` PurPurGCGC

3` PirPirCGCG

Bgl I

• z Bacillus globigii

• sekwencja palindromowa

5`GCCN*NNNNGGC

3`CGGNNNN*NCCG N-jakiś nukleotyd

Nazwy enzymów restrykcyjnych:

Pierwsza litera - rodzaj bakterii z której wyizolowano

Druga i trzecia litera - nazwa gatunkowa

Czwarta - szczególny szczep organizmu

Rzymskie cyfry - kolejność izolacji enzymów

Każda restryktaza przesuwa się (skanuje) wzdłuż cząsteczki DNA i zatrzymuje się kiedy rozpoznaje specyficzną sekwencję nukleotydową. W tym miejscu lub w pobliżu enzym katalizuje hydrolizę połączenia fosfodiestrowego na każdej nici DNA. Powstają dwa fragmenty, każdy z grupą fosforanową na 5` i hydroksylową na 3`.

Enzymy mogą ciąć 2 nici DNA w tym samym miejscu tępe (ślepe) końce

Inne tną nici nie centralnie lepkie końce (zachodzące), są użyteczne w technologii rekombinacji DNA

W procesie rekombinacji lepkie końce mogą się połączyć z innymi lepkimi końcami w obecności ligazy - enzym reparacyjny.

Trawienie dużych cząsteczek DNA za pomocą restryktaz produkuje mniejsze fragmenty DNA, których wielkość może być określona za pomocą elektroforezy żelowej. Rozdzielone fragmenty na żelu są bezbarwne, jeżeli doda się barwnik np. bromek etydyny to prążki są widoczne.

Zastosowanie restryktaz do:

• klonowanie genów lub fragmentów DNA

• tworzenie map restrykcyjnych - diagramatyczne przedstawienie cząsteczki DNA, w którym widoczne są miejsca restrykcyjne dla różnych enzymów z określonymi odległościami między nimi.

• Podstawa markerów molekularnych RFLP

WYKŁAD 5

GENY SKACZĄCE = GENETYCZNE ELEMENTY RUCHOME = TRANSPOZONY

Transpozycja - działanie genetycznych elementów ruchomych

Transpozony - uruchamiają się w warunkach stresowych. Mają pochodzenie:

1. wiralne - retrotranspozony - ma odwrotną transkryptazę i inne enzymy charakterystyczne dla wirusów np. Rnaza - H - rybonukleaza

2. niewiralne - transpozony - nie mają odwrotnej transkryptazy, mają specyficzne powtórki sekwencyjne

Genetyczne elementy ruchome u Proc.:

1. proste elementy wstawkowe IS - liczą 800-1200pz, zakończone prostymi odwracalnymi powtórkami

2. transpozony złożone - duże z kilku elementów IS, w których mogą występować określone geny np. odporności na antybiotyki

3. duże bakteriofagi np. Mu

często elementy ruchome u bakterii wchodzą w skład plazmidów, umożliwiają wstawienie genów z plazmidu do nukleoidu. Dzięki temu bakterie nabywają bardzo szybko odporność na antybiotyki.

U Euc. genetyczne elementy ruchome charakteryzują się dużą zmiennością strukturalną. Dzielą się na 2 klasy na podstawie mechanizmu przemieszczania się z jednego miejsca w genomie w inne:

1. transpozony - replikują się za pośrednictwem DNA, a przemieszczają się za pomocą mechanizmu ,,wycinanie - wklejanie”. Następuje wycinanie elementu z jednego miejsca i wstawianie go do nowego miejsca w genomowym DNA. Większość transpozonów jest zakotwiczona prostymi odwracalnymi sekwencjami. Pomiędzy sekwencjami terminalnymi są sekwencje nukleotydowe niepowtórzone, które kodują przynajmniej 1 białko - enzym transpozazę

transpozaza - rozpoznaje sekwencje nukleotydowe na końcach transpozonu, wycina element w tych miejscach, przybliża do nowego miejsca w którym zygzakowato nacina (lepkie końce) i wstawia tam element, który za pomocą ligazy jest ligowany. Niektóre tranzpozazy nacinają losowo miejsca, inne muszą mieć sekwencje sygnalne specyficzne i tylko tam wstawiają elementy.

Każdy transpozon zostawia ,,foot print” dlatego że często wycięcie i wstawienie elementu nie jest precyzyjne. Dzięki temu można rozpoznać gdzie był transpozon i gdzie się przemieścił.

Kto pierwszy odkrył transpozon?:

Lata 1940 dr Barbara McClintock badając mozaikowate zabarwienie aleuronów ziarniaków kukurydzy stwierdziła, że cecha ta jest niestabilna i nie dziedziczy się zgodnie z prawami Mendla. Wytłumaczyła ze ta cecha jest wywołana przez genetyczne elementy ruchome - aktywator/dysocjator (Ac/Ds) Podobnych elementów odkryto bardzo wiele.

Ac/Ds

Ac - normalnie działający transpozon

Ds - forma mutacyjna Ac

Sam Ds. nie może się poruszać i jest zatrzymywany w komórce w postaci sekwencji nomadycznych, nie ma genów potrzebnych do poruszania. Wystarczy tylko 1 Ac i Ds. może się poruszać dzięki transpozazie kodowanej przez Ac.

Transpozon Ac:

• prosty, 4563 pz

• na obu końcach ma odwrócone powtórki (11 razy) motywu 200pz

• ma sekwencje kodujące mRNA o 3500pz, który ulega transpozycji na białko transpozazę

• dla transpozycji kluczowe są terminalne powtórki 200 pz

• transpozaza łączy się do heksameru, rozpoznaje go i powoduje wycinanie elementów

• tam gdzie Ac jest wstawiony po obu stronach wstawienia powstają proste powtórki liczące 8 pz - foot print

Forma Ds.:

- wadliwa np. posiada delecje w obszarze genu transpozazy i dlatego nie może się poruszać

Inne elementy transpozycyjne:

• En/Spm - kukurydza

• Mu1 - kukurydza

• Tam1 - lwia paszcza

2. retrotranspozony - replikują się za pośrednictwem RNA, do tego służy gen kodujący odwrotną transkryptazę (na nici RNA odbudowuje DNA i wstawia je do genomu). Ta klasa jest bardziej zróznicowana sekwencyjnie niż transpozony, bo odwrotna transkryptaza nie ma właściwości polimerazy DNA, która sprawdza prawidłowość czytania nici wzorcowej w czasie replikacji. Mogą być pochodzenia:

a/ wirusowe (prowiralne) - spokrewnione z retrowirusami. Występują głównie u ssaków. Wszystkie koduja własną odwrotną transkryptazę i mają długie terminalne powtórki (LTR) zakończone 5`TG…CA3`. Nie mają genów kodujących cząsteczki infekcyjne.

b/ retroelementy pochodzące od pseudogenów - nie mają LTR na końcach, ale mają gen odwrotnej transkryptazy (sugeruje to pochodzenie od pseudogenów). Mają krótszą sekwencję poly A na końcu 3`. Świadczy to o tym, że gen był czytany mRNA był wadliwy spowrotem wstawiany do genu jako retroelement.

Np. Alu u ludzi pochodzi z pseudogenu 7SScRNA

Budowa retrotranspozonów:

• na obu końcach LTR

• w środku występują sekwencje kodujące:

gag - koduje białko łączące się z kwasami nukleinowymi. U wirusa jest to białko redzenia

prot - gen kodujący proteazę, tnącą produkt transkrypcji

RT - odwrotna transkryptaza

Rnaza H - rybonukleaza tnąca RNA

endo - endonukleaza potrzebna do integracji elementu w genom gospodarza

Retroelementy są obficie reprezentowane. Występują ich różne typy. Są to elementy: Ty, copia, gypsy, P.

Oprócz odwrotnej transkryptazy wszystkie retroelementy mają integrazę - katalizuje wstawianie elementu.

PSEUDOGENY

Ogólna organizacja genomu Euc.:

• podzielony na chromosomy

• każdy chromosom: DNA + histony

• każdy chromosom zawiera określoną grupę genów i sekwencji niekodujących (funkcja strukturalna lub regulatorowa)

• nie wszystkie chromosomy mają równą liczbę genów

Jak gen występuje w chromosomach:

• rzadko pojedynczo

• mają tendencję do występowania w rodzinach genów

• rodzina genów to geny które mogą kodować odmienne, ale spokrewnione produkty. Np. rodzina genów immunoglobulinowych, hemoglobulinowych, tubulinowych.

Wśród rodzin są geny funkcjonalne (aktywne sekwencje kodujące) i błędne kopie genów (pseudogeny)

Pseudogeny:

- ulegają mutacji i przechowują mutację

• mogą ulegać transkrypcji ale mogą nie ulegać translacji

• jeżeli podlegają translacji tworzy się białko niefunkcjonalne niszczone w proteosomach

• mogą w ogóle nie być transkrybowane

2 typy pseudogenów:

1. pseudogeny powstające na skutek mutacji w genie funkcjonalnym, powodującej uszkodzenie genu tak, że nie może się połączyć z kompleksem transkrypcyjnym

2. pseudogeny powstające w czasie obróbki pierwotnego transkryptu. Nie mają sekwencji promotorowych. Ich sekwencja przypomina sekwencję mRNA po obróbce potranskrypcyjnej - pseudogeny obróbkowe.

WYKŁAD 6

VNTR:

• sekwencje zmienne powtarzane tandemowo

• dzielą się na minisatelity i mikrosatelity

MINISATELITY:

• jednostki sekwencyjne 6-100 pz powtórzone 500-kilka tysięcy razy w genomie

• odkryte w genomie ludzkim w latach 80-tych (Wymann i White) w czasie sekwencjonowania ludzkiego genomu

• mają rdzeń sekwencyjny podobny do sekwencji w bakteriofagu lambda:

bakteriofag:

GCTGTGG

minisatelita np.:

...CGGCGAT CGGCGAC CGGAGAT CGGCGAT

CGGCGAT CGGAGAT CGACGAT…

Taki motyw sekwencyjny może być powtórzony kilka tysięcy razy. Jest to jednostka powtórki. Może ulegać mutacjom i jej długość może ulegać zmianom

• minisatelity - duży polimorfizm - marker genetyczny do identyfikacji poszczególnych osób (odcisk palca=finger print)

• nie są rozproszone równomiernie w genomie. Mają preferencyjne miejsca występowania np. w chromosomach w pobliżu końców

• występują u wszystkich organizmów

• jako markery: w medycynie, w badaniach nad etologią chorób diabetycznych, insulinozależnych, epilepsji i innych

• są stosowane w badaniach filogenetycznych (pokrewieństwa) nie tylko człowieka

• uczestniczą w funkcjonowaniu genomu:

1. niektóre minisatelity stanowią część otwartych ramek odczytu (zakres między którymi zawarta jest informacja genetyczna) - są częścią genu, mogą wykazywać polimorfizm (zmienność tego genu) w zależności gdzie jest wbudowany i ile razy powtórzony

2. mogą być rozpoznawane przez pewne specyficzne białka mające domeny łączące się z odpowiednią sekwencją DNA. przyciągają te białka i funkcja genu może dzięki temu ulec zmianie (blokowanie genu lub jego aktywacja):

