Criopreservación de células progenitoras de cordón umbilical
Autores: Thalía Itzel Ferrera Velázquez, Alejandra Ruiz Ortiz
Preparatoria “Fernando R. Rodríguez”
Resumen
La criobiología es la ciencia que estudia el comportamiento de los seres vivos y sus constituyentes a muy bajas temperaturas. La criopreservación del material biológico tiene por objetivo mantenerlo en un estado viable para que sea utilizado con fines terapéuticos en transplantes y pueda llevar a cabo su función fisiológica después del implante. Un material biológico criopreservado (para su posterior utilización) son las células de sangre de cordón umbilical, ya que son consideradas como una fuente importante para la obtención de células progenitoras. Estas se han utilizado recientemente debido a la reducida inmunocompetencia que presentan. Otra característica fundamental es el gran potencial de proliferación que poseen las células fetales. Estas células se obtienen del cordón umbilical y tejido de la placenta de mujeres embarazadas al momento del parto; tomando en cuenta una información previa con respecto al tipo de liberación, peso de la placenta, peso, sexo y condición del infante.
Diversas enfermedades hematológicas, malignas y no malignas, han podido ser tratadas a través de células progenitoras hematopoyéticas. Durante mucho tiempo la médula ósea constituyó la única fuente para la obtención de estas células; sin embargo, recientemente se han empleado dos fuentes alternativas: células de médula ósea movilizada y la sangre de cordón umbilical.
Criopreservación de células progenitoras de cordón umbilical
INTRODUCCIÓN
Durante los últimos años, el uso de la sangre extraída del cordón umbilical y de la placenta ha ido en aumento, como una fuente importante de células progenitoras hematopoyéticas (CPH) debido a las ventajas en su recolección, procesamiento, almacenamiento (criopreservación) y uso terapéutico en comparación con las células progenitoras hematopoyéticas obtenidas de médula ósea y sangre periférica.
“La criopreservación surge en 1949, cuando los investigadores Polge, Smith y Parkes demostraron el restablecimiento de espermatozoides de toro después de ser sometidos a vitrificación y deshidratación a bajas temperaturas en presencia de glicerol (considerado como el primer agente criopreservante)” (Ávila Coria, 2003, p.7)
Para 1955, Barnes y Loutit utilizaron la técnica de Polge, Smith y Parkes demostrando que la medula ósea de rata podía ser preservada en congelamiento. Posteriormente Loveck Bishop, en 1959, empleó el dimetilsulfóxido como agente criopreservante, surgiendo de esta manera la inquietud de saber que pasaba con la sangre de cordón umbilical al ser sometida a este proceso y cuestionándose también sobre la mejor manera de obtenerla, y tener una adecuada criopreservación. El primer intento de transplante documentado de sangre de cordón fue realizado en 1963 en un paciente con diagnóstico de linfogioscarinoma. Sin embargo, hasta los 80 s el transplante de cordón umbilical fue aceptado para tratar a pacientes con enfermedades malignas y no malignas. Se realizaron una serie de estudios biológicos que demostraron que las células progenitoras hematopoyéticas (células madre) presentes en la sangre del cordón umbilical, eran similares a las de la médula ósea del adulto.
En 1983 Boyse observó que las células madre procedentes de cordón umbilical, mantenían su viabilidad durante dos o tres días a temperatura ambiente; y después de ser sometidas a un proceso de criopreservación tenían una mayor capacidad para formar colonias.
En 1988 se realizó en Paris a cargo de la Dra. Ellian Gluckman, el primer trasplante exitoso con sangre de cordón umbilical, en un niño de 6 años afectado de anemia de Fanconi. “El cordón procedía de un hermano que era HLA idéntico. Este éxito llevó a la realización de alrededor de 200 trasplantes en los siguientes 5 años, utilizando sangre de cordón umbilical (SCU) de hermanos con HLA idéntico” (Ávila Coria, 2003, p.7).
A partir de numerosos estudios y por la necesidad de tener sangre de cordón umbilical disponible para trasplantes de células madre hematopoyéticas, aparecieron los primeros bancos de sangre de cordón umbilical (BSCU). En 1993 se constituyó en el Centro de Sangre de Nueva York el primer banco público de SCU; y en 1995 se fundó el grupo Eurocord con sede en París, con la finalidad de crear un registro de trasplantes de sangre de cordón umbilical con un seguimiento de los pacientes y un foro para el desarrollo de estudios cooperativos.
Los BSCU son centros de salud dedicados a la recolección, procesamiento, estudio, criopreservación y validación de sangre de cordón umbilical para su óptimo uso clínico, principalmente en trasplantes para restaurar las funciones hematopoyéticas de la médula ósea. Las ventajas de los BSCU son muchas, de las cuales podemos mencionar las más importantes: la fácil obtención de unidades de sangre de cordón umbilical, la estandarización de los procedimientos realizados a dicha unidad hasta su criopreservación, los rigurosos controles de calidad a los cuales son sometidas estas unidades, la disponibilidad inmediata; y la posibilidad de encontrar grupos HLA poco frecuentes debido al gran número de unidades almacenadas.
