BARWIENIE DROBNOUSTROJÓW

Mała zdolność załamywania promieni świetlnych przez drobnoustroje, zwłaszcza przez bakterie sprawia, iż są one niewidoczne w zwykłym mikroskopie świetlnym. Ich oglądanie jest możliwe dopiero po wybarwieniu. Wyróżniamy następujące sposoby barwienia bakterii:

• Barwienie pozytywne- polega na zabarwieniu w preparacie komórek drobnoustrojów; obserwujemy wybarwiony obiekt, np. bakterie, drożdże, grzyby strzępkowe, na jasnym tle.

• Barwienie negatywne- opiera się na uwidocznieniu otoczenia, nie zaś obiektu; obserwujemy jasne, niewybarwione komórki drobnoustrojów na ciemnym tle.

• Barwienie proste- polega na barwieniu preparatu tylko jednym barwnikiem, np. błękitem metylenowym albo fuksyną.

• Barwienie złożone- polega na barwieniu preparatu kilkoma barwnikami wg ściśle określonej kolejności lub znajdujących się w mieszaninie, np. metoda Grama, metoda Neissera

• Barwienie przyżyciowe- kiedy działamy na nieutrwalony preparat żywych drobnoustrojów barwnikiem dużym rozcieńczeniu, nie niszcząc komórek, np. wybarwianie drożdży i grzybów nitkowatych oraz promieniowców błękitem metylenowym w rozcieńczeniu 1: 10000.

BARWNIKI STOSOWANE W BARWIENIU DROBNOUSTROJÓW

Barwniki są to związki chemiczne, zdolne do adsorbowania się na lub rozpuszczania się w barwionych substancjach, dając trwałe, barwne połączenia. Pod względem chemicznym barwniki dzielimy na:

-kwaśne, np. eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna

-zasadowe, np. błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczkowy, fuksyna zasadowa

U podstaw barwienia leżą następujące rodzaje reakcji barwnika z substratem: wytworzenie soli, powstanie wiązania kowalencyjnego, wiązania za pomocą sił fizycznych, wiązania chemiczne.

Ponieważ powierzchnie komórek bakterii, a także ich kwasy nukleinowe naładowane są ujemnie, w bakteriologii najczęściej stosuje się barwniki zasadowe w roztworach alkoholowych lub kwaśnych. Barwniki kwaśne są często używane do wybarwiania tła preparatu.

BARWIENIE METODĄ GRAMA

Jest przykładem barwienia złożonego, różnicującego, którego zastosowanie w praktyce doprowadziło do podziału wszystkich bakterii na Gram- dodatnie i Gram- ujemne, różniące się budową ściany komórkowej, a także wieloma cechami fizjologicznymi i biochemicznymi oraz właściwościami biologicznymi. Metoda ta ma podstawowe znaczenie taksonomiczne i diagnostyczne. Zespół czynności składających się na to barwienie obejmuje: wykonanie rozmazu zawiesiny drobnoustrojów lub hodowli, utrwalenie go w płomieniu palnika oraz barwienie:

• roztworem fioletu krystalicznego (2- 3 minuty)

• utrwalanie płynem Lugola (1,5- 2 minuty)

• odbarwienie etanolem (30 sekund)

• dobarwienie barwnikiem kontrastowym (najczęściej stosowane to fuksyna karbolowa lub safranina, 20 sekund)

Wszystkie etapy barwienia przedziela spłukiwanie preparatu wodą destylowaną.

Drobnoustroje, które zatrzymają barwnik podstawowy, tj. fiolet krystaliczny i przyjmują zabarwienie fioletowe, noszą nazwę drobnoustrojów Gram- dodatnich.

Drobnoustroje Gram- ujemne to takie, które po zabarwieniu pozostają różowe, tzn. zatrzymują barwnik kontrastowy.

Wykazano, iż w wyniku działania fioletu krystalicznego i płynu Lugola powstaje w komórce kompleks tego barwnika z jodem (jod zastępuje w cząsteczce barwnika atomy chloru), usuwany w wyniku ekstrakcji alkoholem etylowym z bakterii Gram- ujemnych, pozostający zaś w komórkach bakterii Gram- dodatnich. Kluczowe znaczenie w tym typie barwienia ma działanie alkoholu na komórki bakterii o różnej budowie ściany komórkowej.