• minisatelity ulokowane w obszarze 5` (obszar kontrolny) może przyciągać białko wpływające na transkrypcję genu (blokowanie lub aktywacja)

• minisatelita włącza się w intronie - zakłócenie łączenia się intronów w czasie obróbki postranskrypcyjnej

• są geny piętnowane dziedziczone niezgodnie z prawami Mendla - dziedziczenie monoalleliczne - aktywowany jest gen piętnowany rodzicielsko (imprintingowany). Minisatelita może kontrolować to piętnowanie

3. mogą tworzyć kruche miejsca w chromosomach (miejsca mutacji) - które powodują łatwe pękanie chromosomu mutacje strukturalne chromosomów. Występują w miejscach rekombinacji części genów przeciwciał (są to geny składane)

Mutacje strukturalne:

• delecje (ubytki)

• duplikacje (podwajanie)

• inwersje (chromosom pęka w dwóch miejscach)

• translokacje

MIKROSATELITY:

• krótkie powtórki sekwencyjne

• 2-6 pz powtórzone setki - setki tysięcy razy

• maja tendencje do skracania i wydłużania a zmiany te nie są obojętne dla organizmu

• mają negatywny wpływ na organizm - sprzyjają powstawaniu chorób degeneracyjno - neurologicznych np. Huntingtona

• są wykorzystywane do diagnozowania chorób neurologicznych, raków, jako markery molekularne (SSR), w hodowli roślin i zwierząt

• diagnozowanie raków - we wczesnych stadiach rozwoju raka następują zmiany długości mikrosatelitów, na podstawie takich markerów można wykryć 1 komórkę rakową na 500 normalnych

• bakterie chorobotwórcze - występowanie mikrosatelitów związane z występowaniem charakteru patogenności. Bo błędy w replikacji mikrosatelitarnych sekwencji mogą prowadzić do utraty lub wstawienia jakichś nukleotydów co zmienia ramkę odczytu - bakteria nabywa lub traci pewne cechy

GENY ADAPTACYJNE U BAKTERII

• z łatwością są włączane lub wyłączane w odpowiedzi na czynniki środowiska i nadają bakteriom zdolność przystosowania się do zmian w środowisku

• mały % DNA

• mają mikrosatelity (przykład adaptacji ewolucyjnej)

• występują tylko u bakterii

u Euc. Mikrosatelity są używane do innych celów. Nie zaburzają odczytywania informacji genetycznej i nie prowadzą do powstania niefunkcjonalnych białek. Są równomiernie rozproszone w genomie.

Choroba Huntingtona:

• otępienie

• postępuje utrata kontroli ruchu

• białko huntingtona - gen kodujący to białko ma w obszarze przed sekwencjami kodującymi długie ciągi powtórzonych tripletów mikrosatelitarnych co prowadzi do dodania ciągu glutamin do łańcucha polipeptydowego (normalne białko- 10-30 glutamin, białko huntingtona - ok. 36 glutamin)

REPLIKACJA DNA I ODTWARZANIE CHROMATYNY

- etap inicjacji i replikacji inny u Proc i Euc

W genomie istnieją specyficzne sekwencje DNA, które kierują startem replikacji. Miejsca te to miejsca ORI w zależności od organizmu może być jedno lub wiele miejsc ORI.

Model inicjacji replikacji u bakterii (rok 1963)

• u bakterii cały nukleoid jest kulistym chromosomem z jednym ORI

• cały chromosom może być nazywany replikonem

• replikon - cały zreplikowany DNA od punktu ORI

• moment startu replikacji zakłada istnienie dwóch składników: inicjator i replikator

replikator - cis położone sekwencje DNA, kierujące inicjacją replikacji. Częścią replikatora zawsze jest ORI

inicjator - białko, które rozpoznaje specyficzne sekwencje DNA w replikatorze i aktywuje inicjację replikacji

Sekwencje DNA występujące w replikatorze maja dwie wspólne cechy:

1. mają miejsce łączenia dla białek inicjatorowych

2. zawierają ciągi AT - łatwo rozwijają się przy udziale białek inicjatorowych, których aktywność jest kontrolowana u większości organizmów

Sekwencje w replikatorze u bakterii: dwa motywy sekwencyjne krytyczne dla replikacji:

1. 5 powtórek sekwencji 9-cio nukleotydowych, które są msc łączenia białka DnaA

2. 3 powtórki 13-to nukleotydowe, które inicjują powstanie jednoniciowego DNA w czasie inicjacji

Cały ORI u bakterii liczy 245 pz

U drożdży ORI =ARS(autonomicznie replikujące się sekwencje)

• dł. 100pz

• składa się z trzech elementów

• A i B1 są msc przyłączania białek inicjatorowych

• element B2 ułatwia rozwijanie się DNA i przyłączania innych czynników replikacyjnych

U wirusa SV50 ORI składa się z 4 5-cio nukleotydowych miejsc łączenia P dla białka inicjatorowego - antygenu T oraz palindromu 20 pz, które jest miejscem rozwijania DNA. całe ORI 65pz.

WYKŁAD 7

MECHANIZM REPLIKACJI DNA

ORI u bakterii 245 pz

Motyw 9 pz:

• 5 rozproszonych powtórzeń

• wiązanie białka DnaA - ok. 30 cząsetczek

• tworzą baryłkę dookoła której nawija się DNA

• powstaje napięcie torsyjne, które rozłącza nici DNA

Motyw 13 pz:

• 3 powtórzenia

• rozłączenie nici DNA (bogate w AT)

• do oczka replikacyjego przyłącz się białko DnaB - helikaza i DnaC - helikazowy ładowacz

• przyłącza się polimeraza DNA i zaczyna replikować

aktywność DnaA zależy od obecności ATP. Po połączeniu ATP do DnaA zaczyna się oddziaływanie na DNA z rejonu motywu 13 pz. Te dodatkowe interakcje powodują rozdzielenie nici DNA na obszarze 20 pz w rejonie motywu 13pz.

Do replikacji potrzebne są dodatkowe białka replikacyjne które rekrutują DnaA

Kombinacja DnaA i ssDNA przyciąga kompleks 2 białek: DnaB i DnaC, które występują w 6 kopiach.

Helikaza DNA jest nieaktywna po połączeniu DnaC aktywacja. Helikaza przyciąga prymazę i następuje synteza tetrowego Rna na każdej nici ORI. Następnie przyciągana jest polimeraza III - holoenzym poprzez połączenie primer - wzorzec i przez helikazę.

U drożdży ARS:

• przyłączają się białka, które powodują powstanie oczka na odpowiedniej sekwencji

• B3 - odpowiednik 9pz

• B2 - odpowiednik 13pz

• B1 i A - na stałe związane białka - regulacja replikacji w cyklu komórkowym

• Oczko jest powiększane przez helikazy i potem przyłącza się plimeraza DNA

• B1 i A - kompleks rozpoznający ORC

• ABF - czynnik białkowy indukujący inicjację

Białka do rozpoznawania Ori C u bakterii:

DnaA - wiążą się z powtórzeniami 13pz i 9 pz (20-40 monomerów)

DnaB - łączą się z DnaA, wykazują aktywność helikazy (1-2 heksamery)

DnaC - tworzy kompleks z DnaB (6 monomerów)

Hu- stymuluje formowanie kompleksu (~5 dimerów)

Gyraza - katalitycznie usuwa dodatnie superskręty

SB - stabilizuje strukturę pojedynczej nici

U wyższych Euc w chromosomach występują charakterystyczne obszary w których zawsze zaczyna się replikacja. Nie udało się wyznaczyć charakterystycznych segmentów jak ARS. U człowieka 8kpz zawsze inicjuje replikację. Są w nich 2 charakterystyczne domeny:

1. ważniejsze, zgromadzone bliżej środka obszaru. W nich zachodzi inicjacja replikacji z dużą częstotliwością

2. o znaczeniu drugorzędowym, rozproszone w całym obszarze 8kpz

w genomie ssaków istnieje odpowiednik białek ORC .

Kompleks pre - replikacyjny u Euc:

Inicjacja replikacji u Euc wymaga 2 etapów występujących w danym czasie w cyklu komórkowym:

1. selekcja replikatora - identyfikacja sekwencji, które kierują inicjacją replikacji w fazie G1. prowadzi do zgromadzenia wielobiałkowego kompleksu w każdym replikatorze w genomie

2. aktywacja ori - gdy kom wejdzie w S i zostanie zapoczątkowane - przez białka przyłączone do replikatora - rozwijanie DNA i rekrutacja polimerazy DNA

czasowe rozdzielenie tych procesów powoduje, ze każdy chromosom jest replikowany tylko raz w cyklu komórkowym.

SELEKCJA REPLIKATORA

• przez komleks pre - inicjacyjny pre - RCS złożony z 4 białek, które łączą się w uporządkowany sposób w każdym replikatorze

• tworzenie pre-RCS:

I etap: rozpoznanie replikatora przez ORC - inicjatora eukariotycznego

II etap: przyciąganie białek ładowaczy helikaz (Cde6 i Cdt1)

III etap: ORC i ładowacze przyciągają białko uważane za helikazę widełek replikacyjnych (Mcm2-Mcm7-kompleks)

Uformowanie pre-RCS nie prowadzi bezpośrednio do rozwinięcia nici DNA czy też do rekrutacji polimerazy DNA. Pre-RCS formowane w G1 jest aktywowane tylko do inicjowania replikacji po tym, jak komórka wejdzie z G1S. aktywowanie pre-RCS jest dokonywane przez 2 kinazy Cdk i Ddk, które kowalencyjnie dołączają reszty fosforowe do białek. Każda z tych kinaz jest nieaktywna w G1 i aktywuje się dopiero po wejściu komórki w S. po aktywowaniu fosforylują białka pre-RCS i inne białka replikacyjne, które wtedy mogą się przyłączać w msc ORI i inicjować replikację. Znajdują się tam trzy polimerazy DNA i inne białka.

Polimerazy gromadzą się w określonym porządku. Pierwsze łączą się δ i ε, potem polimeraza α/primaza. Dodatkowo do tych polimeraz jest wymagany kompleks Mcm białek i czynników wymaganych przez polimerazy.

Regulacja aktywności wielu msc ORI jest dokonywana przez Cdk, które kontrolują formowanie i aktywność pre-RC.

Ścisłe powiązanie między funkcją pre-RC, poziomem Cdk i cyklem komórkowym zapewnia, że genom Euc jest replikowany tylko raz w danym cyklu komórkowym

ELONGACJA

Białka pomagające w rozwijaniu podwójnej helisy i przygotowujące matrycę do replikacji:

1. białka wiążące się z jednoniciowym DNA - białka SSB - nie wiąże się z dwuniciowym DNA, pokrywają cały obszar łańcucha cukrowo - fosforowego, pozostają wolne zasady

2. ATP - azy zależne od DNA:

A/ helikazy

B/ topoizomerazy:

• typ I - (A i B) przecinają jedną nić i pozwalają na obroty wokół drugiej

• typ II - przecinają obie nici i pozwalają na przejście cząsteczki DNA

Gyraza należy do topoizomeraz typ II. U E. coli najlepiej zbadany enzym tego typu.