La fundación NETCORD fue establecida en 1998. Está conformada por numerosos institutos y directrices que promueven estudios de investigación sobre la colecta, procesamiento, caracterización, criopreservación y actualmente la expansión ex vivo de las células madre hematopoyéticas, con el objetivo de promover y proveer la calidad de la terapia celular en la clínica a nivel internacional.
Esta red internacional, ha desarrollado los estándares NETCORD/FACT (Foundation for the Accreditation of Hematopoietic Cell Therapy), que son actualmente los que dictan el funcionamiento de los BSCU en el mundo y están agrupados en el documento International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release, mismos que han sido adoptados por diversas sociedades internacionales.
Actualmente NETCORD agrupa 16 BSCU no emparentados en todo el mundo. El inventario de SCU mundial es mayor a las 105,000 unidades criopreservadas. Existen actualmente poco más de 100 bancos de sangre de cordón umbilical en el mundo. Estos bancos se encuentran principalmente en países de primer mundo, distribuidos geográficamente de la siguiente manera: 40% se encuentran en los países de la Unión Europea, el 30% en los Estados Unidos de América y Canadá, otro 20% en los países Asiáticos (Japón principalmente) y el otro 10% de estos bancos se encuentran en Australia. Los países de América Latina cuentan con muy pocos bancos de células madre hematopoyéticas y en los países africanos no existen estos centros.
En México, la Secretaria de Salud desarrolló el primer banco de sangre de cordón umbilical gubernamental a cargo del Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea (CNTS), iniciando el Programa Nacional de Sangre Placentaria, cuyo objetivo principal es brindar a los servicios de salud pública unidades de células progenitoras hematopoyéticas y a los centros de transplantes en los que sean requeridas, también establece los modelos para la realización de la normas de calidad que deben seguir los bancos de sangre de cordón umbilical particulares, que se encuentran brindando el servicio de criopreservación dentro del territorio nacional. “En diciembre del 2004 el Banco de Sangre de Cordón Umbilical (CordMX) del Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea se certificó dentro del sistema ISO9001:2000” (Banco de Sangre de Cordón Umbilical del Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea). Además de trabajar bajo los estándares internacionales impuestos por NETCORD/FACT, realiza los procedimientos de obtención, procesamiento y criopreservación de las células madre hematopoyéticas mediante metodologías totalmente automatizadas, lo que permite el desarrollo de controles que verifiquen, tanto la calidad funcional del producto (calidad hematopoyética de las células madre), como la seguridad del receptor de dicha unidad (seguridad transfusional del paciente).
Cabe mencionar que todos y cada uno de los hospitales inscritos al programa de obtención de sangre de cordón umbilical, cumple con la función de informar a las futuras madres los beneficios de la donación y la correcta recolección de las unidades de sangre de cordón umbilical. México también cuenta con un marco jurídico, en la Reforma de la Ley General de Salud que se realizó en el año de 1997, documento en el cual se incluyen los términos de “célula” y “células progenitoras hematopoyéticas”, sólo en referencia a aspectos terapéuticos en casos de transplante. Es importante señalar que la Ley General de Salud de México no prevé algún control sobre el uso de las células troncales humanas con fines de investigación.
Debido a la inclusión de estos términos fue necesario modificar y actualizar el reglamento de la Ley General de Salud en materia de disposición de órganos, tejidos, células y productos humanos, lo que permite tener congruencia entre los instrumentos jurídicos y los avances científicos y técnicos de los trasplantes de progenitores hematopoyéticos a pacientes dentro del territorio nacional.
En los últimos años, se ha considerado el estudio de ciertos padecimientos hematológicos, los cuales han impulsado el estudio de la capacidad de las CPH presentes en la sangre de cordón umbilical. Esta línea celular es utilizada actualmente para transplantes alogénicos (en pacientes no relacionados), en padecimientos genéticos, inmunitarios y sanguíneos; por ejemplo: leucemias, linfomas, síndromes mielodisplásicos, enfermedad de Hodgkin y enfermedades autoinmunes, por mencionar algunos (Ballen, 2005, p.105)
La sangre del cordón umbilical se define como “la sangre periférica fetal que se encuentra dentro de la vena de la sección del cordón umbilical” (Miñana, 2003, p.73-89). Se ha demostrado que la principal característica de la sangre de cordón umbilical es el contenido suficiente de células progenitoras hematopoyéticas y subpoblaciones de células formadoras de colonias mixtas (CFC) para llevar a cabo la reconstitución de las funciones de la médula ósea, cuando ésta se encuentra alterada en ciertos padecimientos.
Las principales ventajas de utilizar la sangre contenida en el cordón umbilical como una fuente de obtención alternativa de células madre hematopoyéticas son:
El alto número de CMH en la sangre de cordón umbilical, con la capacidad de proveer un injerto medular de larga duración en los pacientes trasplantados.
