19.03.2009 r.

Ćwiczenie 5

Temat: Monitorowanie skutków skażeń chemicznych.

1. Prelekcja wstępna.

2. Test strukturalnych aberracji chromosomowych - technika wykonywania.

3. Test mikrojądrowy - technika wykonywania.

4. Test wymian chromatyd siostrzanych (SCE) - technika wykonywania.

5. Oglądanie preparatów mikroskopowych wyżej wymienionych testów.

6. Test bakteryjny Amesa.

Mutagen - czynnik wywołujący mutacje.

Kancerogen - czynnik powodujący proces nowotworzenia.

Test strukturalnych aberracji chromosomowych - metoda stosowana do wykrywania mutagenów i kancerogenów, wykorzystuje właściwości klastogenne (łamanie chromosomów) związków badanych.

Można go wykonywać in vivo (np. na zwierzętach) lub in vitro (np. komórki izolowane krwi z substancją badaną).

Materiał do badań:

limfocyty krwi obwodowej, fibroblasty, trofoblasty, komórki płynu owodniowego. Hodowle zakłada się wg typowego przepisu, trwanie 48 h.

Pod mikroskopem oglądamy 100 metafaz (liczba chromosomów, rodzaj aberracji).

Kryteria mutagenności związku:

znamienny statystycznie wzrost częstości aberracji w próbie badanej w porównaniu z hodowlą kontrolną.

Należy wykonać po dwie próby dla 3 różnych stężeń związku (ale stężenie nie może być letalne) oraz pozostawić jedną hodowlę kontrolną.

Aberracje:

1. chromosomowe

Wywoływane głównie przez mutageny fizyczne np. promieniowanie jonizujące. Uszkodzenia dotyczą obu chromatyd. Mutageny działają w fazie G1 lub G0. Są to aberracje prereplikacyjne.

• wymiany międzychromosomowe (np. chromosomy dicentryczne, figury wymian)

• wymiany wewnątrzchromosomowe (np. chromosomy pierścieniowe, fragmenty acentryczne)

• złamania

• przerwy

2. chromatynowe

Mutagen działa w późnej fazie S lub fazie G2. Są to aberracje postreplikacyjne.

• złamania (np. delecje terminalne chromatyd)

• przerwy

• minucje (fragmenty minutowe)

Test wymiany chromatyd siostrzanych (SCE - sister chromatyde exchange)

Hodowla trwa 72 h (2 cykle replikacyjne) z dodatkiem BrDU (analog tymidyny).

Test służy do oceny związków chemicznych podejrzanych o kancerogenność lub mutagenność oraz oceny skutków ekspozycji na mutagen.

Metoda opiera się na modelu semikonserwatywnej replikacji.

BrDU zmniejsza powinowactwo DNA do barwników.

Wymiany obejmują pękanie obu nici DNA w obu chromatydach tego samego chromosomu i wymianę całych fragmentów chromatyd.

Analizujemy od 50-100 metafaz (w mitozie drugiego cyklu replikacyjnego). Liczymy punkty pęknięć. Możemy test przeprowadzać w warunkach in vivo oraz in vitro.

Czynniki mutagenne: alkilujące, promieniowanie UV.

Test mikrojądrowy (MN) - standardowa metoda wczesnego wykrywania narażenia na czynniki mutagenne. Wykrywa skutki działania czynników genotoksycznych, chemicznych i fizycznych powodujących złamania chromosomu oraz uszkodzenia wrzeciona podziałowego (chromosom nieodciągnięty wytwarza mikrojądro, mogą się one tworzyć również z fragmentów acentrycznych).

Oceniamy komórki dwujądrzaste w interfazie.

Hodowla trwa 72 h a 28 godzin przed końcem dodajemy halazynę B - inhibitor cytokinezy. Możemy test wykonać in vivo oraz in vitro.

Materiał in vivo: erytrocyty polichromatyczne.

Materiał in vitro: limfocyty krwi obwodowej.

Analizujemy 500-1000 komórek dwujądrzastych w interfazie.

Test bakteryjny Amesa - nie jest to test cytogenetyczny. Jest to test płytkowy, w którym wykorzystuje się odpowiednio skonstruowane szczepy Salmonella typhimorium, które zawierają mutację w operonie histydyny (mutanty o fenotypie his - ). Mutanty te straciły zdolność do syntezy histydyny i nie mogą rosnąć na pożywce minimalnej pozbawionej histydyny. Zdolność do wzrostu na pożywce bez histydyny może przywrócić bakteriom mutacja powrotna (rewersja) do form o fenotypie his + . W teście Amesa określa się więc zdolność do wywołania przez badaną substancję chemiczną mutacji powrotnej.

Test ten wykonuje się wysiewając mutanty Salmonella typhimorium na podłoże agarowe, które zawiera śladowe ilości histydyny. Po jej wyczerpaniu zdolne do podziałów i tworzenia kolonii są tylko komórki, w których wystąpiła rewersja z fenotypu his - na his +.

Hodowla trwa 48-72 h. Następnie zlicza się liczbę hodowli rewertantów i porównuje z liczbą kolonii rewertantów spontanicznych (jest to hodowla kontrolna bez badanego związku). Jeżeli związek nie jest mutagenem to liczba kolonii rewertantów jest minimalna, a jeżeli jest mutagenem, liczba ta wzrasta i kolonie są skupione w rejonie podłoża, w którym jest substancja badana.

Kryterium właściwości mutagennych badanej substancji chemicznej jest minimum 2-krotny wzrost liczby kolonii rewertantów do liczby kolonii na płytkach kontrolnych. Test ten jest bardzo skuteczny w wykrywaniu rakotwórczych substancji chemicznych o właściwościach mutagennych oraz prekancerogenów i związków z zastosowaniem w medycynie, jako leki.

B B

T B

T B

T T

---