Ograniczenia procesu replikaci:

• niezdolność polimerazy DNA do samodzielnego rozpoczynania syntezy

• synteza 5`3`

• konieczność rozplatania podwójnej helisy DNA

Synteza DNA zaczyna się od startera (1-kilka pz)

-rybonukleotydem katalizującym syntezę jest ATP

-starter jest syntetyzowany przez prymazę (polimeraza RNA)

nić wiodąca - sposób ciągły

nić opóźniona (fragmenty Okazaki) - sposób nieciągły

Okazaki:

U Bac 1000-2000 pz

U Euc 40-290 pz

Każdą nową rundę replikacji rozpoczyna prymaza.

Prymosomy - kompleksy enzymatyczne prymazy i innych białek

U bac: polimeraza III + prymosom = replisom (replikacyjny kompleks białkowy obejmujący wiele białek

3 aktywności polimeraz:

Polimeraza 5`3` - synteza nici

Egzonukleaza 3`5` - usuwanie błędów

Egzonukleaza 5`3` - usuwanie starterów, potem na ich miejsce wstawiane fragmenty DNA

Ligazy - katalizują powstanie wiązania fosfodiestrowego

TERMINACJA:

U bac: tam gdzie są sekwencje terminatorowe + białka terminujące Tus(przepuszcza polimerazę tylko w jednym kierunku)

U Euc:

-brak sekwencji zakończeniowych i Tus

-kompleksy fabryk replikacyjnych

Róznice w budowie widełak replikacyjnych u Euc i Proc:

Euc:

• nie mają struktury dimerów, które byłyby odpowiednikiem plimerazy III

• czynnik replikacyjny C - kontroluje odłączanie i dołączanie się enzymu pracującego na nici opóźnionej

• usuwanie starterowego RNA za pośrednictwem endonukleazy FEN1, która asocjuje z kompleksem sigma na końcu 3` jednego z fragmentów Okazaki aby mieć możliwość usunięcia startera z końca 5` sąsiedniego fragmentu

• brak replisomu

Enzymy i białka tworzą duże struktury wewnątrz jądra - FABRYKI REPLIKACYJNE

Zakończenie syntezy DNA na nici opóźnionej wymaga usunięcia starterowego RNA z każdego fragmentu Okazaki.

2 modele terminacji replikacji:

1. po zerwaniu przez helikazę wiązań wodorowych utrzymujących starter na matrycy, co z kolei umożliwia polimerazie δ odsunięcie startera i wydłużenie sąsiedniego startera o odsłonięty w ten sposób odcinek matrycy. Odsłonięty RNA może być usuwany przez FEN1 gdyż endonukleaza z łatwością tnie wiązania fosfodiestrowe w msc gdzie starter wiąże się z DNA wiązaniem wodorowym

2. Alternatywnie: usuwanie startera odbywa się przez Rnazę H, która może degradować RNA występujący a formie hybrydy RNA-DNA połączonego wiązaniami wodorowymi lecz nie może przecinać wiązania fosfodiestrowego łączącego ostatni rybonukleotyd z sąsiednim deoksyrybonukleotydem DNA. będzie on jednak teraz zakończony resztą 5`-monofosforanową i może być usunięty przez FEN1.

WYKŁAD 8

1 cząsteczka DNA = 1 chromosom

telomery - DNA inaczej się replikuje

telomer - jest to zakończenie chromosomu. W telomerach nie ma nukleosomów, a cała struktura telomeru = telosom. Telomery zawierają specyficzne sekwencje DNA np. TTAGGG oraz wiele dłuższych albo krótszych sekwencji. Te sekwencje heksanukleotydowych motywów tworzą nić G, która tworzy ogon 3` chromosomu różnej długości w zależności od organizmu i chromosomu. Sekwencje nukleotydowe w telomerach mogą być obecne też w innych miejscach w chromosomie np. w blokach heterochromatyny.

U niektórych organizmów np. u muszki owocowej telomery zbudowane są z 2 retrotranspozonów Het-A i TART. Retrotranspozony mają ogony oligo-A którymi łączą się do DNA tworząc telomery.

Funkcje telomerów:

1. zabezpieczają końce chromosomów przed nukleazami

2. utrzymują długość chromosomów

Dna w telomerach jest replikowane przez enzym telomarazę - jest enzymem zbudowanym z części białkowej i RNA. RNA zawarty w telomerazie jest wzorcem do syntezy DNA. Telomeraza należy do grupy enzymów zwanych odwrotnymi transkryptazami. Wzorzec RNA który posiada jest komplementarny do nici G (bogata w guaniny) i replikuje nić C. Telomeraza nie wymaga specyficznej sekwencji DNA z której rozpoczyna syntezę telomerowych powtórek, ale muszą one być bogate w G i jedna nić musi być zachodząca (wystająca - min 4 nukleotydy) - jest to nić 3`



3`

5`

telomeraza wydłuża nić G przez syntetyzowanie nici C i ligaza łączy powstałe nukleotydy.

Białka w telomerach:

W telomerach występuje wiele białek telomerowych, które tworzą telosom. Białka te łączą się do DNA telomerowego i do siebie nawzajem, chroniąc DNA przed degradacją.

BIAŁKO TEBP:

• kompleks białkowy

• zbudowany z podjednostki α i β które połączone są ze sobą tak, że tworzą zagłębienie w którym zanurzony jest koniec 3` DNA telomeru tworząc bardzo stabilny kompleks DNA - białko

U ssaków w telomerach utworzona jest pętla dwuniciowa zbudowana z 23 tys pz i pojedyncza nić G wchodzi do tej dwuniciowej powtórki i maskuje koniec cząsteczka DNA. do tego przyłączają się białka trwale zabezpieczające koniec DNA: TRF1, TRF2, TIN2

SKŁADANIE NUKLEOSOMU

W czasie replikacji DNA występują dwie różne reakcje, które następują zaraz po przejściu białek replikacyjnych. Od tych reakcji zależy odtworzenie struktury chromatyny:

1. rodzicielska segregacja nukleosomów - jest transferem istniejących histonów na 2 nowe chromatyny za widełkami replikacyjnymi

2. powstanie nukleosomów de novo

W nukleosomach dwie cząsteczki każdego z histonów rdzeniowych H2A, H2B, H3, H4 tworzą rdzeń dookoła którego jest nawinięty DNA. Nawinięcie DNA jest stabilizowane przez pojedynczy histon H1 usytuowany na zewnątrz struktury rdzeniowej.

Przy składaniu nukleosomów powstają pytania:

1. Czy oktamery rdzeniowe starszych (wzorcowych) cząsteczek DNA mogą być konserwatywne, a nukleosom na nowej cząsteczce DNA zreplikowanej może być odtwarzany albo całkowicie de novo albo na podstawie starej jednostki rdzeniowej?

2. Czy tylko pół oktameru (po jednej cząsteczce z każdego dimeru) jest starego pochodzenia i nowe oktamery mogą zawierać stary-stary, stary-nowy, nowy-nowy histon?

3. Czy struktura rdzenia nie jest konserwatywna ściśle tak, że oktamer na nowym łańcuchu zawiera mieszankę starych i nowych histonów?

Wyniki uzyskane z wielu przeprowadzonych doświadczeń świadczą, że nowe nukleosomy mają konserwatywne H3 i H4, one pierwsze łączą się z DNA tworząc stabilny tetramer dookoła którego owija się DNA a potem dodawane są H2A i H2B. Cząsteczki H1 dodawane są losowo w kombinacji stary-nowy do cząsteczki rdzeniowej.

W cytoplazmie na rybosomach odbywa się synteza H3 i H4. Łączą się one ze sobą i są acetylowane w lizynach w różnych pozycjach w ogonach N histonów. Acetylacja histonów jest katalizowana przez cytoplazmatyczny typ acetyl transferazy B = B-acetyltransferaza = Hat-B. Enzym ten (Hat-B) jest konserwatywny ewolucyjnie i acetyluje lizyny w pozycji 5 i 12. acetylowane H3 i H4 przyłączają białko chaperonowe CAF1 (duże powinowactwo) które niesie te histony do widełek replikacyjnych dzięki czynnikowi PCNA (klamra załadowująca polimerazę). Białka CAF1 tworzą stabilny kompleks z acetylowanym H3 i H4 i dostarczają je do widełek. Następuje połaczenie H3 i H4 do DNA ich deacetylacja przez białko HDAC 1 (deacetylaza histonowa), białka te współdziałają z metylotransferazą DNA (Dnmt1), która metyluje DNA. Dnmt1 łączy się do PCNA w widełkach replikacyjnych.

Deacetylacja i metylacja wiąże się z zablokowaniem aktywności genów struktura DNA staje się bardziej zbita.

Chaperony biorące udział w składaniu nukleosomów:

CAF 1:

• białko promujące wprowadzanie H3 i H4 do nukleosomów

• działanie przez przyłączenie do PCNA

• działają z nimi jeszcze inne białka czynne w czasie replikacji

N1/N2:

• odpowiadają za przyłączenie H2A i H2B

• są to nukleoplazminy

• odnaleziono je w komórkach embrionalnych noworodków

NAP1:

• uczestniczy w tworzeniu ostatecznego oktameru histonowego

• reguluje aktywność kinaz białkowych w czasie mitozy

Inne czynniki:

-kwas poliglutaminowy - promuje transfer histonów do DNA

ROZMIESZCZENIE NUKLEOSOMÓW WZDŁUŻ DNA

Odpowiadają za to specjalne białka tzw. Strukturalne i remodelujące chromatynę:

ACF - tworzy strukturę nukleosomu

CHRAC - kompleks dostępności chromatynowej

JSWJ - podjednostka. Katalityczna część obu kompleksów działająca jako ATP-aza. Sama podjednostka przyczynia się do regularnego rozmieszczenia nukleosomów.