La facilidad de su obtención, ya que se colecta durante el parto y directamente por punción de la vena del cordón umbilical.
Ausencia de riesgo para el donante, ya que la colecta de sangre no involucra directamente a la madre ni al bebé.
Posibilidad de obtención de muestras provenientes de grupos étnicos minoritarios.
Baja prevalencia de ciertas enfermedades transmisibles, principalmente virales, los cuales pueden generar una gran morbilidad y mortalidad de los pacientes que reciben un trasplante.
Disponibilidad casi inmediata de las unidades de sangre de cordón umbilical ya almacenadas, lo que permite realizar trasplantes de urgencia.
Inmediata disponibilidad de unidades para trasplante, ya que estas se encuentran almacenadas en gran cantidad y por tiempos prolongados.
Muy baja incidencia de enfermedad injerto contra huésped (EICH), debido a la supuesta posible tolerancia de diferencia en el sistema HLA.
Uno de los problemas que plantea el uso de sangre de cordón umbilical como fuente de células madre hematopoyéticas (CMH s) es que el transplante está limitado a pacientes pediátricos o adultos que no excedan los 50 Kg de peso corporal, debido a que el número de células madre captadas de esta fuente es insuficiente, lo que ha generado interés prioritario en el diseño de métodos que permitan la expansión ex vivo de las células madre hematopoyéticas.
Las ventajas de expansión de CMH s ex vivo permitirán una notable disminución del tiempo de recuperación de todos los elementos sanguíneos, que incluyen los de la serie mieloide y linfoide, tras la quimioterapia y el trasplante.
También permitirá eliminar toda posibilidad de trasplantar una célula con tendencias carcinogénicas que puedan en un futuro generar serios problemas en el paciente trasplantado.
“Las células madre hematopoyéticas son definidas como células con capacidad de perpetuar por si mismas por medio de un proceso de autorenovación” (Ruiz-Argüelles, 1994, p.16-24), lo cual resulta en progenies con las mismas características de célula madre (fenotípicamente primitiva) y células comprometidas a diferenciarse hacia una línea celular hematopoyética definida, ya sea mieloide o linfoide. En condiciones normales estas células se localizan en el estroma medular dentro de la médula ósea. El estroma medular es un complejo funcional al cual se le conoce como microambiente inductivo hematopoyético (MIH), el cual está constituido por fibroblastos, células reticulares, así como por colágena I, III y IV, fibronectina, hemonectina, trombospondina y factores de crecimiento (factores hemolinfopoyéticos). Los componentes del MIH son necesarios para la estimulación de la autorenovación y diferenciación de las células madre hematopoyéticas, además de la maduración de células comprometidas a un linaje celular, ya sea por interacciones célula-célula o interacciones célula-factor de crecimiento. Actualmente, se continúa con los estudios que harán posible practicar procedimientos adecuados de expansión ex vivo de las células progenitoras hematopoyéticas contenidas en cordón umbilical, principalmente para su uso en pacientes adultos con padecimientos indicados para el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas.
Las ventajas que nos brinda la expansión ex vivo de las células madre, son:
a) La disminución del tiempo de recuperación de las funciones de la médula ósea después de la quimioterapia o trasplante;
b) La eliminación de las células carcinogénicas de una unidad a trasplantar;
c) La manipulación del estroma para generar un ambiente inductivo hematopoyético apropiado para acortar los periodos de recuperación de neutrófilos y plaquetas.
“Actualmente se trabaja en la creación de bioreactores, con el objetivo de encontrar las interacciones entre células y ambiente, para poder llevar a cabo la diferenciación a ciertas líneas celulares de interés terapéutico” (William, 2001, p.14). La importancia de la búsqueda de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas en tipos celulares específicos, los cuales podrían usarse en el tratamiento de ciertos padecimientos crónico degenerativos donde se necesite la inclusión de estas líneas celulares buscadas para regeneración de los tejidos afectados, como el tejido cardiaco y el tejido neuronal. Otros sistemas en desarrollo tienen como objetivo de estudio la expansión UFC-Meg (Unidades Formadoras de Colonias de Megacariocitos), esto con el fin de disminuir en un futuro la necesidad de transfusión de plaquetas y en un futuro de todos los componentes de la sangre.
OBJETIVO
El objetivo del presente trabajo es realizar una investigación documental con el fin de dar a conocer el proceso de criopreservación de células progenitoras de cordón umbilical.
METODOLOGÍA PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE SCU
“La criobiología es la ciencia que estudia el comportamiento de los seres vivos y sus constituyentes a muy bajas temperaturas” (Ávila Coria, 2003, p.7). La preservación del material biológico a temperaturas criogénicas consigue detener las reacciones biológicas. La criopreservación del material biológico tiene por objetivo mantenerlo en un estado viable para que sea utilizado con fines terapéuticos y pueda llevar a cabo su función fisiológica después del implante.
