Podstawowe procesy biotransformacji steroidów

Str 14

Jedne organizmy będą wprowadzać grupę karboksylową w konfiguracji beta, inne w C11 alfa, a jeszcze inne w takiej lub innej w zależności od rodzaju podstawników. Wprowadzenie grupy hydroksylowej C17 powoduje, że wprowadzona do grupy C11 jest grupą o konfiguracji beta.

Mechanizm hydrokylacji jest zwykle identyczny. Różnica wynika albo ze specyficzności enzymu, albo obecności jakiejś grupy.

Str 15

Gdyby podać kortyzol mikroorganizmom, to wprowadzając grupę hydroksylową w pozycji 11 nastąpiłoby odłączenie łańcucha bocznego, mógłby być odtworzony pierścień laktozowy. Wprowadzenie wiązania podwójnego w pierścieniu jeden nie powoduje usunięcia łańcucha bocznego.

Str 16

Jak to robione jest w przemyśle

Albo reakcja jest prowadzona tak, że łańcuch boczny jest usuwany i utleniana grupa hydroksylowa w pozycji 3 - otrzymujemy testosteron. Albo w wyniku przekształceń chemicznych jest skracany łańcuch boczny i przy udziale odpowiednich organizmów jest to bez wywalenia łańcucha bocznego przekształcenie do steroli 21.

Str 1: wykład 5 biotech 2.ppt

U bakterii nie ma steroli, są ich odpowiedniki - hopanoidy.

Biotransformacje można obserwować w zawiesinach komórkowych z roślin. Głównie mamy do czynienia albo z redukcją albo utlenieniem, usuwaniem wiązania podwójnego, wprowadzanie grup karboksylowych, karbonylowych, a także glukozylacja.

Glukozylacja służy zwiększeniu rozpuszczalności. Taki związek jest nieaktywny biologicznie - gibereliny są tak przechowywane w organizmie rośliny. Wpływa to też na lotność związków. Jeśli glukozyluje się związki lotne, to ten parametr przestaje być dla nich charakterystyczny

2.

Przykład, w jaki sposób hodowle zawiesinowe wpływają na związki sterydowe. Katenoid, steroid, gdzie został łańcuch skrócony o 4 atomy węgla i powstał pierścień laktozowy. Takie zawiesiny wprowadzają grupy hydroksylowe, mogą powodować izomeryzację niektórych podstawników pierścienia, czy grupy hydroksylowej oraz glukozylację zarówno 3-pochodnej, jak i naturalnego związku.

3.

Oprócz tego, że można otrzymywać związki naturalnie nie występujące w roślinie, można wykorzystując kardenolidy i korzystając z zawiesin komórkowych można wykorzystywać rośliny do produkcji tych związków. Albo otrzymujemy glikozyd kardenolidu. Same kardenolidy występują, ale podstawnikami są cukry inne niż glukoza. Jeśli mamy do czynienia z żeńszeniem, podstawiane są podstawniki występujące u saponin żeńszenia.

Soforoza - dwie glukozy. Mamy więc coś, co pochodzi z jednej rośliny i coś, co jest metabolitem wtórnym u drugiej rośliny.

4.

Prowadząc hodowle zawiesinowe można w organizmach Digitalis otrzymywać glikozydy aglikonów różne od naturalnych manipulując stężeniem glukozy w pożywce. To, co jest produkowane przez daną zawiesinę zależy od składu zawiesiny. Jest to przykład, że zmiana stężenia glukozy w pożywce powoduje, że naturalnie występujący triglukozyd jest zastąpiony glukozą - jeśli jej stężenie jest 8%.

5.

Biotransformacja steroidów - regulacja procesów.

Im niższe stężenie, tym ilośc cząsteczek, które mają indukować, tym mniej induktora.

Ważna jest ilość tlenu w pożywce, czy rozpuszczalnik użyty do podania związku - bo to, co podajemy jest zwykle mało rozpuszczalne. Sterole rozpuszczają się zwykle 1mg/L.

Tak więc, żeby je rozpuścić, bierze się rozpuszczalnik organiczny i dodaje wody.

Ale nie dodaje się metanolu do wody, tylko wodę do metanolu - związki w metanolu się nie wytrącą.

Jeśli się zrobi odwrotnie - woda do metanolu - to metanol gwałtownie traci stężenie.