REPLIKACJA U EUC. - POWTÓRZENIE

• ściśle związana ze strukturą chromatyny

• przed replikacją chromosomy składają się z jednej dwuniciowej cząsteczki DNA. po replikacji chromosomy zawierają dwie cząsteczki dwuniciowe, podzielone na chromatydy, połączone centromerami

• chromosomy Euc replikują się wg określonego porządku strukturalnego i czasowego. Na chromosomach istnieja liczne miejsca startu replikacji (np. u ssaków 20-50 tys msc startu). Miejsca te badane w różnych genomach eukariotycznych miały 4 cechy wspólne:

1. elementy rozwijania DNA (hiper wrażliwe na specyficzne nukleazy)

2. występują trakty pirymidynowe złożone z więcej niż 12 pirymidyn

3. obszary połączone ze zrębem chromosomowym

4. czynniki transkrypcyjne (współdziałają z czynnikami replikacyjnymi) są to sekwencje regulatorowe

• po aktywacji miejsc startu replikacji DNA jest rozwijane na skutek działania enzymów:

1. Gyraza - katalizuje powstanie negatywnych hyperzwojów - powoduje rozwinięcie dubletów

2. helikazy DNA - przyłączają się do podwójnej nici DNA i stymulują rozdzielanie się ich

3. SSP - przyłączają się do pojedynczych nici, zabezpieczają je przed nukleazami

• miejsce występowania kompleksu replikacyjnego znajduje się blisko zrębu chromosomowego i ponieważ DNA jest w stałej fazie rozwinięcia to przesuwa się do kompleksu replikacyjnego

• odległość miejsc startu wynoszą ok. 100 mln pz i

• każdy obszar między miejscami startu + miejsce startu = replikon (podstawowa jednostka replikacji chromosomu)

replikon - odcinek DNA, element grupy replikonów ułożonych koniec - koniec wzdłuż dupleksu DNA. dany replikon jest replikowany w określonym czasie trwania fazy S. replikony tworzą tandemowe zbiory, które replikują DNA niemal równocześnie. Zbiory replikonowe tworzą rodziny replikonowe

• wielkość replikonów, szybkość replikacji i czas trwania fazy S są kontrolowane genetycznie

• replikacja trwa określony czas. Najpierw replikowane są najważniejsze geny, potem geny, których produkty są potrzebne, na końcu heterochromatyna konstytutywna

• zmiany w procesie replikacji towarzyszą procesowi róznicowania

WYKŁAD 9

BUDOWA GENÓW:

1. geny kodujące mRNA

geny mRNA stanowią ponad 80% sekwencji kodujących większości organizmów Euc. Każdy gen, nie tylko mRNA, ma koniec 3` i 5`. W obszarze genu mRNA występują od końca 5` sekwencje regulatorowe, które nie podlegają translacji a w nich sekwencje wzmacniacza (enhancera), wyciszające (silencery) oraz często sekwencje insulatorowe (insulatory) oraz najważniejsze sekwencje promotorowe.

Obszar kodujący: egzony + introny. Od 3` występuje obszar regulacyjny nie podlegający translacji, z sekwencjami zaznaczającymi koniec transkrypcji, translacji i miejsce dodawania ogona poliA.

Pierwszy nukleotyd transkrybowany = punkt startowy (+1). Wszystkie nukleotydy leżące na lewo od niego są oznaczane jako leżące w górę do 5` lub ,,-” (np. -20). Nukleotydy leżące na prawo to leżące w dół czyli ,,+” (np.+2).

Geny mRNA występują jeden po drugim w tysiącach w genomie, ale nie są równomiernie rozdzielone między chromosomy.

Pomiędzy końcem 3` jednego genu a początkiem 5` drugiego genu znajdują się tzw. Sekwencje rozgraniczające (spacer) zbudowane przeważnie przez umiarkowanie powtarzalne sekwencje DNA.

Są przypadki gdzie kompletny gen jest zachodzący z innym genem. Polega to na tym, że łańcuchy sensowne tych genów zajmują przeciwne nici podwójnego heliksu w tym samym fragmencie DNA. np. u szczura gen kodujący gonadotropinę zawiera inny gen.







5` p 3`







3` p 5`

W obrębie jednego genu w jego intronie może być umieszczony inny gen.

Sekwencje w genie są zawsze zapisane w kierunku 5`3`, w sensownym i nonsensownym łańcuchu. Ułożenie sekwencji w nonsensownym jest identyczne do sekwencji nukleotydów w mRNA, kopiowanego z genu za wyjątkiem zamiany TU.

PROMOTOR

Zawiera kilka ważnych elementów sekwencyjnych występujących w większości genów Euc kodujących białka. Również podobne sekwencje występują w promotorach wirusów które infekują komórki eukariotyczne. Wśród tych sekwencji występują motywy sekwencji zgodnych (consensusowe) i są to najczęściej motywy TATA box, który pojawia się w miejscu (-20) - (-30) nukleotydów w górę od miejsca startu. Sekwencja TATA box jest rozpoznawana przez główny czynnik inicjujący transkrypcję - TFIID. Bardzo niewiele genów występuje bez TATA box - mają wtedy wielokrotne losowo rozmieszczone sekwencje startu. Inne sekwencje promotorowe, mniej powszechne niż TATA box to CAAT box - występują w obszarze ok. (-80) nukleotydów i dla niektórych genów są typowe a dla innych nie. Występują u zwierząt i niższych Euc.

Metody badania promotorów:

- foot print - stosuje się tzw. nukleazę 1 (S1) - rozpoznaje jednoniciowy łańcuch nukleotydowy i wyznacz obszar promotorowy.

AKTYWATORY

(wzmacniacze, enhancery) oprócz promotora występują w obszarze regulacyjnym. Mogą występować poza obszarem genu w znacznej odległości od niego. Funkcja aktywatorów to:

a/ stymulatory transkrypcji, których działanie jest ograniczone do określonych obszarów chromatyny przez elementy insulatorowe

b/ są elementami DNA liczącymi 50-150 pz, które wzmacniają ekspresję genów. Są efektywne niezależnie od ich orientacji w stosunku do genu i mogą być umieszczone w znacznej odległości (tysiące par zasad) od transkrybowanego genu bez zmiany w swoim działaniu.

Mogą być stymulowane przez białka towarzyszące czynnikom transkrypcyjnym. Działanie aktywatorów może być stymulowane przez insulatory.

INSULATOR

Sekwencja DNA, która oddziela aktywator od promotora. Są to ciągi 42pz DNA ulokowanych pomiędzy aktywatorem i promotorem, pomiędzy wyciszaczem i promotorem, między przyległymi genami lub zbiorami przyległych genów. Funkcja ich to zabezpieczanie genu przed wpływem aktywacyjnym lub represyjnym genów sąsiednich. Wszystkie poznane insulatory u Euc mają motyw sekwencji powtórzonych CCCTC, który jest rozpoznawany przez białko z motywem CTCF. Białko to zalicza się do białek regulatorowych zawierających palec cynkowy. Białko CTCF ma 11 palców cynkowych.

WYCISZACZ (SILENT)

Jest to obszar kontrolny genu i tak jak aktywatory może znajdować się poza genem w pewnej odległości. Działanie polega na tym, że przyłączenie do nich czynników towarzyszących czynnikom transkrypcyjnym powoduje represję genu kontrolowanego.

SEKWENCJE KODUJĄCE: EGZONY I INTRONY

Nie wszystkie geny Euc mają introny np. geny kodujące histony, niektóre geny tRNA, kodujące interferony i geny globinowe.

W jaki sposób są zaznaczane introny?

Są specjalne sekwencje na granicach egzon/intron, intron/egzon, zaznaczające miejsca wycinania. Są to sekwencje GUAG




5` GU AG 3`

egzon intron egzon

Introny - są bardzo długie. Często dłuższe niż egzony i rozdzielają sekwencje kodujące genu. Ich obecność wydłuża gen co daje możliwość rekombinacji wewnątrzgenowej oraz na skutek przetasowania łączenia egzonów umożliwia uzyskanie wielu różnych produktów z jednego genu. Wycinanie intronów jest perfekcyjne, bez pomyłek.

Za segmentem kodującym występują sekwencje zaznaczające koniec transkryptu i sygnały obróbki końca 3` transkryptu. W tym obszarze występują ciągi sekwencji …AATAAA…, który wyznacza koniec 3` transkrypcji pre-mRNA. 20 nukleotydów w dół od tego sygnału leży miejsce odcięcia pre-mRNA. Jeżeli w tym ciągu nastąpią substytucje zasad np. TC, TG, to transkrypt może być skrócony zmutowane białko.

Talasemia - choroba krwi wywołana błędnym sygnałem AATAAAAATGAA

RODZINY GENOWE

• większość genów je tworzy

• np. rodzina genów globinowych - wszystkie geny z tej rodziny mają te same introny i w tym samym miejscu egzony. Jedyna różnica genów globulinowych między roślinami i zwierzętami to inny egzon w trzeciej pozycji.

• Rodzina genów histonowych

WYKŁAD 10

2 klasy genów kodujące również mRNA, ale odróżnione od pozostałych:

1. GENY HOMEOTYCZNE

• produkty tych genów transformują części ciała w struktury odpowiednie do ich pozycji w ciele

• kodują czynniki transkrypcyjne ważne w procesie rozwoju

• występują w tzw. Grupach selektorowych, determinujących rozwój różnych obszarów organizmu

• wszystkie geny homeotyczne zawierają homeoboks (180pz) - jest to sekwencja regulacyjna tych genów

• geny z homeoboksami = geny homeoboksu - kodują czynniki transkrypcyjne, białka mające homeodomenę łączącą się z DNA. czynniki te włączają kaskadę genów koniecznych do wytworzenia np. ręki, nogi

• do promotorów określonych genów przyłącza się kompleks białek z homeodomenami kodowanych przez geny homeotyczne

• np. Drosophila ma 2 kompleksy takich genów: bithorax i Anthennapedia: kontrolują różnice między segmentami brzusznymi i grzbietowymi ciała oraz różnice wśród segmentów grzbietowych i głowowych

• podobne kompleksy znaleziono u wszystkich zwierząt i człowieka

• u roślin występuje gen MADS ale nie jest on homologiczny do genów homeotycznych u zwierząt

• u człowieka geny homeotyczne występują w 4 zbiorach: HOXA, HOXB, HOXC, HOXD, odpowiednio na chromosomach 7,17,12,2.

• Gen eve - jest podstawowym genem w rozwoju zarodka muszki. Jako pierwszy jest włączany po zapłodnieniu. Cytoplazma takiej komórki jest niejednorodna - przedni odcinek (głowowy) zawiera inne białka niż odcinek tylny (ogon). Żeby zidentyfikować jakie geny kontrolują plan budowy zarodka analizuje się mutanty muszki (jakie geny są czynne a jakie nie). Znaleziono geny wśród których wyróżniono takie, które kodowały 4 najważniejsze białka: bicoid, hunchback, Krueppel, giant. Te białka są nieregularnie rozmieszczone wśród osi zarodka, kontrolują one aktywność genu eve. Gen ten może mieć aktywatory w obszarze 5`` i 3`. Bicoid i hunchback są genami matczynymi - ulegają ekspresji w komórce jajowej po zapłodnieniu i ustalają polarność. Są czynnikami transkrypcyjnymi.

• Struktura genów homeotycznych jest złożona. Wiele z nich ma kilka promotorów i kilka miejsc inicjacji transkrypcji np. gen Anthenopedia ma 2 promotory i 2 produkty transkrypcji z tym, ze jeden z promotorów znajduje się wewnątrz intronu. Transkrypcja genu z pierwszego promotora jest aktywowana białkiem Krueppel a blokowana przez białko ultrabithorax. Ekspresja genu z drugiego promotora (w intronie) jest aktywowana przez białko fushitarasu i hunchback a blokowana przez białko oskar. Produkt transkrypcji z pierwszego promotora jest konieczny do realizacji grzbietowej części tułowia, a transkrypt z drugiego promotora do realizacji brzusznej części tułowia, nogi, żywotności zarodka.