Un material biológico criopreservado (para su posterior utilización) son las células de sangre de cordón umbilical, ya que son consideradas como una fuente importante para la obtención de células progenitoras. Estas se han utilizado recientemente debido a la reducida inmunocompetencia que presentan, por lo que la probabilidad de producir una enfermedad de injerto contra huésped (EICH) es mínima. Otra característica fundamental es el gran potencial de proliferación que poseen las células fetales.
Estas células se obtienen del cordón umbilical y tejido de la placenta de mujeres embarazadas al momento del parto; tomando en cuenta una información previa con respecto al tipo de liberación, peso de la placenta, peso, sexo y condición del infante.
Las células nucleadas o progenitoras hematopoyéticas son sometidas a congelamiento y descongelamiento, tomando en cuenta la existencia de células resistentes y débiles para poder determinar el tiempo y la temperatura de resistencia.
La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación; las bajas temperaturas afectan la difusión y ósmosis a través de las membranas y cada célula maneja su propio perfil biofísico, el cual interactúa con diferentes criopreservantes celulares. “Los criopreservantes son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto eutéctico de una solución dada, (punto en el cual una composición dada de A y B solidifica como un elemento puro)” (Ramírez, 2006, p.24), el descenso del punto eutéctico implica que se alcanzará una concentración dada de solutos a una temperatura menor, de forma que la célula estará mas deshidratada y el gradiente osmótico al que estará sometido será menor.
Bioquímicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores: los alcoholes (metanol, etanol, propanol, 1-2 propanediol y glicerol), azúcares (glucosa, lactosa, sucrosa, sacarosa) y el dimetil sulfóxido. Los crioprotectores pueden clasificarse en agentes penetrantes y no penetrantes de acuerdo a la permeabilidad celular.
La ventaja de la criopreservación es que por debajo de -196°C no se producen reacciones químicas de significación biológica, y debido a ello es posible conseguir un almacenamiento indefinido. El problema es la repercusión que los procedimientos de congelación-descongelación tienen sobre los diferentes tipos celulares.
Los crioprotectores actúan incorporando moléculas de agua y disminuyendo la velocidad en el crecimiento de los cristales de hielo, lo que evita un aumento brusco de la concentración de solutos extracelulares.
Permiten emplear un ritmo de enfriamiento tal, que no se pierda tanto líquido intracelular que causé la deshidratación, pero manteniendo al mismo tiempo una concentración de solutos intracelulares suficientes como para minimizar la aparición de cristales en el interior de la célula.
Los crioprotectores penetrantes son sustancias muy solubles en agua, de bajos pesos moleculares y permeables a través de la membrana celular. Por su capacidad de unirse a las moléculas de agua, reducen la cantidad de hielo formado a cualquier temperatura, y por lo tanto la concentración de solutos. Trabajando a velocidades lentas reducen la deshidratación celular hasta un límite tolerable; si el crioprotector no penetrara dentro de la célula contribuiría a la lesión por deshidratación osmótica en lugar de prevenirla. Los crioprotectores penetrantes más utilizados son: DMSO, glicerol, 1,2 propanodiol, acetato amónico, acetato de trimetilamina, etanol, metanol, etc.
Los crioprotectores no penetrantes son sustancias de alto peso molecular, que a concentraciones molares reducidas, protegen a las células a velocidades altas de congelación. Su utilidad abarca a pocas especies celulares aunque, asociados a los crioprotectores penetrantes, mejoran su rendimiento. Entre estos agentes se encuentran: hidroxietil-almidón (HES), polivinil-pirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG), dextrano, glucosa, dextrosa, sacarosa, etc.
Una de las mayores limitaciones para el empleo de los crioprotectores es que pueden producir toxicidad celular bioquímica, aunque los mecanismos exactos son pocos conocidos. Las hipótesis actuales suponen que, a temperaturas elevadas, habría una interacción de tipo hidrofóbico entre el crioprotector y las proteínas, que depende también de la concentración del agente y que tendería a estabilizar el estado desnaturalizado de las mismas. A temperaturas bajas predominaría el carácter hidrofílico del compuesto, como en el caso del DMSO, incluso a elevadas concentraciones del mismo, con interacciones hidrofóbicas débiles que favorecerían el mantenimiento del estado nativo de las proteínas.
Cabe mencionar que cuando los crioprotectores no se eliminan de la muestra y esta va a ser infundida, hay que tener en cuenta los posibles efectos nocivos que se pueden producir en el receptor.
Requisitos para que una mujer sea candidata a donación de células progenitoras obtenidas de cordón umbilical.