U bakterii Gram-dodatnich jest ona zbudowana z wielu warstw paptydoglikanu, który odwodniony działaniem etanolu zostaje uszczelniony. Alkohol działając na wiele warstw peptydoglikanu u tych bakterii powoduje wytrącanie jego szkieletu cukrowego oraz denaturację tetra- (penta) -peptydów i mostków peptydowych. Wynik tego działania to trwałe zamknięcie się porów pomiędzy poszczególnymi warstwami mureiny i w następstwie tego zatrzymanie kompleksu jodu z fioletem krystalicznym w komórce.

U bakterii Gram-ujemnych stwierdzono obecność jednej, a w niektórych miejscach komórki do trzech warstw peptydoglikanu. Potraktowanie etanolem tak cienkiej warstwy mureiny powoduje zniszczenie zewnętrznej warstwy plastycznej ściany komórkowej i wypłukania kompleksu. Po potraktowaniu fuksyną barwi się na różowo.

MORFOLOGIA MIKROSKOPOWA I CYTOLOGIA BAKTERII

Bakterie stanowią główną grupę drobnoustrojów tworzących Królestwo Prokaryota.

Królestwo	Dział	Klasa	Nazwa opisowa
Prokaryota	Gracilicutes	Scotobacteriae Anoxyphotobacteriae Oxyphotobacteriae	Beztlenowe bakterie zależne od światła. Tlenowe bakterie zależne od światła.
		Firmicutes	Firmibacteriae Thallobacteriae	Proste bakterie Gram- dodatnie. Rozgałęzione bakterie Gram-ujemne.
		Tenericutes Mendosicutes	Mollicutes Archeabacteriae	Bakterie bez ściany komórkowej. Bakterie bez peptydoglikanu

MORFOLOGIA MIKROSKOPOWA BAKTERII

Podstawowe kształty bakterii to kształt: kulisty, cylindryczny i spiralny. Bakterie dzieląc się zachowują symetrię względem osi podłużnej lub poprzecznej, co warunkuje tworzenie przez nie ugrupowań.

Wśród bakterii KULISTYCH- ziarniaków (cocci) wyróżniamy:

1. Formę pojedynczą- Micrococcus,

2. Formę podwójną- Diplococcus (dwoinka), np.

-Diplococcus pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc)

3. Formę poczwórną- Tetracoccus (czwórniak, ziarniak czworaczy),

4. Paciorkowce- Streptococcus, np.

-Streptococcus pyogenes (paciorkowiec ropotwórczy)

5. Gronkowce- Staphylococcus, np.

-Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty)

6. Pakietowce- Sarcina sp. (sześcianki)

Większość ziarenkowców to bakterie Gram- dodatnie.

Wśród form CYLINDRYCZNYCH bakterii występują:

1. Pałeczki- Bacterium, np.

-Eserichia coli (pałeczka okrężnicy),

-Salmonella typhi (pałeczka duru brzusznego),

-Shigella sonnei (pałeczka czerwonki),

-Proteus mirabilis (pałeczka odmieńca),

- Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej)

2. Laseczki- Bacillus

3. Maczugowce- Corynebacteriu, np.

-Corynebacterium diphteriae (maczugowiec błonnicy)

4. Wrzecionowce- Fusobacterium

5. Prątki- Mycobacterium, np.

-Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy)

-Mycobacterium leprae (prątek trądu)

Większość pałeczek jest Gram- ujemna.

Laseczki są formami Gram- dodatnimi. Ich charakterystyczną cechą jest wytwarzanie endospor.

Formy cylindryczne mogą tworzyć układy przestrzenne: łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y.

Formy SPIRALNE bakterii stanowią:

1. Przecinkowce- Vibrio, np.

-Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery)

2. Śrubowce- Spirillum, np.

-Rhodospirillum rubrum (bakteria fotosyntetyzująca)

3. Krętki- Spirochetae, Borrellia, Treponema np.

-Treponema pallidum (krętek blady, zarazek kiły)

Inne formy bakterii:

1. Bakterie nitkowate- Chlamydobacteriales

2. Bakterie styliskowe- Caulobacteriales

3. Bakterie z wyrostkami- Hyphomicrobium

4. Bakterie pączkujące i tworzące wyrostki- Rhodomicrobium vannielii

CYTOLOGIA BAKTERII

ŚCIANA KOMÓRKOWA BAKTERII

Ściana komórkowa wraz z błoną plazmatyczną stanowi ok. 25% masy bakterii. Jest ona sztywna, ale porowata, nadaje kształt komórce, stanowi również warstwę zewnętrzną o znaczeniu ochronnym. U bakterii pozbawionych otoczek ściana komórkowa styka się bezpośrednio ze środowiskiem zewnętrznym, niektóre z jej struktur pełnią rolę receptorów dla bakteriofagów lub antygenów stymulujących makroorganizm do wytwarzania swoistych przeciwciał.