• Obecność w tych genach olbrzymich intronów, które są potrzebne do czasowej regulacji genów

• GENY PRZECIWCIAŁ

• nie są gotowe, muszą zostać pobudzone

• kręgowce mają zdolność do wytwarzania przeciwciał, które specyficznie rozpoznają i reagują z wieloma różnymi antygenami. Przez pewien czas sądzono, że każde przeciwciało jest kodowane przez odrębny gen. Badania nad tym ujawniły, że specyficzność przeciwciał jest wynikiem genetycznego programu zmian podjednostek genowych tworzonych przez stosunkowo niewielką grupę genów. Różne kombinacje tych podjednostek dają olbrzymią liczbę funkcjonalnych genów kodujących specyficzne przeciwciała. W czasie składania takich podjednostek mogą zachodzić mutacje i zmiany wywołane niedokładnością wycinania i składania. W konsekwencji tego powstają miliony różnych przeciwciał

• limfocyty B - w nich następuje redagowania genów warunkujących specyficzność przeciwciał, umieszczanie ich na powierzchni limfocytów skąd są uwalniane do krwi. Namnażanie lim B jest wspomagane przez działanie lim T i makrofagów

Budowa przeciwciał:

• ciężkie i lekkie łańcuchy polipeptydowe połączone ze sobą mostkami dwusiarczkowymi

• każdy lekki i ciężki łańcuch ma obszary stałe i zmienne

• obszary zmienne są jeszcze podzielone na obszary bardzozmienne (zmienność aminokwasów)

• obszar konserwatywny strukturalnie - różny dla różnych typów przeciwciał

Grupy genów przeciwciał:

U człowieka i u myszy są 3 grupy genów kodujących łańcuchy lekkie lambda i kappa i łańcuchów ciężkich ulokowanych n innych chromosomach. Geny określonych łańcuchów tworzą ciągi sekwencyjne i tworzą oddzielne fragmenty. Niektóre fragmenty występują tylko raz a inne są powtórzone w nieco innych wersjach, w kopiach od kilku do setek tysięcy razy. Każda kopia ma swój własny 5` obszar flankujący, kontrolny z sekwencjami promotorowymi. Za określonym segmentem występuje obszar przerywnikowy za którym jest kolejny zbiór elementów.

Gen lekkiego łańcucha kappa składa się:

V_k - element kodujący zmienny obszar

J_k - element łączący

C_k - element stały od końca 3`

Łańcuch lambda:

V_l

2J_l - mające własny element C

Geny kodujące łańcuchy ciężkie mają więcej elementów kodujących, niż geny kodujące łańcuchy lekkie:

V_h

D_h

J_h

C_h

Przy łączeniu się ze sobą elementów kodujących działa enzym rekombinaza. WYKŁAD 11

3. geny kodujące rRNA

geny rybosomalne występują w chromosomach, które oznaczamy jako NOR lub SAT. Liczba jąderek w jądrze komórkowym jest ściśle skorelowana z liczbą chromosomów jąderkowych. Liczba ta jest charakterystyczna dla gatunku. W chromosomach NOR geny kodujące rRNA tworzą zbiory złożone z setek - tysięcy kopii genów. W organizatorze jąderkowym - NOR występują geny dla podjednostek 18S, 5,8S, 28S rRNA (u Euc.). w tym miejscu, gdzie występują te geny tworzy się jąderko w czasie ich transkrypcji i gromadzenia jej produktów. Jest jeszcze inny gen kodujący podjednostkę 5S rRNA, który leży poza NOR, nawet w innym chromosomie.

Skąd wiadomo, że w tych chromosomach są geny dla podjednostek?

Analizowano rybosomy i z nich wydzielono 4 rodzaje SrRNA:

Mała podjednostka rybosomu - 1 mały 18SrRNA

Duża podjednostka rybosomu - 3 duże: 18S rRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA

Budowa genów rRNA:

Gen dużej podjednostki pre-RNA zbudowany jest z kopii 18SrRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA (w takiej kolejności są w genie)

5` 18S, 5,8S, 28S 3`

między tymi sekwencjami występują sekwencje międzygenowe - wewnętrzne introny. Są one transkrybowane, a potem w czasie obróbki potranskrypcyjnej są wycinane. Pierwszy leży między odcinkiem sekwencji kodującej i pierwszym nukleotydem kopiowanym w czasie transkrypcji, a pozostałe dwa między 18S/5,8S i 5,8S/28S.

W promotorze takiego genu brak sekwencji analogicznych do TATA box i CAAT box. Uważa się, ze prawdopodobnie struktura drugorzędowa DNA w obszarze promotorowym jest miejscem przyłączania kompleksu transkrypcyjnego. Promotory dla większości genów rRNA leżą w miejscu od -35 do +15 nukleotydów a aktywatory -50 do -150 w górę.

W międzygenowych sekwencjach występuje różna liczba sygnałów kończących geny poprzedzające

Rodzina genów rybosomalnych:

Jak wykazały badania rodziny genów rRNA czasem zawierają pseudogeny. Np. u Drosophila występują duże pseudogeny rRNA podobne do pre-RNA. One występują jako introny w funkcjonalnych genach rRNA u innych organizmów.

Geny kodujące 5S rRNA:

Występują w innych miejscach genomu niż NOR. W zbiorach tych genów w zależności od gatunku występują setki - tysiące powtórek. Jednostka kodująca ten gen liczy ok. 120 pz i jest poprzedzona sekwencją o długości 15-50 pz, która jest nietranskrybowana. W sekwencjach kodujących nie ma intronów. Poszczególne geny są od siebie oddzielone przestrzenią międzygenową, która liczy 250-450 pz. W tej przestrzeni występują umiarkowanie powtarzalne i unikatowe sekwencje DNA. Sekwencje kodujące są wysoce konserwatywne. Wewnątrz sekwencji kodujących znajduje się promotor w pozycji +50 do +80. promotor jest podzielony na dwa segmenty:

1. segment A - występują sekwencje zgodne, jest ich bardzo dużo. Są to sekwencje konserwatywne do których przyłącza się czynnik transkrypcyjny (TF3A) z kompleksem transkrypcyjnym. Za segmentem A znajduje się sekwencja interwencyjna

2. segment C

Liczba kopii genu 5S rRNA u rózny6ch organizmów:

• drożdże ok. 150 kopii

• muszka owocowa 160 kopii

• człowiek 500 kopii

• ropucha afrykańska 2400 kopii

4. geny kodujące tRNA

U większości gatunków Euc geny kodujące tRNA są rozproszone na wielu lub wszystkich chromosomach. W tych chromosomach występują w wielu kopiach. Dużo jest wśród nich pseudogenów - tworzą niefunkcjonalne DNA.

Każdy gen tRNA ma krótką sekwencję przerywnikową od 5` transkrybowaną 3-10 nukleotydów, za nią są sekwencje kodujące. Od końca 3` znajduje się inna sekwencja przerywnikowa, transkrybowana. Promotor znajduje się wewnątrz sekwencji kodujących. Dzieli się na 2 części:

1. blok A - leży w stałym obszarze +8 do +19. Jego funkcja jest podobna do bloku A w 5SrRna. Ma sekwencję zgodną, rozpoznawaną przez czynniki transkrypcyjne

2. blok B - leży w zmiennej odległości od A 30-60 nukleotydów, a jego długość wynosi 9 nukleotydów

Pozycja nukleotydów leżących w przestrzeni między blokami ma wpływ na start transkrypcji .

Koniec 3` genu tRNA jest zakończony serią T (ok.4). jest to sygnał kończący transkrypcję ale nie odpowiada zakończeniu 3` w dojrzałym tRNA (CCA)

Liczba genów tRNA:

-drożdże 400 - każdy gen tworzy 18-20 kopii

-człowiek 1400

-płazy 8000 - każdy w 400 kopiach

5. budowa genu kodującego UsnRNA (mały jądrowy RNA)

służy do obróbki potranskrypcyjnej genów np. 5SrRNA. Nie służy do produkcji białek.

Ich budowa przypomina budowę genów mRNA:

• mają aktywator i promotor leżący w górę 5`

• promotor -40 do -70 pz. Ma sekwencje które działają jak TATA box

• aktywator -200 pz w górę i ma charakterystyczną sekwencję ośmionukleotydową obecną także w aktywatorach wielu genów mRNA

• od końca 3` występują sekwencje zapinkowe i jest zaznaczone cięcie transkryptu podobne jak w genach mRNA

6. geny kodujące scRNA (mały cytoplazmatyczny RNA)

7SscRNA występuje w SRP - sygnalnej cząsteczce rozpoznawczej.

Ten typ RNA wykazuje powinowactwo z rodziną powtórek Alu.

Gen 7SscRNA ma wewnętrzny promotor, wzmacniacz leżący w górę. Jego budowa przypomina budowę genu tRNA.

WYKŁAD 12

Niekodujące RNA: (tRNA i rRNA)

1. tRNA: adaptorowa cząsteczka dla poszczególnych aminokwasów, rozpoznaje kodon na mRNA w czasie biosyntezy białka. Cechy typowe

A/ obecność antykodonu (trypletu zasad komplementarnych do kodonu dla poszczególnych aminokwasów) np. kodonem dla lizyny jest UUU, antykodonem jest AAA. Połączenie tRNA z lizyną powoduje przyłączenie AAA do UUU i wstawienie lizyny.

B/ każdy tRNA ma swój aminokwas. Jest on przyłączany kowalencyjnie do tRNA przez enzym syntazę aminoacylową tRNA, specyficzną dla każdego tRNA (enzym sprawdza czy przyłączył się właściwy aminokwas do tRNA) np. lizyna przyłączona przez syntazę lizynową.

C/ tRNA zawiera wiele zasad azotowych, które nie są kanonicznymi zasadami lecz formami zmodyfikowanymi standardowych zasad.

D/ posiadanie pnia acetylowego od końca 3` w którym występują sekwencja CCA rozpoznawana przez kompleks tRNA + enzym i w tym miejscu przyłącza się aminokwas. CCA jest dodawane do 3` w czasie obróbki potranskrypcyjnej.

E/ mają strukturę trójwymiarową (kształt L). pozwala to na dopasowanie tRNA do miejsca peptydylowego (P) i akceptorowego (A) na rybosomie.

2.rRNA: skład rybozymów. Produkt genów rRNA jest obrabiany przed transportem.

Typy małych jądrowych RNA:

• małe cząsteczki RNA występujące w jądrach komórek Euc.

• Są zaangażowane w różnorodne ważne procesy zachodzące w jądrze (np. obróbka potranskrypcyjna, utrzymanie telomerów)

• Zawsze są związane ze specyficznymi białkami i są nazywane snRNP (małe jądrowe rybonukleoproteiny)

• Biorą udział w regulacji genów

1. mały jąderkowy RNA (snoRNA) - klasa małocząsteczkowych RNA, które są zaangażowane w chemiczną modyfikację genów np. rRNA metylacja tych genów

2. mikro RNA (miRNA) - grupa genów, które kodują produkty RNA odwrotnie komplementarne do transkryptu innego genu mRNA i blokują gen tarczowy. Występują w przestrzeniach międzygenowych.

3. Przewodni RNA (gRNA) - funkcjonuje w redagowaniu mRNA (przygotowanie mRNA do translacji, zachodzi w mitochondriach) - zamiana pewnych zasad w inne formy chemiczne (np. delecja lub włączenie zbiorów urydynowych). W procesie redagowania tworzy część kompleksu tzw. Editosomu w którym to ma sekwencje które hybrydyzują z odpowiednimi sekwencjami w mRNA wyznaczając w nim pozycje do redagowania zasad.