Para la obtención de estas células se necesitan una serie se requisitos como: mujeres con historia obstétrica normal, controles serológicos negativos durante la gestación, ausencia de antecedentes médicos maternos o paternos que supongan un riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas o genéticas a través de la sangre del cordón, desarrollo normal del parto y consentimiento informado firmado por la madre. Se deben excluir partos antes de las 32 semanas, fiebre en el momento del parto mayor que 38 oC, inmunización feto-materna y signos de sufrimiento fetal. Durante el embarazo se realiza una historia clínica y se efectúan determinaciones serológicas de enfermedades infecciosas a la madre, así como cultivo de la sangre del cordón. Al nacimiento, se repiten estos exámenes, y se hace un examen minucioso del recién nacido. Los resultados serológicos, junto con el volumen, celular, estudio HLA y grupo sanguíneo, se guardan en un registro confidencial autorizando el uso terapéutico de la donación. Si no cumple las características requeridas, la sangre del cordón será desechada.
Información al donador
El primer requerimiento es informar a los donadores acerca del programa que se lleva a cabo en el BSCU del CNTS, SSA; brindando información general de la donación y la utilidad que se le da a las unidades de sangre de cordón umbilical. Adicionalmente, personal calificado del CNTS informa a los donadores, de la carta de consentimiento informado y los cuestionarios de seguridad transfusional. Los cuestionarios antes mencionados incluyen los criterios de exclusión referentes a las madres donadoras y de admisión de la unidad de sangre de cordón umbilical captada en el BSCU.
Una muestra de sangre de la madre es colectada en el momento del parto con el fin de llevar a cabo la búsqueda de patologías infecciosas.
Se recomienda la visita a la madre seis semanas después del parto con el objetivo de llevar un seguimiento tanto de la salud de la madre como la del bebé, además de informar a la madre del resultado del análisis realizado para la búsqueda de patologías infecciosas. Se llevan a cabo pruebas serológicas (del plasma de la madre) como procedimiento de validación de la unidad de SCU, también se le realizan estas pruebas al plasma de cordón umbilical:
-Aglutinación de RPR
-HIV-1/2 ELISA
-HCV ELISA
-HbsAg ELISA
La sangre de cordón umbilical es colectada únicamente por personal altamente capacitado para dicha actividad.
El sistema colector y materiales utilizados en la colecta de sangre de cordón umbilical están fabricados bajo la normatividad GMP.
Dicha colecta se realiza cuando en el parto, la placenta se encuentra todavía en el interior del útero, bajo la supervisión del obstetra.
Después de realizar la colecta, el reporte debe ser completado y seguido por el médico responsable, el cual incluye los criterios de inclusión del donador.
Criterios
De inclusión:
-La madre debe tener por lo menos 18 años de edad.
-La carta de consentimiento informado debe estar firmada.
-El parto debe ser atendido en un organismo de salud local.
Criterios de exclusión:
-Parto antes de las 34 semanas de gestación.
-Enfermedades autoinmunes en madre.
-Estrés fetal.
-Fiebre por arriba de 38°C durante el parto.
-Anemia en madre.
-Diagnóstico de patología (de acuerdo con la lista de aprobación).
-Patología autoinmune en madre.
-Padecimientos genéticos de órganos linfohematopoyéticos.
-Patologías neoplásicas en primer grado con respecto al recién nacido.
-Pruebas reactivas a HIV, HBV y HCV durante el parto.
-Anormalidades en cuenta de componentes celulares de la sangre.
Organización del banco de sangre de cordón umbilical del Centro Nacional de Transfusión Sanguínea.
El banco de sangre de cordón umbilical esta constituido por cinco unidades:
I. Unidad materna (Recolección de sangre de cordón umbilical). La sangre de cordón umbilical se colecta en unidades maternas que colaboran con el Banco de Sangre de Cordón Umbilical del Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea dentro del Programa Nacional de Sangre Placentaria, entre estas maternidades se encuentran el Hospital Juárez de México, Hospital Juárez del Centro, Hospital de la Mujer, Hospital General de México, Hospital de la Mujer de Puebla.
Para que una mujer sea candidata a donación se requiere el consentimiento informado de la madre y la historia clínica del recién nacido.
La recolección se realiza con la bolsa de recolección específica para SCU, se llena por gravedad de la vena del cordón umbilical, esta bolsa contiene citrato fosfato dextrosa (CPD), y es recolectada antes de que se alumbre la placenta. La sangre de cordón colectada es procesada en el banco de sangre de cordón umbilical de acuerdo a los estándares establecidos por NETCORD.
II. Unidad de procesamiento. La automatización de los procesos es parte fundamental de la calidad en la obtención de CPH de cordón umbilical, por esta razón se utiliza el sistema Sepax que es una sistema de procesamiento celular rápido y automatizado, de sangre o componentes sanguíneos en un ambiente estéril.
Los componentes sanguíneos son colectados en bolsas estándar, listas para el proceso de reducción, con una alta tasa de recuperación y viabilidad celular posterior al procedimiento.