„Inhibicje enzymu można odwrócić, inaktywację nie”

Wszystkie procesy hydroksylacji wymagają dodania jakichś czynników redukujących. Tak więc nie można przeprowadzić tego przy pomocy hydrolaz, a wykorzystując organizmy. To, że się wykorzystuje organizmy, prowadzi do tego, że trzeba zapewnić możliwość, aby te związki mogły przenikać przez błonę.

6.

Można uzyskiwać związki naturalnie nie występujące w roślinach które mogą wykazywać właściwości biologiczne nas interesujące. W lukrecji występuje kwas glicyrytynowy - sapogenina triterpenowa, a jego glikozyd - saponina tripertenowa (glicyryzyna).

7

Jeżeli kwas glukuronnowy dodamy do hodowli tej rośliny, wcale nie otrzymamy naturalnie występującej w niej saponiny, a dwie różne saponiny. Jedną taką, w której cukier jest wiązany wiązaniem glikozydowi-estrowym z grupą karboksylową, wa w drugim - glikozyd, który w pozycji 3 ma łańcuch ni disacharydowi, a trisacharydowy - dodatkowa arabinoza.

Jeśli ten sam kwas glicytrynowy poddamy hodowlom tkankowym korzeni włośnikowych to otrzymamy związek analogiczny, ale następuje hydroksylacja w pozycji 4 i taki glikozyd jest dodatkowo hydroksylowany, w pozycji 4' i 16. Powstają związki, które naturalnie w lukrecji nie wystepują.

8.

Biotransformacje mogą być wykorzystywane do produkcji substancji słodzących.

Stenia rośnie w Brazylii, na Bałkanach

Można z niej otrzymywać stewiozyd i jest to tańsze, niż produkcja stewiozydu, niż z kultur zawiesinowych.

Normalnie, jeśli się weźmie ze Stevii kulturę zawiesinową, to się nie uzyska odpowiednich glikozydów, ale jeśli mamy kultury zawiesinowe Digitalis i Stevii, to otrzymujemy mieszaninę dwóch glikozydów - stewiolobiozydu i stewiozydu.

Jeśli weźmiemy kawę arabską, to glikozylacja zachodzi w obu pozycjach, tyle, że nie są przyłączane 2 cząsteczki glukozy, a jedna. Powstaje więc związek, który wciąż jest 100x słodszy od sacharozy.

Są to triterpeny. Powstają z czterech jednostek pięciowęglowych.

8.

W zależności od tego, jaki związek podajemy, a więc który z metabolitów pośrednich podajemy, będziemy otrzymywali produkt końcowy z różną wydajnością. W tymianku pospolitym produkowane są monoterpeny - tymol i paracymenol. W zależności od tego, czy związkiem wyjściowym jest gamma terpinen podawany do medium, czy para- cymen (związek pośredni), to wydajność produkcji tymolu jest różna. Jeśli p-cymen jest podawany, wydajność wzrasta 10k-krotnie. Gamma terpinen wnika do jakiejś przestrzeni gdzie przechodzi w para-cymen i jakiś alkohol, ale utrudnione jest stamtąd para-cymenu do przestrzeni, gdzie może być przekształcany do tymolu przez inny enzym.

A wiec cza pamiętać o przestrzennej gospodarce metabolitów u roślin.

Limonen - może być przekształcany w karwon, który jest związkiem wyjściowym dla kosmetyków.

Menton - jeśli podawany, to może być przekształcany w mentol. A ten może być glikozylowany. Jeśli dodałoby się ten glukozyd, to okazałoby się, że ani to nie ma smaku mięty, ani efektu, ani zapachu - glukozylacja powoduje zanik lotności.

9.

Kumaryny - jak się zetnie siano, to zapach nad skoszoną łąką to zapach kumaryn, które są uwalniane.

Na ogół występują wakuoli. Uwolnienie ich z wakuoli, gdy siano schnie - zniszczona błona. Występują wwakuloli w postaci glukozydów, cukry zostają uwolnione, a aglikon jako że jest letny, daje miły zapach.

Jak się ktoś nażre kumaryn, mogą być objawy jak przy oparzeniu.