4. RNA zawarty w SRP:

1. 4,5 SscRNA - przyłącza się do sygnalnej sekwencji w mRNA białek przenoszonych do wydzielenia z komórki

2. 7 SscRNA - przyłacza się do sekwencji sygnalnej w powstałym białku i zakotwicza rybosom na RE

5. pRNA - w bakteriofagu fi29 (ma DNA jako materiał genetyczny. Razem z 6 białkami jest maszynerią do upakowania DNA w kapsule

6. riboswitch RNA (włącznik rybonukleinowy) - włączają lub wyłączają geny w zależności od zapotrzebowania komórki i stężenia metabolitów w komórce. Wykryto niedawno u bakterii element RNA wbudowany w mRNA, który bezpośrednio wyczuwa stężenie metabolitów i włącza lub wyłącza geny. To przełączanie to riboswitch. Dokładne badania pokazały, że istnieją 3 odrębne sposoby przełączania ekspresji genów:

• element RNA powoduje przedwczesne zakończenia transkrypcji mRNA

• RNA blokuje rybosomy przed przyłączeniem mRNA

• RNA tnie mRNA promując jego destrukcję. RNA przyłącza się do metabolitu - aktywacja jego wewnętrznej zdolności do wycinania - kompleks RNA + metabolit przyłącza się do mRNA i tnie go

Rybozym - matabolit + RNA mający aktywność enzymatyczną (destrukcyjną)

7. RNAi (inferencyjny RNA) -odpowiada za regulację ekspresji genów u wyższych Euc. jest kodowany przez tzw. dwuniciowego RNA - dsRNA. początkowo dsRNA był uważany jako forma przejściowa pośrednicząca w replikacji wirusów. Uznawany za odpowiedź antywirusową komórki. Obecnie dsRNA jest uważany za naturalną formę RNA. Produkowany przez własne komórki lub podany sztuczny ds. RNA wyhodowany w laboratorium.

dsRNA uczestniczy w wieloetapowym szlaku przemian(wg. dwóch systemów):

1. po wytworzeniu dsRNA (100-200 nukleotydów) jest cięty przez kompleksy enzymatyczne ,,dicer” na fragmenty liczące 20-22 nukleotydów. Następnie dwuniciowe fragmenty są rozcinane na jednoniciowe do których przyłączają się odpowiednie białka i lokują kompleks na tarczowej sekwencji mRNA. Z tą sekwencją tarczową jednoniciowy fragment + białka tworzy dupleks i wyznacza miejsce cięcia dla innego enzymu ,,slicer” (nukleaza III RNA). Slicer tnie mRNA w miejscu przyłączania kompleksu w ten sposób gen jest czynny ale nie tworzy się produkt transkrypcji.

2. przyłączanie RNAi jest niespecyficzne do mRNA i nie jest on degradowany ale blokowana jest translacja.

Wykorzystuje się to zjawisko w medycynie do wyciszania genów np. kom nowotworowych

W jądrach komórkowych (komórek silnie się dzielących i aktywnych metabolicznie) u ludzi wykryto suborganelle jądrowe Cajal (czyt.Kachal):

• sferyczne ciałka (0,1 - 2 μm)

• liczba 1-5 w genomie

• odbywa się w nich składanie i modyfikacja pewnych typów miRNA

• występuje w nich specjalny rodzaj RNA scaRNA (np. gRNA) kieruje on miejscowo specyficzną syntezą modyfikowanych mukleotydów w specyficznych typach RNA: U1, U2, U3, U4, U5 (zwane są spliceosomem - uczestniczą w wycinaniu intronów)

• są miejscem biogenezy sn RNP (miRNA + białka)

• są miejscem biogenezy polimerazy DNA

Budowa genomu i genów w mitochondriach i chloroplastach:

Genomy mitochondrialne najczęściej mają postać kulistą.

Krzyżówka ,,dziwaczki” świadczyła po raz pierwszy, że mitochondria i chloroplasty mają własny genom. Wyizolowano z dziwaczka chloroplasty żółte lub bezbarwne i skrzyżowano ponownie z rośliną normalną. Stwierdzono, że cechy rośliny przenoszone są po linii matczynej, bo plemnik ma tak mało cytoplazmy, ze nie ma tam chloroplastów.

DNA w mitochondriach występuje najczęściej w postaci zamkniętych, kolistych superzwojów. Wielkość genomu mitochondrialnego jest bardzo zróżnicowana w zależności od jednostki taksonomicznej. U zwierząt i człowieka genom mitochondrialny jest mały i niebardzo zróznicowany w wielkości 4,5-5,5 μm. A liczba nukleotydów 16 - 20 tysięcy u większości gatunków zwierząt. U człowieka kolisty genom mitochondrialny zawiera 16 596 pz.

U roślin - bardzo duży i jego rozmiary dochodzą nawet 35 - 700μm max. Nawet u blisko spokrewnionych gatunków istnieje duże zróżnicowanie wielkości genomu.

Genomy grzybów i pierwotniaków 10-25μm.

MtDNA zawira 40-50 genów z czego 13-20 koduje polipeptydy a pozostałe geny kodują tRNA i rRNA. MtDNA jest bogaty w pary AT.

U niektórych gatunków występuje 1 łańcuch lekki i 1 łańcuch ciężki.

W większości komórek mtDNA stanowi mniej niż 1% komórkowego DNA. w komórkach szybko rosnących jest go więcej.

Chloroplastowy DNA:

U większości roślin ma postać kolistą. Jego wielkość u roślin lądowych jest ograniczona 40-50μm (120-160 tys nukleotydów). Szczególnie duże zróżnicowanie tego genomu występuje wśród glonów zielonych.

Zsekwencjonowane do tej pory chDNA z wątrobowca i tytoniu mają ok. 120 genów. Liczba ta jest podobna u wszystkich roślin.

Występują sekwencje powtarzalne.

Porządek ułożenia genów taki sam u wszystkich roślin.

WYKŁAD 13

Transkrypcja: jest prowadzona przez polimerazy RNA i wymaga do przebiegu czynników transkrypcyjnych. Jest to przepisywanie informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów w DNA na różnego rodzaju RNA.

Czynniki transkrypcyjne - są to różne białka. Razem z polimerazą tworzą aparat transkrypcyjny ( nie jest on uniwersalny dla wszystkich genów).

Bakterie wymagają tylko 1 czynnika transkrypcyjnego do inicjacji transkrypcji - czynnik sigma (osadza on polimerazę na odpowiedniej sekwencji DNA)

Cały proces transkrypcji składa się z 3 etapów:

1. inicjacja

2. elongacja

3. terminacja

Ad. 1

Aparat transkrypcyjny umożliwia osadzenie polimerazy w promotorze. Osadzenie polimerazy odbywa się na sekwencjach rdzeniowych promotora (TATA box, CAAT box) - promotor rdzeniowy. Dla genów mRNA jest on długości 40 nukleotydów i rozciąga się od miejsca startu transkrypcji w górę lub w dół. Poza rdzeniem występują tzw. sekwencje regulatorowe, które są pogrupowane w różne kategorie. Zwierają one proksymalne elementy promotorowe - aktywatorowe sekwencje, wzmacniacze, insulatory i represory. Do wszystkich tych typów sekwencji przyłączają się białka regulatorowe wspomagające lub blokujące transkrypcję z promotora rdzeniowego.. niektóre sekwencje rdzeniowe mogą być oddalone o 10.000 - 100.000 pz od promotora rdzeniowego.

W komórkach Euc występują trzy polimerazy RNA, które transkrybują różne geny:

1. polimeraza I - transkrybuje geny rRNA. Wymaga obecności jonów Mg2+

2. polimeraza II - transkrybuje geny mRNA, niektóre małe geny jądrowe. Wymaga obecności jonów Mg2+.

3. Polimeraza III - transkrybuje geny tRNA, 5SrRNA, niektóre małe jądrowe i cytoplazmatyczne RNA. Wymaga jonów manganu.

Polimerazy RNA są enzymami złożonymi z wielu podjednostek:

1. Polimeraza I - 5 podjednostek głównych i 9 innych

2. Polimeraza II - 5 podjednostek głównych i 7 innych

3. Polimeraza III - 5 podjednostek głównych i 11 innych

Wszystkie polimerazy RNA mają kształt ,,szczypiec kraba”. U podstawy tych szczypiec znajduje się tzw. miejsce aktywne enzymy, które przyłącza 2 jony Mg lub Mn.

Na przykładzie polimerazy II:

Wiele promotorów na których lokuje się polimeraza II ma elementy TATA. Jest on rozpoznawany przez czynnik transkrybcyjny - TFIID - osadza się na sekwencji konsensusowej.

TFIID złożony jest z wielu podjednostek

1. TBP - wiąże się z sekwencją TATA

2. TAF - czynniki towarzyszące

Po przyłączeniu TFIID powoduje rozległe zakłócenia w strukturze DNA i przyciąga kolejne czynniki transkrypcyjne podstawowe: TFIIA, TFIIB, TFIIF, a następnie TFIIE, TFIIG, TFIIH. Przyłączenie tych czynników powoduje topnienie DNA przechodzi w formę 1-niciową. Do topnienia przyczynia się głównie TFIIH (helikaza) przy udziale ATP. TFIIH dokonuje fosforylacji w końcu C (jest tam 7 aminokwasów powtórzonych kilka razy) dużej podjednostki polimerazy II. Polimeraza nieufosforylowana nie ma zdolności polimeryzacji. Fosforylacja jest niezbędna do wyjścia z promotora i do elongacji.

Oprócz czynników transkrypcyjnych do inicjacji transkrypcji jest wymagany kompleks mediatorowy i enzymy modyfikujące chromatynę.

Aktywatory działające poprzez mediatory na polimerazę stabilizują połączenie polimerazy z promotorem.

Ad.2. Elongacja

Zaczyna się kiedy zostanie utworzony kompleks otwarty DNA w którym nici DNA rozdzielają się na odległości ok. 14 pz - tworzy się bąbel transkrypcyjny. Również polimeraza uwalnia się od czynników transkrypcyjnych, a w ich miejsce przyłączają się czynniki elongacyjne stymulujące elongację (do końca C ufosforylowanego)

Jednym z wielu czynników elongacyjnych jest kinaza PTEF b. jest ona przyciągana do polimerazy II przez aktywatory transkrypcyjne i fosforyluje w ogonie C polimerazy serynę. Kinaza ta przyciąga czynnik elongacyjny TAT - FS1.

W czasie elongacji następuje dodawanie dwóch pierwszych zasad do nici wzorcowej, tworzy się połączenie fosfodwuestrowe i enzym przemieszcza się do kolejnej zasady, która ma być kopiowana z wzorca DNA. w czasie elongacji helisa DNA stopniowo rozwija się przed kompleksem polimerazy i następnie szybko zamyka się za nim.

Polimeraza II używa swojego miejsca aktywnego do katalizowania łańcucha RNA i sprawdza, czy zostały włączone odpowiednie rybonukleotydy.

Po zsyntetyzowaniu pierwszych 10 nukleotydów polimeraza może uwalniać krótki transkrypt i rozpoczynać syntezę od nowa. Jeżeli enzym posunie się dalej niż 20 nukleotydów to mówi się że polimeraza uciekła z promotora. W tym miejscu tworzy się stabilny potrójny kompleks: polimeraza RNA, DNA oraz RNA nowo zsyntetyzowane.

