Wrocław 19.04.2011

Zuzanna Mazur

Pon. godz 17.05

Dr inż. Marek Orłowski

Sprawozdanie z ćw. 6

Identyfikacja dansylowanych aminokwasów metodą cienkowarstwowej chromatografii na płytkach poliamidowych.

Cel doświadczenia: zapoznanie się z metodami identyfikacji dansylowanych aminokwasów.

Przy wykonywaniu ćwiczenia wykorzystano:

• odczynniki

• preparaty dansylowanych aminokwasów (Pro,Arg,Gly) i peptydu przygotowanych podczas poprzednich zajęć

• pirydyna

• roztwory do rozwijania chromatogramów:

a) układ 1: octan etylu - etanol - amoniak (v/v=20:5:1)

b) układ 2: n-propanol - chloroform - 99.7% kwas octowy (v/v = 80:20:5)

• szkło i aparatura

• płytki chromatograficzne

• cylindry miarowe

• kapilary szklane ad 2μl

• probówki eppendorfa

• suszarka

• aparat do chromatografii cienkowarstwowej

• lampa UV

• pipety automatyczne

• rękawiczki ochronne

Przebieg doświadczenia:

Przygotowano płytki poliamidowe ostrożnie oznaczając ołówkiem w prawym dolnym rogu, 1cm od krawędzi, punkty „x” dla płytki przeznaczonej dla peptydu oraz „o” na płytce dla aminokwasów. Pobrano aminokwasy standardowe z ampułek i umieszczono (po 50μl) na dnie próbówki eppendorfa. Otworzono ampułkę z peptydem i dodano 10 μl pirydyny, rozpuszczając peptyd. Nanoszono kilkakrotnie (ok. 6 powtórzeń) roztwór peptydu po 1 kropli na oznaczony punkt. Za każdym razem suszono płytkę przed kolejnym nałożeniem roztworu peptydu. Tę samą czynność powtórzono dla aminokwasów. Przygotowane płytki ustawiono w statywie aparatu do chromatografii cienkowarstwowej. Do kuwety z pierwszym układem chromatograficznym (50ml) włożono statyw. Płytki równoważono w oparach przez 15 min, następnie zanurzono je w roztworze. Po ok. 10 min kiedy rozpuszczalnik przeszedł przez płytki, wysuszono je. Obrócony o 90 ^o statyw ustawiono w oparach drugiego układu chromatograficznego. Po równoważeniu opuszczono statyw i obserwowano przechodzenie rozpuszczalnika przez płytki. Po wysuszeniu odczytano wyniki chromatografii umieszczając płytki pod lampą UV przy długości fali λ=365nm.

Wynik ćwiczenia, obserwacje i wnioski:

1
2

1. płytka z aminokwasami (odnośnik w doświadczeniu: Arg, Pro, Gly)

2. płytka z peptydem

Piki peptydu pochodzą od Gly. Gly jest N-końcowym aminokwasem peptydu.

3

DNS

Gly

Pro

Arg

DNS

Gly

Układ 1

Układ 2

---