El Sepax es un equipo de centrifugación celular para procesamiento de sangre con volúmenes de 20 a 200 mL, el procedimiento es en un solo paso. La cámara de centrifugación de este equipo tiene una variable que es el volumen con una capacidad hasta de 200 mL. El volumen de la cámara de centrifugación es determinado por la posición del pistón formado con el botón de la cámara de separación. El Sepax consiste de una centrífuga y un sistema neumático con capacidad de hacer vació o presión para llenar o vaciar la cámara de separación. Además un sensor óptico y un sistema de tres clavijas, las cuales controlan el flujo de sangre y la posición de las tres válvulas son parte del kit de separación, estas controlan directamente el flujo de sangre en el kit de separación. El protocolo de reducción de volumen para células madre esta diseñado para reducir el volumen del plasma de sangre de cordón umbilical y del paquete eritrocitario, lo que permite que las CPH puedan criopreservarse y almacenarse hasta que sean trasplantadas en el futuro a un paciente. El protocolo de reducción de volumen permite el procesamiento de muestras por medio de ciclos múltiples en caso necesario y así alcanzar un máximo de reducción en el volumen, con un mínimo de pérdida celular. El volumen final está en función de la concentración celular y del volumen inicial de la muestra, el cual puede ser elegido para conseguir un máximo de recuperación celular.
La utilización del hidroxi etil almidón (HES) dentro del proceso de reducción de volumen permite la rápida sedimentación de los eritrocitos y contribuye a mantener la viabilidad celular después de la criopreservación. “El protocolo de sangre de cordón umbilical permite reducción de volumen de sangre de cordón umbilical en alrededor de 20 minutos” (Ramírez, 2006, p.32).
La separación en la cámara inicia cuando es llenada con la SCU por el desplazamiento del pistón de la cámara.
Cuando toda la SCU es transferida de la bolsa a la cámara de separación todas las válvulas del kit son cerradas y la centrifugación rápida es automáticamente incrementada de 3500 rpm a 6500 rpm y mantenida por 4 minutos, después es automáticamente disminuida a 4500 rpm. En esta rápida centrifugación inicia la extracción de plasma. La SCU ahora es separada hacia plasma, buffy coat y glóbulos rojos, son bombeados fuera de la cámara de centrifugación.
Los primeros 4 mL de plasma son recolectados hacia la bolsa de glóbulos blancos para recuperar el remanente de sangre de cordón, después otros 8 mL son directamente enviados hacia la bolsa de glóbulos rojos que son limpiados con el plasma. La detección de células inicia con la recolección de buffy coat a la bolsa de recolección de glóbulos blancos cambiando la posición de las tres válvulas, mientras el pistón de la cámara de separación continúa estos movimientos de células fuera de dicha cámara.
Cuando el volumen de buffy coat es recolectado, la posición de las tres válvulas se cambia automáticamente para la extracción de glóbulos rojos en la bolsa de recolección de glóbulos rojos hasta que toda la SCU es procesada completamente. El protocolo de reducción de volumen del sistema Sepax utiliza bolsas de almacenaje especiales para sangre de cordón umbilical, las cuales tienen funciones determinadas.
III. Unidad de Criopreservación. A las unidades de sangre de cordón se les adiciona de manera lenta un volumen de DMSO. Después de la reducción de volumen se agrega lentamente 5 mL de solución crioprotectora a la suspensión celular y en continua agitación. “Las unidades son almacenadas en un tanque criogénico (Bioarchivo thermogénesis) en la fase de nitrógeno líquido” (Ramírez, 2006, p.34). El momento crítico de la criopreservación es en la “fase de transición” durante el cual, el sistema pasa de fase líquida a fase sólida. El agua de la solución libera el calor latente de fusión para transformarse en un medio sólido. Si el programa de congelación no reacciona a tiempo, el ritmo de enfriamiento disminuye la curva de descenso de temperatura se enlentece, lo que expone a las células a los efectos del elevado gradiente de presión osmótica.
Una vez iniciado el cambio de estado, el ritmo de enfriamiento debe mantenerse constante entre 1° y 2°C/min, para evitar el sobreenfriamiento de la célula.
IV. Unidad de búsqueda y gestión. Las unidades se conservan hasta que son requeridas por los centros de trasplante para pacientes con enfermedades hematológicas.
Cuando un centro de transplante requiere una unidad de sangre de cordón umbilical, solicita al BSCU del CNTS una unidad anexando un estudio de HLA del paciente. El BSCU realiza una búsqueda de unidad de acuerdo a compatibilidad de HLA. La compatibilidad de sangre de cordón umbilical es de 6 antígenos del sistema HLA (6/6), aunque se puede transplantar hasta con una compatibilidad de 4/6.
V. Banco paraleloesta constituido por:
1. Citometría de flujo: Se agrega cloruro de amonio para lisar los eritrocitos antes de la muestra por el citómetro. Posteriormente se agrega el colorante 7-amino-actinomycin D (7-AAD) para evaluar la viabilidad de las células.