Polimeraza I i III rozpoznaje wewnętrzne promotory (inne niż polimeraza II) używając innego zestawu czynników transkrybcyjnych niż polimeraza II. Wyjątkiem jest czynnik TBP (typowy dla wszystkich polimeraz).

Polimeraza I wymagana jest do transkrybcji tylko jednego genu r RNA. Promotor dla polimerazy I składa się z dwóch obszarów:

1. rdzeniowy - ulokowany wokół miejsca startu transkrypcji

2. element kontrolny - leżący w górę - UCE - ulokowany w odległości 100 i 150 pz w górę.

Polimeraza I wymaga dwóch czynników transkrybcyjnych:

1. SL1 - ma podjednostkę TBP i 3 czynniki towarzyszące TAF kompleks ten łączy się z połową UCE w dół (część A UCE) przyłącza się UBF SL1+UCE+TAF przyłącza się do DNA zmiany w DNA dzięki którym może się przyłączyć polimeraza I

2. UBF

Polimeraza III:

Przyłącza się do promotorów wewnętrznych.

Wymaga czynnika TFIIC z podjednostką TBP, który przyłącza się do promotora i przyciąga polimerazę III

Eukariotyczne aktywatory transkrypcji:

W większości są to białka, które mają specyficzne domeny rozpoznające DNA i domeny aktywatorowe. Z DNA mogą się łączyć białka występujące jako heterodimery, które rozszerzają zakres specyficznych połączeń z DNA oraz monomery łączące się z DNA.

Klasy białek regulatorowych rozpoznających DNA:

1. białka homodomenowe - kodowane przez homeobox

• regulatorowe

• mają specyficzne domeny tzw. helix-turn-helix, dzięki którym rozpoznaje sekwencje na DNA

• występuje u wszystkich Euc

• odkryte u muszki

• kontroluje wiele programów rozwojowych

• wiele z nich występuje jako heterodimery

2) białka z motywem palca cynkowego, który łączy się z DNA

• domena palca cynkowego występuje u wielu czynników transkrypcyjnych

• palec cynkowy: atom cynku połączony z cysteiną, histydyną tworząc strukturę palca

• motywem palca białko rozpoznaje sekwencje na DNA

3. białka z motywem zamka leucynowego

• dwie długie α-helisy są połączone przez leucynę, która tworzy strukturę zamka błyskawicznego

• leucyną są przytrzymywane razem hydrofobowe połączenia

• często tworzą heterodimery

4. białka z motywem helix-pętla-helix

• motyw jest uformowany z dwóch helikalnych obszarów (1-jest częścią heliksy rozpoznającej DNA, 2-krótka helisa)

• obszary te są oddzielone przez elastyczną pętlę umożliwiającą upakowanie

Domeny aktywatorowe tych białek regulatorowych bardzo często nie mają zdefiniowanej struktury. Najczęściej powstaje ona dopiero po połączeniu się białka z docelowym obszarem.

Czynniki modelujące chromatynę - modyfikatory chromatyny (pomagają w aktywności genów)

1. te modyfikatory, które dodają grupy chemiczne do histonów rdzeniowych np. acetyltransferaza histonowa HAT np. dodawanie grupy acetylowej do lizyny 9 histonu 3 umożliwia to demetylację (przez demetylazy) rozluźnienie struktury

2. takie, które modelują chromatynę np. SWI/SNF - kompleks zależny od ATP. Wpływa na strukturę chromatyny --. Zamknięta lub dostępna dla czynników transkrypcyjnych

WYKŁAD 14

Represory transkrypcyjne:

U bakterii występują represory (białka) łączące się w promotorze i blokujące miejsce łączenia polimerazy. Są też takie łaczące się w miejscach przyległych do promotora i reagujące z polimerazą.

Represory mogą zakłócać akcję aktywatorów.

U Euc. nie ma represorów w promotorze. Są wszystkie inne. Najpowszechniejszym typem są te, które działają na aktywator i specyficzne modyfikatory chromatyny, które powodują ściślejsze upakowanie chromatyny lub usuwają grupy chemiczne rozpoznawane przez maszynę transkrypcyjną. Np. deacetylaza histonowa usuwa grupy acetylowe z ogonów i blokuje transkrypcję, a w tym samym czasie inne enzymy dodają grupy metylowe do DNA lub ogonów histonów co powoduje blokowanie transkrypcji. Ten typ modyfikacji aktywności to wyciszanie genów (utrata funkcji genu). Jest to reakcja odwracalna.

Wyciszanie genu odbywa się na skutek zmian epigenetycznych.

Epigenetyka - zjawisko zmiany aktywności genu nie mające przyczyny w zmianie sekwencji nukleotydowej DNA i dziedziczące się przez kolejne podziały komórki. Może się dziedziczyć z pokolenia na pokolenie.

Aktywatory i represory występują jako cząsteczki kompleksowe mające domeny aktywatorową i łączącą się z DNA na oddzielnym polipeptydzie.

Obróbka potranskrypcyjna różnych typów mRNA:

Bezpośrednim produktem transkrypcji jest heterogenne RNA (hmRNA lub hrRNA lub htRNA).

Pierwotny transkrypt zawiera wiele sekwencji nukleotydowych, które nie podlegają translacji w związku z usunięciem tych sekwencji i przygotowaniem gotowego produktu do translacji zachodzi obróbka potranskrypcyjna.

MECHANIZM OBRÓBKI POTRANSKRYPCYJNEJ:

1. wycinanie intronów i łączenie egzonów:

wycinanie intronów z udziałem egzonukleazy RNA wchodzącej w skład kompleksu splicesomu. Wycina introny od 5`GU………..AG3`.

W niektórych przypadkach następuje samowycinanie nukleotydów przez rybozymy.

Wycinanie intronów: trzecia sekwencja potrzebna do wycięcia to punkt rozgałęzienia adeniną bliżej końca 3`. Wycinanie intronów jest dokonywane przez dwie reakcje trans - estryfikacji w których połączenia fosfodiestrowe wewnątrz pre - mRNA są przerwane i utworzone są nowe.

Pierwsza reakcja jest wyzwalana przez 2`-OH w adeninie. Grupa ta atakuje grupy fosforowe guaniny w miejscu 5`. W czym pośredniczy pentawalentny fosforan. W konsekwencji przecinane jest połączenie fosfodiestrowe między cukrem a fosforanem, między egzon/intron, uwalniany jest koniec 5` intronu i następuje połączenie końca 5` guaniny z adeniną w punkcie rozgałęzienia.

Grupa -OH przy końcu 3` egzonu atakuje grupę fosfodiestrową przy końcu 3` intronu. Staje się nukleofilem. W tej reakcji łączą się końce 5` i 3` egzonu i uwalniany jest intron w formie lassa.

Wycinania intronów dokonuje kompleksy wycinająco - łączące zbudowane z małych jądrowych RNA połączonych z wieloma białkami.

MRNA + białka = U (wycinacze intronów - snurp) np. U1, U2, U4, U5, U6

Można wyróżnić 3 klasy wycinania intronów:

1. gdzie działają U

2. rzadka, niektóre geny organellowe i Proc. wycinane przez rybozymy

3. główne jądrowe geny rRNA, geny organellowe, niektóre protokariotyczne. Mają punkt rozgałęzienia G (a nie A j.w)

na skutek istnienia mechanizmu wycinania intronów i łączenia egzonóow pojedyncze geny mogą dawać wiele produktów na skutek alternatywnego połączenia egzonów.

2. 
   dodawanie nukleotydów

Do mRNA dodawana jest od 5` tzw. czapeczka guaninowa.

Do tRNA do 3` dodawana jest sekwencja CCA. Te nukleotydy mają szczególną funkcję.

Do końca 3` mRNA dodawany jest ogon poly - adeninowy.

Dodawanie nukleotydów jest katalizowane przez wiele specyficznych enzymów. Nukleotydy te nie są kopiowane z wzorcowego odcinka DNA. Są syntetyzowane po zakończeniu transkrypcji.

Czapeczka - 3 nukleotydy:

Pierwsza guanina, tak wstawiona, że jej koniec 3`-OH jest na początku i powoduje że końce 3` mRNA mają grupę -OH. Węgiel 5` guaniny jest nietypowo połączony z węglem 5` drugiego nukleotydu za pomocą trzech grup fosforanowych.

Pozostałe nukleotydy są kopiowane z wzorcowego odcinka DNA.

Nukleotydy czapeczki są modyfikowane chemicznie - metylacja w różnych pozycjach.

Skład czapeczki nigdy nie jest taki sam podobnie jak jej wzór modyfikacji.

Czapeczka zapewnia, ze mRNA będzie przyłączony do rybosomów i ułatwia start inicjacji translacji.

Bez czapeczki są mRNA organellowe np. mitochondrialne od 5` ma sekwencje AGGAGGU (sekwencje Shine - Dalgarno)

Czepeczki mają często wirusy infekujące komórki organizmu, oprócz Polio i Picoriovirusa.

W obszarze za czapeczką występują sekwencje liderowe kierujące start translacji na sekwencje kodujące.

Ogon poly - A

Ciąg poly-A ma różną długość (30-300 nukleotydów).

Mogą być mRNA bez poly -A np. dla histonów, protamin

Występują z białkiem łączącym się z sekwencją poly - A, bez którego jest szybko trawiony przez rybonukleazę T2.

Poly - A zabezpiecza mRNA przed degradacją i pozwala na trwanie mRNA przez jakiś czas.

3. modyfikacja chemiczna

jest różna dla poszczególnych typów mRNA i jest katalizowana przez bakterię enzymatyczną i polega na dodaniu grup metylowych do zasad lub cukru rybozy.

Również np. tymina nie występuje w RNA ponieważ może wystąpić w RNA na skutek modyfikacji chemicznej uracylu.

Inne modyfikacje chemiczne:

-miejscowo specyficzna deaminacja

-insercja lub delecja urydyny kierowane przez RNA

modyfikacje te prowadzą do powstania różnorodnych zmodyfikowanych zasad w dojrzałym RNA (głównie u tRNA i rRNA). RNA ma zmodyfikowanych tylko kilka zasad ulokowanych najczęściej w końcu 3` lub 5`.

Chemiczna modyfikacja umożliwia przyjęcie charakterystycznej struktury III - rzędowej.

Są one markerami genetycznymi - rozpoznawanymi przez wiele białek współdziałających z RNA

Modyfikacja RNA w mitochondriach = redagowanie RNA w mitochondriach

W mitochondriach występują różne formy redagowania. Polegają one na ustawianiu w specyficzne obszary RNA urydyn lub ich usuwanie.

Wstawianie odbywa się przy udziale gRNA.

Wstawianie lub usuwanie urydyn zmienia ramki odczytu i zmienia znaczenie informacji genetycznej zawartej w transkrypcie.

Modyfikacja ułatwia przeniesienie transkryptu z jądra do cytoplazmy.