Peptydoglikan
Synonimy: mureina, glikopeptyd, mukopeptyd, muropeptyd. Stanowi tzw. warstwę sztywną ściany komórkowej bakterii. Jego głównymi składnikami są N- acetyloglukozamina i kwas N- acetylomuraminowy, połączone są wiązaniem glikozydowym β1,4.

Peptydoglikan pełni szereg ważnych funkcji w komórce:

• chroni bakterie przed skutkami zmian ciśnienia osmotycznego środowiska, czynnikami fizykochemicznymi i urazami mechanicznymi.

• spełnia rolę sita molekularnego, wykazując przy tym zdolność wiązania kationów metali ciężkich oraz jonów Mg²⁺, stabilizujących strukturę komórek bakteryjnych.

• otacza szczelnie komórkę tworząc rodzaj woreczka warunkującego kształt bakterii.

Ściana komórkowa bakterii Gram- dodatnich.

Jej warstwę sztywną stanowi peptydoglikan, zaś warstwę plastyczną kilka rodzajów heteropoimerów kwasów:

• teichojowych (nadają swoistość immunologiczną, wykazują zdolność do modulacji odpowiedzi immunologicznej, aktywują makrofagi),

• lipoteichojowych (wraz z kwasami teichojowymi biorą udział w wymianie jonowej, pobudzają litogenezę limfocytów, pośredniczą w adhezji bakterii do komórek eukariotycznych),

• teichuronowych

W ścianie komórkowej bakterii obecne są również białka, np. białko A, białko M, białko G.

Ściana komórkowa bakterii Gram- ujemnych.

Dominującą część bakterii Gram- ujemnych stanowi warstwa plastyczna, którą tworzy błona zewnętrzna (OM- outer membrane), składająca się z fosfolipidów, białek, lipoproteidu Brauna, lipopolisacharydu (LPS) oraz antygenu wspólnego. W ścianie komórkowej bakterii Gram- ujemnych występuje od jednej do trzech warstw mureiny, który oddziela od warstwy plastycznej tzw. przestrzeń pery plazmatyczna.

Fosfolipidy

Tworzą wraz z białkami i lipopolisacharydem zrąb błony zewnętrznej. Występują wśród nich fosfatydyloglicerol, kardiolipina oraz jako składnik dominujący fosfatydyloetanolamina. Błona zewnętrzna wykazuje zjawisko zmiany fazy (tranzycji)- w temperaturze fizjologicznej (optymalnej) jest płynna lub prawie płynna, a w temperaturze niższej przechodzi w fazę stałą. Błona zewnętrzna stanowi barierę przepuszczalności dla wielu substancji o charakterze hydrofobowym.

Białka błony zewnętrznej

Podzielono je na dwie grupy, tzw. białka główne (I-rzędowe) i białka poboczne (II-rzędowe). Z punktu widzenia roli jaką pełnią, wyróżniamy białka strukturalne (matrycowe) występujące w całej objętości błony zewnętrznej i białka funkcjonalne związane z transportem komórkowym- tzw. białka tworzące kanały dyfuzyjne (białka porynowe, poryny). W błonie zewnętrznej obecne są również enzymy, np. fosfolipaza A, hydrolaza UDP-glukozy, proteazy, lipazy i nukleazy oraz oksydazy.

Najbardziej znanymi białkami strukturalnymi są białko OmpA (znane również jako białko śródbłonowe, transbłonowe) oraz lipoproteina Brauna (także jest białkiem transbłonowym, ale nie penetruje całej błony zewnętrznej, tkwiąc w jej części wewnętrznej; większa jego część występuje w peryplazmie).

Białka porynowe dzielimy na dwie grupy:

• poryny ogólnej dyfuzji, które najczęściej są związane z mureiną (poryny nieswoistej dyfuzji), np. białko OmpF, OmpC. Poryny te tworzą kanały o średnicy 1,08 nm i 1,16 nm umożliwiając transport substancji hydrofilnych, kationów oraz związków nienaładowanych.

• poryny swoiste- powstają w wyniku indukcji wywołanej obecnością substratu.

Lipopolisacharyd- LPS

Stanowi najważniejszy pod względem funkcji biologicznej składnik błony zewnętrznej bakterii Gram- ujemnych i składa się z trzech różniących się pod względem budowy chemicznej oraz funkcji biologicznej regionów: części O-swoistej, rdzenia oraz lipidu A.

Część O- swoistą tworzą powtarzające się podjednostki oligosacharydowe.