Rośliny w ten sposób walczą z larwami, które żywią się liścmi. Jeśli owad nie ma jakiejś formy zabezpieczenia się. Jedną z tych form są larwy, które zawijają liście. Jak liście SA zawinięte, jest cień. A więc reakcje fotodynamiczne są zablokowane i larwy przeżywają.

Niektóre z zawiesin są w stanie przeksprowadzać tylko jednąglukozylację, np. nawrot podowuje glukozylację w pozycji 6, a Datura- 6 lub 7.

To, że nawrot daje tylko szóstkę, to nie dlatego, że enzym potrafi glikozylować jedną grupę, a dlatego, że nie ma gdzie.

Jeśli się weźmie kulturę z tytoniu, to okaże się, że w ogóle nie potrafi hydroksylować kumaryn, a w pozycji osiem daje grupę metylową.

Z kolei psianka potrafi glikozylować związki, gdzie jedna z grup jest glikozylowana.

Psianka… .buahaahah

Trzeba więc dobierać takie zawiesiny, które będą przeprowadzać dane reakcje. Ciągle trzeba pamiętać o tym, że to, że jakiś związek występuje u rośliny nie znaczy to, że hodowle zawiesinowe, czy kultury tkankowe są go w stanie syntetyzować - bardzo często nie są. Był to kłopot w przypadku taksonu, bo hodowle nie są w stanie od zera doprowadzić do powstania produktu końcowego.

Na drodze chemicznej jest to bardzo trudne.

Dlatego połączona jest metoda biotechnologiczna z chemiczną.

10

11

12.

Związki łatwe do otrzymania na drodze chemicznej są podawane jako substrat.

W winkrystynie grupa metylowa jest utleniana do aldehydowej.

Do przekształceń można używać frakcji enzymatycznej lub zawiesiny komórkowej

Czego użyć do produkcji winkrystyny? Czy enzymatycznej frakcji, czy frakcji enzymatycznej, czy nie ma to znaczenia?

Utlenienie wymaga kofaktorów - związków zredukowanych. Jeśli chcemy winkrystynę, można użyć frakcji komórkowej, jeśli winblastynę - frakcji enzymatycznej.

Utlenienie grupy metylowej wymaga.

13.

Podsumowanie j akie czynniki wpływająca biotransformacji wydajność?

Rodzaj kultury - procesy glukozylacji.

W każdym stadium rozwoju hodowli zawiesinowej wydajnośc glikozylacji nie będzie identyczna. Wiadomo, że glikozylacja zachodzi lepiej, gdy komórki są starsze- mają dobrze wykształcone wakuole.

Dlatego, że glikozydy są magazynowane w wakuolach.

14.

Zależy to też od tego, co jest w podłożu. W przypadku glikozydów z naparstnicy obecność określonego stężenia glukozy powoduje, że powstają związki, z innego typu łańcuchem cukrowym, niż te, które normalnie w roślinie.

Na biosyntezę związków mogą wpływać inne czynniki - np. na syntezę antocyjanów źródło azotu.

Same antocyjany nie mają azotu… Jedynie fenyloalanina, która jest tam jakimś prekursorem.

Antocyjany w zależności od pH zmieniają barwę. W kwaśnym czerwone, w zasadzie - niebieskie.

Kwiaty hoduje się na podłoży kwaśnym Lub zasadowym i barwa kwiatu może być różna.

Wakuola na ogół jest kwaśna, tyle, że może być bardziej kwaśna albo mniej.

Rodzaj cukru, który jest w podłożu może wpływać na wydajność.

W przypadku antocyjanów najlepszym cukrem jest glukoza, fruktoza i sacharoza, a wiele innych sacharydów wręcz hamuje na formowanie antocyjanów.

Taksol, czy antocyjany są w pewnej formie związkami obronnymi.

15,

Format, w jakim podajemy substraty też się liczy. Robi się to czasem w układach dwufazowych.

Albo związki występują w jednej fazie, zawiesina jest w drugiej i na granicy jest reakcja.. albo z kolei dwie fazy pomagają w usuwaniu produktu. Jeśli jest to produkt trudno rozpuszczalny, jest to produkt przechodzący do fazy o niższej polarności - łatwiej go wtedy oddzielić od zawiesiny komórkowej. Często stosuje się rozpuszczalniki organiczne - jak chcemy ekstrahować lipidy z uwodnionej tkanki, stosujemy coś, co miesza się z wodą w stopniu nieograniczonym lub stosujemy układy dwufazowe.