PODSUMOWANIE REGULACJI TRANSKRYPCJI

• za pomocą czynników białkowych uniemożliwiających zajście transkrypcji

• w czasie obróbki też jest kontrola powstania transkryptu

• istnieje szereg małych RNA (RNA i), które nie blokują transkrypcji, ale nie pozwalają na powstanie transryptu

• metylacja DNA i deacetylacja histonów blokują transkrypcję genów (są to zmiany epigenetyczne)

• heterochromatyzacja polega na zmianie upakowania chromatyny połączonej z hipermetylacją i białkiem HP1 (czynnik epigenetyczny)

• aktywność genetycznych elementów ruchomych - mogą się włączyć w obszar regulatorowy genu i zablokować transkrypcję

TRANSLACJA - biosynteza białek

Odbywa się w cytoplazmie na wiel;kich kompleksach enzymatycznych - rybosomach.

Struktura rybosomów u Euc. i Proc. jest podobna. U prokaryota są mniejsze, a typową cechą Euc jest obecność płatków na końcu korpusu mniejszej podjednostki.

Każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek:

• mała ma kształt embrionalny

• duża ma kształt łódkowaty ma miejsca aktywne A (miejsce aktywne - przyłącza się tRNA z aminokwasem) i P (miejsce peptydylowe)

oprócz tych dwóch miejsc występuje dodatkowo miejsce R w pobliżu A i miejsce E w pobliżu P.

Rybosom jest tzw. maszynerią translacji - dekoduje tylko część każdego mRNA.

Każdy mRNA zawiera zbiór kodonów kodujących białko zwany otwartą ramką odczytu (ORF). Każdy ORF wyznacza pojedyncze białko i zaczyna się i kończy w wewnętrznej części RNA.

Translacja zaczyna się w końcu 5` ORF. Zaczyna się od kodonu START u bakterii AUG, GUG, UUG, u Euc zawsze AUG!!!.

Kodon startowy ma dwie ważne funkcje:

• wyznacz pierwszy aminokwas

• określa ramkę odczytu dla wszystkich kolejnych kodonów

Koniec 3` kodonu - STOP - UAG, UAA, UGA

U Euc każdy mRNA posiada przynajmniej jezdną ramkę odczytu. U Proc ich liczba może być różna.

W związku z tym mRNA z jednym ORF - monocistronowe, z 2 i więcej - policistronowe.

Miejsce przyłączenia do rybosomu:

• u Euc - czapeczka

• u proc - sekwencje Shine - Dalgarno

ETAPY:

1. inicjacja

2. elongacja

3. terminacja

ad1)

Wymagane są tzw. czynniki transkrypcyjne. W pierwszej reakcji następuje dysocjacja rybosomu na 2 podjednostki:

-mniejszą - zbudowaną z frakcji 18SrRNA połączonej z ponad 30 białkami

-większą - zbudowaną z 3 frakcji: 28SrRNA, 5,8SrRNA, 5SrRNA i 40 różnych białek.

Każdy aminokwas który ma wejść do łańcucha polipeptydowego musi być zaktywowany i wstanie aktywnym przyłącza się do odpowiedniego tRNA.

Musi być to zgodne z antykodonem w tRNA. Przyłączenie odpowiedniego aminokwasu wymaga hydrolizy ATP i jest katalizowany przez transferazę amino - acylową tRNA.

ATP AMP który przyłącza się do grupy karboksylowej aminokwasu tworzy się kompleks

AAA-AMP jest przyłaczany do syntetazy aktywny kompleks połączenie z tRNA amino - acylo tRNA.

Aminokwas łączy się kowalencyjnie do sekwencji terminalnej CCA (do adeniny) w tym połączeniu aminokwas + tRNA jest zawarta energia chemiczna. U Euc aminokwas inicjujący to metionina.

WYKŁAD 15

Aminokwas zaktywowany przyłącza się do adeniny z -OH w sekwencji ACC na końcu rdzenia akceptorowego tRNA.

Każdy aminokwas ma własną syntazę amino-acylo-tRNA, która przyłącza aminokwas do odpowiedniego TRNA. Kompleks AA-AMP wiąże się kowalencyjnie do terminalnej sekwencji tRNA. W tym połączeniu AA z tRNA (=amino-acylo-tRNA)jest zgromadzona energia, która później jest wykorzystywana w tworzeniu wiązania peptydowego.

Syntazy AAtRNA występują w 20 różnych formach - każda dla jednego AA. W Eukariota wiele syntaz amino-acylo-tRNA tworzy duże agregaty dla wielu aminokwasów. W tych agregatach jest czynnik elongacyjny EF1alfa, który jest wymagany przy tworzeniu kolejnych wiązań peptydowych.

Enzymy (syntazy AAtRNA) zawierają mechanizm sprawdzający właściwe czytanie kodonów, który usuwa źle przyłączone aminokwasy. Przyłączenie kompleksu AA-AMP do enzymu, wywołuje w nim zmiany konformacyjne, które pozwalają na przyłączenie AA tylko wtedy, gdy jest on właściwy dla danego tRNA. Jeśli jest on niewłaściwy, to zostają zaindukowane zmiany, powodujący hydrolizę kompleksy i składniki (AA, AMP i tRNA) są uwalniane.

Przyłączenie AA z tRNA do właściwego kodonu w mRNA: dokładność przyłączenia jest kontrolowana przez syntazy amino-acylo-tRNA.

INICJACJA TRANSLACJI:

Kompleks aktywny (mała podjednostka, met-tRNA i GTP) przyłącza mRNA w obecności ATP, który ulega hydrolizie i uwalnia energię potrzebną do tego przyłączenia.

MRNA łączy się najpierw z małą podjednostką w miejscu czapeczki guaninowej. Po przyłączeniu mRNA następuje skanowanie go przez małą podjednostkę rybosomu, aż do punktu kodonu START: AUG.

To skanowanie przygotowuje kompleks do połączenia z dużą podjednostką. Następuje to w obecności GTP - powstaje kompletny rybosom z przyłączonym mRNA i tRNA gotowymi do translacji (faza elongacji).

Wszystkie te procesy zachodzą w obecności czynników inicjatorowych.

met-tRNA przyłącza się do mRNA w rybosomie (kodon AUG) w MIEJSCU P!!! (peptydowym) a nie jak normalnie w miejscu A (aminokwasowym).

W fazie elongacji tRNA przyłącza się w miejscu A. Inicjatorowy met-tRNA przyłącza się w miejsca P, które jest strukturalnie przygotowane do łączenia się z tRNA, który ma już łańcuch peptydowy. Ale na początku właśnie tRNA z pojedynczym, inicjatorowym aminokwasem przyłącza się właśnie w tym miejscu.

Miejce A jest przystosowane do przyłączaniu aminoacylotRNA połączonego tylko z 1 aminokwasem.

Po przyłączeniu met-tRNA do miejsca P, w okienku A pojawia się nowy kodon na mRNA i jest on rozpoznawany przez odpowiedni aminoacylotRNA z odpowiednim AA.

Na skutek aktywności transferazy peptydylowej, która jest częścią składową dużej podjednostki powstaje pierwsze wiązanie peptydowe.

Metionina z inicjatorowego tRNA w miejscu P łączy się a aminokwasem niesionym przez nowy AA-tRNA w miejscu A.

W tym czasie następuje hydroliza wiązania między met a inicjatorowym tRNA, a energia wytworzona jest wykorzystywana do tworzenia wiązania peptydowqego.

W miejscu A tRNA jest połączony z dwoma aminokwasami (dipeptydem).

tRNA pochodzi z formy aminoacylowej w peptydylową i przesuwa się do miejsca P z którego usuwany jest pusty tRNA inicjatorowy.

Proces elongacji odbywa się w obecności czynników elongacyjnych. Elongacja postępuje do czasu, gdy w miejscu A pojawi się kodon STOP: UAA, UAG lub UGA. Terminacja odbywa się w obecności czynnika terminacyjnego, który razem z GTP przyłącza się do miejsca A (kodon STOP), powoduje to hydrolizę wiązania między tRNA w miejscu P, a zsyntezowanym peptydem. Reakcja jest katalizowana przez transferazę peptydylową. Czynnik RF oddysocjowuje i cały rybosom rozpada się.

Aby białko było aktywne potrzebna jest obróbka potranslacyjna (bezpośrednio po translacji białka są nieaktywne): proces modyfikacji potranslacyjnych składa się z :

1. zwijanie białka - musi być odpowiednio zwinięte, żeby uzyskać odpowiednią strukturę 4-rzędową. O strukturze 4-rzędowej decyduje sekwencja AA w białku (strukturę 1rzędowa). Zwijanie białek jest procesem, w którym uczestniczą tzw. chaperony - nie wyznaczają one struktury, ale pomagają w jej osiągnięciu.

2. Cięcie proteolityczne - ma na celu:

1. Usunięcie krótkich odcinków z terminalnych obszarów N i C końców

2. Popiproteina jest cięta na segmenty, z których każdy jest aktywny

3. Często u Euc., rzadko u bakterii.

Tej modyfikacji poddawane są białka wydzielnicze, których biochemiczna aktywność może być szkodliwa dla komórek produkujących to białko, np. jad pszczeli (mellitina) jest wydzielany jako nieaktywny prekursor z dodanymi AA na końcu N, jest ona wydzielana na zewnątrz, gdzie proteazy odcinają dodatkowe AA i powstaje aktywny jad.

Insulina jest produkowana jako pre-pro-insulina. Odcinane są z N-końca 24AA sygnalne - powst. pro-insulina, potem nast. 2 cięcia wycinającie centralną część białka i pozostają aktywne 2 strony łańcucha a i b połączone mostkami 2-siarczkowymi i powstaje aktywna insulina.

3. modyfikacja chemiczna obejmuje: glikozylację, acetylację metylację, fosforylację. Glikozylacja to przyłączenie gr. Cukrowej przez O przez grupę hydroksylową Ser lub Thr lub gr. Cukrowa jest włączana poprzez N przez grupę aminową bocznego łańcucha Asn.

Dodawanie grup chemicznych przy udziale specyficznych enzymów, które dodają te grupy do bocznych łańcuchów AA lub ich grup aminowych/karboksylowych w AA terminalnych.

Chemiczna modyfikacja białka determinuje jego aktywność biochemiczną i regulacyjną w przekazywaniu sygnałów międzykomórkowych i w ekspresji genów.

Posttranslacyjna obróbka histonów (ma szczególne znaczenie w regulacji ekspresji genów) - szczególnie acetylacja, metylacja i fosforylacja, która zachodzi na końcach histonów H3 i H4 (rzadziej w H2A i H2B) szczególnie w Lys, Arg, Ser. Od modyfikacji chemicznej histonów zależy jak DNA wiąże się z oktemerem nukleosomu dostępność genów dla aparatu translacyjnego.

DNA jest metylowany - odpowiednie wzory cytozyn warunkują czy gen jest aktywny czy nie i w jakim stopniu.

Wysoka metylacja DNA świadczy o nieaktywności genu. Czasami jednak metylacja powoduje aktywacje genów (uwalnia jego ekspresję). Jeżeli metylacja uwalnia ekspresję, to znaczy że gen był zablokowany przez transpozon. Metylacja wyłącza transpozon. Metylacja odcinka insulatorowego sprawia, że białko blokuje izolator, nie może się od połączyć (bo zmieniła się struktura) i geny zaczynają działać.

4. przyłączanie lipidów do białek (głównie do Ser i Cys).

34

---