Region rdzeniowy charakteryzuje się mniejszym w porównaniu z częścią O-swoistą, zróżnicowaniem struktury chemicznej. Region ten składa się z części heksozowej, heptozowej i regionu Kdo (kwas 2-keto-3-deoksyoktonowy).

Lipid A- zawiera disacharyd glukozaminylowy podstawiony kwasami tłuszczowymi oraz resztami fosforanu, a także innymi podstawnikami.

Liposacharyd jest zlokalizowany w zewnętrznej warstwie błony zewnętrznej, natomiast fosfolipidy występują przede wszystkim w warstwie głębokiej błony co czyni ją asymetryczną.

ECA - Antygen Kunina

Występujący również w błonie zewnętrznej przypomina do pewnego stopnia budowę chemiczną LPS. Jak wykazano może on występować w trzech formach: wolnej, związanej z LPS i cyklicznej.

Znaczenie ECA dla bakterii, jak również jego funkcje biologiczne nie są w pełni wyjaśnione. Wydaje się, że antygen ten wiąże jony Ca²⁺, a także może mieć udział w patogenezie.

Przestrzeń pery plazmatyczna

Obejmuje obszar między błoną cytoplazmatyczną bakterii Gram- ujemnych. Znajduje się w niej od jednej do trzech warstw peptydoglikanu, przy czym mureina trójwarstwowa występuje najprawdopodobniej na biegunach komórek. Przestrzenie pomiędzy cząsteczkami peptydoglikanu wypełniają białka oraz oligosacharydy, całość zaś ma charakter żelu. Białka występujące w przestrzeni peryplazmatycznej dzielimy na trzy grupy:

1. Białka unieczynniające antybiotyki β-laktamowe (np. penicylinę) i aminoglikozydowe (np. streptomycynę)

2. Enzymy degradujące polimery związków chemicznych o znaczeniu biologicznym (nukleazy, α-amylaza)

3. Białka wiążące (BP- Binding proteins) aminokwasy,cukry, peptydy, witaminy oraz jony.

W przestrzeni peryplazmatycznej obecne są także oligosacharydy błono pochodne. Zawierają one obok glukozy, glicerolo-1- fosforan. Składniki te zapewne stanowią barierę ochronną na wypadek zmian ciśnienia osmotycznego w środowisku wzrostu.

BŁONA CYTOPLAZMATYCZNA

Wykazuje typową dla wszystkich błon naturalnych strukturę trójwarstwową i jest zbudowana z białek (50-75%) i lipidów (20-35%). Wzajemny stosunek białek do lipidów w błonie komórkowej zależy nie tylko od gatunku bakterii, ale także od fazy wzrostu hodowli. Cechą charakterystyczną błony plazmatycznej bakterii w porównaniu do organizmów eukariotycznych jest brak cholesterolu oraz wyjątkowa obecność choliny. Wśród fosfolipidów występuje przede wszystkim fosfatydyloglicerol, difosfatydyloglicerol, fosfatydyloinozytol oraz fosfatydyloetanolamina. Mono- i difosfatydyloglicerol przeważa w membranie bakterii Gram- dodatnich, podczas gdy fosfatydyloetanolamina u bakterii Gram- ujemnych.

W błonie cytoplazmatycznej wyróżnia się dwie strony- jedną zwróconą ku cytoplazmie (strona cytoplazmatyczna wewnętrzna -P) oraz drugą zwróconą ku ścianie komórkowej lub środowisku zewnętrznemu (strona zewnętrzna -E).

Ze względu na usytuowanie białek w stosunku do podwójnej warstwy lipidowej oraz stron E lub P błony wyróżniamy:

1) białka powierzchniowe (peryferyjne, zasocjowane na zewnątrz błony),

2) białka integralne (zagłębione przynajmniej częściowy w hydrofobowym wnętrzu błony), które dzielimy na endobiałka (dostępne od strony P) oraz ektobiałka (wyeksponowane od strony E),

3) białka poprzeczne (penetrujące obie warstwy fosfolipidów oraz występujące z obu stron błony).

Funkcje błony cytoplazmatycznej:

1. Transport pierwiastków, substancji odżywczych oraz metabolitów

2. Stanowi barierę półprzepuszczalności, a transport przez nią charakteryzuje się dużą wybiórczością.

3. Jest to miejsce wielu reakcji enzymatycznych m.in. syntezy i hydrolizy ATP i cAMP

4. Zachodzą tu procesy fosforylacji oksydacyjnej oraz fotofosforylacji;

Strona | 6

---