16

Żeby mieć wysoką wydajność, z jednej strony trzeba umożliwić dotarcie substratom do miejsca, gdzie zachodzi przekształcenie, a z drugiej strony umożliwić usuwanie z tej przestrzeni produktów. Na ogół można wpływać na błony cytoplazmatyczne przez związki, które albo mogą powodować częściową dezorganizację błony - bo są związkami o charakterze hydrofobowym, w związku z tym łączą się z lipidami błony i powodują, że stają się one ubogie w lipidy. Wówczas ich przepuszczalność dla różnego związków wzrasta.

Stosujemy również układy dwufazowe - związki przechodzą do drugiej fazy i opuszczają środowisko reakcji i nie hamuje reakcji.

17

ŚCIEKI, KŁAKI I ZGRZYTANIE ZĘBÓW

Pozyskiwanie metali z hałd - ścieki stałe.

Hałdy posiadają dużo pirytu - siarczku żelaza. Z drugiej strony mogą zawierać sporo metali ważnych z punktu widzenia przemysłu.

Na hałdach na ogół trudno jest to zorganizować w ten sposób, że mamy probówkę z bakteriami, które są w stanie przeprowadzić wypisane reakcje. Oszem, bakterie można wylać, tylko później trzeba czekać, aż one same tam wzrosną i swoje środowisko stworzą same zaczną to same przekształcać.

Teraz dba się o to, aby hałdy nie były rzucone na ziemie, a żeby miejsce na którym są składowane odpady, by było wyłożone foliami, czy substancjami, które uniemożliwiają wchłanianie się roztworów do gleby.

Jeśli one się pojawiają, to można je odprowadzać.

Ilości kwasu siarkowego, które powstają sprawiają, że bakterie muszą się charakteryzować tolerancyjnością pH, bo inaczej wezmą i skisną.

Hałda musi być dobrze natleniona - musi być duży dostęp tlenu.

Żelazo na drugim stopniu utlenienia - może zamknąć cykl i spowodować że następne cząsteczki siarczków metali będą pozyskiwane

18.

Żelazo na drugim stopniu utlenienia jest przekształcane do trzeciego. Reaguje z uranem, który jest rudno rozpuszczalny. Powstaje siarczan (VI) uranylu i łatwo go z hałdy wymyć, bo jest łatwo rozpuszczalny. Siarczan VI żelaza II wraca do obiegu i jest wykorzystywany do wymywania tlenku uranu IV.

19.

„Hałda hałdzie nierówna…”

Niektóre hałdy są bardziej… hmm.. nie dosłyszałem.

W każdym razie nie ulega wątpliwości, że jedne są bardziej płaskie… inne mniej płaskie. Ma to chociażby wpływ wzrost trawnika. Na hałdzie płaskiej trawnik rośnie w górę, na pochyłej, w bok. (Przyp. tłum.)

Dodatkowo, z punktu widzenia biochemika odpadów metalowych, niektóre hałdy są bardziej natlenione, inne mniej.

Jeśli enzymy są wydzielane na powierzchni, ważne jest, aby się adsorbowały na powierzchni metalu.

20. W jaki sposób przyroda nauczyła się tolerować Metal:

Organizmy posiadają również zdolność do wiązania metali wewnątrz komórek. Wchłaniają metale i wiążą je.

Wiele roślin ruderalnych żyjących na hałdach są w stanie przeżyć, bo wchłaniają metale wiążą je w postaci siarczków organicznych, czyli siarczków, które są krótkimi polipeptydami zawierającymi duże ilości cysteiny. Związki te są nierozpuszczalne są nieszkodliwe dla tego organizmu.

Z naszego punktu widzenia fajne byłoby, gdyby nie były magazynowane w korzeniach, a w liściach… bo korzenie trzeba wykopać, a liści nie - zakładając, że nikt ich wcześniej nie zakopał.

Kwas tejchonowy - „jest czynnikiem, który wiąże jony fosforanowe”. Ee.. do sprawdzenia.. W przypadku kwasu tejchuronowego, obok reszt tych jest grupa karboksylowa, która wiąże jony.

21

Oczyszczanie hałd z jonów rtęci. Jony rtęci przekształcane są do rtęci metalicznej.

---