2. Exámenes de laboratorio: a) cuenta celular: Las células sanguíneas son contadas con un contador celular automático (Micros 60), b) Microbiológicas: Durante el proceso de obtención de CPH, se verifica la ausencia de contaminación microbiológica y hongos en las unidades de sangre de cordón umbilical, c) Serología: Se realiza la prueba de serología de cada unidad, para descartar HIV, AgsHB, VHC, RPR y Chagas.
d) Grupo ABO y antígeno D: Se realiza la tipificación del grupo sanguíneo ABO y del antígeno D.
3. Tipificación HLA: a) Serología: estudio del fenotipo mediante anticuerpos HLA-DR3
b) Biología molecular: estudio de genotipo HLA-DRB1*03
c) HLA-A, HLA-B y DRB y DQ son determinados en la sangre de cordón placentaria.
CONCLUSIONES
Actualmente es la tercera fuente de células para trasplante en adultos y la segunda en niños. Se ha empleado en enfermedades genéticas y malignas y se ha utilizado en pacientes con compatibilidad total o parcial, familiares y no familiares.
El trasplante de células de cordón umbilical constituye una gran oportunidad para aquellos pacientes, principalmente niños, que sufren diversas enfermedades hematológicas y genéticas: leucemias linfoides y mieloides, anemia de Fanconi, anemia aplástica, síndrome de Hunter, síndrome de Wiskott-Aldrich, betatalasemias y neuroblastona. El trasplante permite conservar la vida del sujeto con un nivel aceptable de salud, reincorporarlo a su ámbito productivo y disminuir los gastos que le generan los tratamientos sustitutivos. El uso de células hematopoyéticas procedentes de cordón umbilical, es una alternativa eficaz para el tratamiento de los padecimientos antes descritos, ya que es un producto biológico fácil de obtener al momento del parto o de la cesárea, sin que se ponga en riesgo la salud de la madre o del recién nacido. El cordón umbilical es en efecto, una fuente muy rica de células progenitoras hematopoyéticas que son capaces de repoblar la médula ósea de los pacientes, ofreciendo una fuente de células sanguíneas. Además, debido a sus características inmunológicas, las células de cordón umbilical tienen menor probabilidad de generar reacciones de rechazo, que las células obtenidas de la médula ósea después del trasplante. Existen diversas ventajas y desventajas:
Las ventajas son las siguientes:
No riesgo para el donante.
Menor posibilidad de transmisión de infecciones.
Mayor posibilidad de crear un banco de células.
Aumenta la posibilidad de incluir grupos minoritarios.
Menor tiempo de búsqueda de donante.
Utilización en accidentes nucleares.
Expansión ex vivo.
Posibilidad de combinar varios donantes.
Posibilidad de utilizar donantes no totalmente compatibles.
Las desventajas son las siguientes:
Escaso número de células.
Poca factibilidad en adultos o pacientes de gran peso.
Recuperación hematopoyética más lenta.
Imposibilidad de una segunda donación en caso de fallo del implante.
Posibilidad de transmisión de enfermedades genéticas no reconocibles en el momento del nacimiento.
Se está realizando una gran cantidad de investigación sobre las células progenitoras hematopoyéticas, particularmente sobre la diferenciación de las células pluripotenciales en tipos celulares específicos que pudieran ser empleados para el tratamiento de enfermedades crónicas como el Parkinson, la diabetes, el cáncer o el infarto al miocardio, al igual que se lleva a cabo investigación sobre medicina regenerativa. No obstante, no hay ninguna evidencia científica clara que demuestre la utilidad de estas células y la posibilidad de utilizar las células obtenidas del cordón umbilical en medicina regenerativa, es actualmente puramente hipotética. Por otra parte, a pesar de los beneficios potenciales del empleo de células madre hematopoyéticas, distintos sectores sociales se han pronunciado en contra de toda investigación sobre las células madre hematopoyéticas y la transferencia nuclear.
La investigación con células madre hamatopoyéticas humanas plantea un sin número de cuestiones éticas debido al conflicto que surge entre diversos valores socioculturales y económico, entre los derechos y las obligaciones, y entre los intereses de los centros de captura de tales células. Entre los conflictos importantes, surgen: el valor de la libertad y del espíritu libre con los principios de solidaridad y justicia, de acuerdo a los cuales el acceso a los datos de los involucrados tanto en la donación como en la recepción de células madre hematopoyéticas, debe ser basada en necesidades reales. Las implicaciones éticas que corresponden a los bancos de sangre de cordón umbilical y placenta en el caso de donaciones simples para trasplantes alogénicos o para su uso en investigación son los mismos que para los bancos de tejidos, debido a que la sangre como tal es considerada un tejido.
Hay varios principios éticos y valores que pueden ser considerados relevantes en el funcionamiento correcto del uso de las células progenitoras hematopoyéticas.
El respeto a la dignidad y la integridad humanas, el cual defiende el principio de la no comercialización del cuerpo humano.
El principio de la autonomía individual, que implica el consentimiento informado del donante y el respeto de la intimidad y confidencialidad de los datos personales.
Los principios de justicia y solidaridad, como respetar el acceso a los servicios de salud.
El principio de la beneficencia, la obligación de dar un trato humano y de calidad, especialmente en el área de la salud.
El principio de no maleficencia, donde la obligación es no hacer daño, protegiendo a grupos e individuos vulnerables, para respetar la privacidad y la confidencialidad.
El principio de proporcionalidad, el cual implica un balance entre recursos y objetivos.
REFERENCIAS
1. AAP (American Academy of Pediatrics). Cord Blood Banking for Potential Future Transplantation: Subject Review. Work Group on Cord Blood Banking. Pediatrics. 1999; 104 (1): 116-118.
2. ÁVILA Coria, Ma. Guadalupe, Criopreservación de células hematopoyéticas de cordón umbilical (2003), Trabajo Monográfico, México, UNAM.
3. Banco de Sangre de Cordón Umbilical del Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea, SSA, de: http://www.salud.gob.mx/unidades/cnts/publi_cordon.htm
4. Ballen K K., et al. New trends in umbilical cord blood transplantation. Blood. 2005; 105 (10): 3786-3792.
5. Bautista-Juárez. Trasplante de células progenitoras hematopoyéticas. Cinco años de experiencia. Rev Med Inst Mex Seguro Soc. 2005; 43 (Supl 1): 123-126.
6. Calderón G, Evaluación del programa nacional de sangre placentaria CordMX: logros y expectativas. Rev Med Inst Mex Seguro Soc. 2005; 43 (Supl 1): 127-129.
7. CORTINA Rosales, Dr. Lázaro, DORTICÓS Balea, Dra. Elvira, JAIME Facundo, Dr. Juan Carlos, PAVÓN Morán, Dra. Valia, “Trasplante de células progenitoras hematopoyéticas: tipos, fuentes e indicaciones”, en Revista Cubana Hematología, Instituto de Hematología e Inmunología, 2004.
8. Emerson SG. Ex vivo expansion of hematopoietic precursors, progenitors, and stem cells: The next generation of cellular therapeutics. Blood. 1996; 87: 3082.
9. García J, Querol S., Los bancos de sangre de cordón umbilical: una nueva contribución al tratamiento de las enfermedades hematológicas. Acta Científica y Tecnológica. 2001; 3: 10-13.
10. Gluckman E, et al. Outcome of cord blood transplantation from related and unrelated donors. N Eng J Med. 1997; 337: 373-381.
11. JACIE (Joint Accreditation Committee of ISHAGE European and EBMT). Manual de acreditación para la extracción, procesado y transplante de células progenitoras hematopoyéticas; 1999.
12. Ley General de Salud. México, de: http://cenids.insp.mx/leysalud/t01-c01.htlm
13. Ley General de Salud. México. Leyes y Reformas (1997-2004), de: http://www.cddhcu.gob.mx
14. LÓPEZ Sánchez, Víctor, Hacia la inclusión de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) como un procedimiento de rutina en el Banco de Sangre de Cordón Umbilical en México (CordMX) para fortalecer la seguridad transfusional, (2006) Trabajo
monográfico, México, UNAM.
15. Mayani H, Lansdorp PM. Biology of human umbilical cord blood-derived hematopoietic stem/progenitor cells. Stem Cells. 1998; 16 (3): 153-165.
16. Miñana M, Carbonell F: SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL COMO FUENTE DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS PARA TRASPLANTE. En: Palacios J. CLONACIÓN Y TRASPLANTE. Serie Científica. Madrid 2003: 73-89.
17. National Institute of Health. Update on Existing Human Embryonic Stem Cells. 2001, de: http://www.nih.gov/news/stemcell/082701list.htm
18. NETCORD-FAHCT. International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release; 2002.
19. Official Poster of the 7th International WorKshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.prow
20. RAMÍREZ Pérez, Sandra, Estandarización de la descongelación de CPH de cordón umbilical para uso en transplante: método de dilución V/V y automatización utilizando el equipo SEPAX BioSafe (2006), Trabajo Monográfico, México, UNAM.
21. Ruiz-Argüelles GJ. Fundamentos de Hematología. Editorial Médica Panamericana. México. 1994: 16-24.
22. Sánchez V, Gómez M., Transplante de progenitores hematopoyéticos de cordón umbilical, una realidad en adultos. Rev Med Inst Mex Seguro Soc. 2005; 43 (Supl 1): 131-134.
23. The European Group of Ethics in Science and New Technologies to the European Commission. “Aspectos éticos de la investigación y el uso de células madre humanas”. Dictamen n° 15. 2003.
24. The European Group of Ethics in Science and New Technologies to the European Commission. OPINION ON THE ETHICALS ASPECTS OF UMBILICAL CORD BLOOD BANKING. Opinion n° 19. Mayo 16 de 2004.
25. Williams Hematology. Sexta Ed. Mc Graw-Hill. Medical Publishing Division. NY 2001.
26. Yin AH, Miraglia S, Zanjani ED. AC133, a Novel Marker for Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Blood. 1997; 90 (12): 5002-5012.
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